酶组织化学
免疫组织化学
免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学引言酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。
酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。
它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。
研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。
后者也被称之为免疫组织化学。
免疫组织化学概述免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。
这种技术称为免疫组织化学技术。
免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。
抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。
它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。
要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。
直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。
间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
免疫组织化学检验技术—酶免疫组织化学检验技术(免疫学检验课件)
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物
（三）方法评价
三、非标记抗体酶免疫组化染色法
（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特
异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结 合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2） 作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与 结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc 段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对 抗原的检测。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立
的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP） 法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
（三）方法评价
该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于 酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗 体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的 缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥 PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原 的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连 接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP
3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体
和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比 PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏 感性。
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原的共价键作用将酶直接连接在抗体 （或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体） 与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应 后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶 性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗 原定性、定位、定量检测的目的。
酶组织化学概论
2、方法：三种 、方法：
和高松（ （1）第一种方法：Gomori和高松（1939） ）第一种方法： 和高松 ）
Fe 置换
E
M
Байду номын сангаас
+
沉着在作 用局部 显色
S
+
酶反应
P1 P2
证明酶反应
13
如：证明碱性磷酸酶方法
金属置换 R-PO4Na2+H2O
ALP
Ca2+
R-OH+CaHPO4 沉着
Co2+
CoHPO4
三、光镜酶组织化学证明法 （三）色素形成法（pigment formation method) 这是一组显示酶定位的证明法，它与偶氮色素 这是一组显示酶定位的证明法， 显示酶定位的证明法 法不同，在酶的作用下， 法不同，在酶的作用下，使无色的化学物质在局部 形成色素而沉着。这种方法统称色素形成法 色素形成法。 形成色素而沉着。这种方法统称色素形成法。 方法 所显示的酶 1、四唑盐法 脱氢酶 2、靛酚蓝法 氧化酶 3、靛兰形成法（靛蓝法） 磷酸酶、酯酶 靛兰形成法（靛蓝法） 磷酸酶、 4、联苯胺色素法 5、黑色素形成法 6、白色色素法 过氧化物酶 DOPA-氧化酶、酪氨酸酶 氧化酶、 氧化酶 22 过氧化氢酶
16
3、金属 金属盐法的优缺点 、金属-金属盐法的优缺点
（1）优点： ）优点： ①底物、捕捉剂价格便宜。 底物、捕捉剂价格便宜。 金属离子容易反应， ②金属离子容易反应， 沉着颗粒微细， 沉着颗粒微细，反应色调 鲜明，反差比较明显。 鲜明，反差比较明显。 缺点： （2）缺点： ①易退色。 易退色。 组织细胞中有些成分可吸附金属离子， ②组织细胞中有些成分可吸附金属离子，产生 假阳性反应。 假阳性反应。
病理学技术-酶组织细胞化学技术
Gomori醋酸-α-萘酯固蓝-B盐法
紫黑色
对氯汞苯甲酸（PCMB）和二乙基对硝苯磷酸盐（E600）
定位于内质网和溶酶体
Mueller-Ranki萘酯-六偶氮对品红法
棕红色或深红色
R-谷氨酰基转移酶
Lojda萘酰胺法
棕黄色或棕色
硫酸铜
琥珀酸脱氢酶
Nachlas硝基蓝四唑法
蓝紫色
Ogawa-Barnett法
正常肝定位于毛细胆管
Dubowitz-Brooke钙激活酶法
黑色
区分红肌纤维和白肌纤维
胆碱酯酶
Snell-Garrett胆碱铜法
棕色或黄棕色
胆碱酯酶染色，分布于血浆、胰腺和唾液腺
Karnovsky-Roots铁氰化铜法
红棕色至深棕色
四异丙基焦磷酰胺（ISO-OMPA）0.137%
乙酰胆碱酯酶染色，分布于神经组织
酶组织细胞化学技术
酶
染色法
结果颜色
激活物
对照方法（抑制物）
注意
碱性磷酸酶
Gomori钙钴法
黑色
金属阳离子
空白对照；热水处理
1、可石蜡切片
2、含铁血黄素与钙盐可出现假阳性
3、不纯的二甲苯对硫化钴有分解作用
Gossrau偶氮吲哚酚法
坚牢蓝VB-暗褐色，BB-浅红色，紫B-蓝色
不同坚牢蓝色号和坚牢紫
酸性磷酸酶
Berry硝酸铅法
棕黑色颗粒
空白对ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ；氟化钠
前列腺含量最高，肝内毛细胆管旁活性最强
Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法
红色
热水处理与氟化钠
三磷酸腺苷酶
Wachstein-Mersel镁激活酶法
生物化学第三章酶化学
通式：AH2+B→BH2+A
系统命名可分为19亚类，习惯上可分为4个亚类： (1)脱氢酶：受体为NAD或NADP，不需氧。
(2)氧化酶：以分子氧为受体，产物可为水或H2O2，常需黄素辅基。
(3)过氧化物酶：以H2O2为受体，常以黄素、血红素为辅基。 (4)氧合酶（加氧酶）：催化氧原子掺入有机分子，又称羟化酶。按
His 活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195
Asp
3 活性中心的研究方法 1.酶分子侧链基团修饰法 (1)非共价特异修饰法： (2)特异性共价修饰法 (3)亲和标记法
2.动力学参数测定方法 3.X－射线晶体结构分析法 4.定点诱变法
二 酶原及酶原的激活 没有催化活性的酶的前体称为酶原（zymogen）。
V max 初 速 度 v c b 1/2 V max
a
0
Km
[S]
图5-14 底物 浓度对 酶促反 应速度 的影响
酶促反应速度V与底物浓度[S]的关系
（二）Michaelis-Menten方程和米氏常数
米氏方程式推导来源于中间产物学说 解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系的最合理的
学说是中间产物学说。该学说认为酶促反应形成酶－
通式： AB→A+B
包括醛缩酶、水化酶、脱羧酶等。共7个亚 类。
5、异构酶类 催化同分异构体之间的相互转化。
通式：A→B
其中：A、B为同分异构
包括消旋酶、异构酶、变位酶等。共6个亚 类。
6、合成酶类 催化由两种物质合成一种物质，必须与ATP 分解相偶联。也叫连接酶，如DNA连接酶。
通式：A+B+ATP→AB+ADP+Pi 或 A+B→AB+AMP+PPi
酶组织化学技术
第二章酶组织化学技术酶（enzyme）是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质，在细胞的各个部位都有酶的存在。
人和动物体内的各种化学反应（包括新陈代谢反应）都必须由酶来催化，没有酶的存在，体内生物化学反应就无法进行。
组织及细胞中含有多种酶类，主要包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、ATP酶、非特异性酯酶、胆碱酯酶、琥珀酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶等。
组织细胞内的各种酶均不具有使其本身直接可见性的特性，常需用某些方法在一定条件下将组织细胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解产物作为反应物质，在原作用部位进行捕捉反应，从而使其具有可见性。
这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应来显示细胞和组织结构中的各种酶，并对其进行定性、定位、定量的方法称为酶组织化学反应。
酶组织化学技术在人类认识疾病的科学实践中曾非常活跃，50~60年代在病理学上的应用达到高峰。
它所涉及的内容相当广泛，如利用酶组织化学方法研究生物体内细胞形态与其代谢、功能的关系；在病理学领域中，研究疾病发生、发展的代谢基础；肿瘤的诊断及鉴别诊断；肿瘤的代谢功能及形态与酶组织化学的变化规律；以多种酶组织化学指标显示细胞损害程度，从而检测新药物及其临床毒性等。
但由于酶组织化学技术操作较复杂，需用新鲜组材料，且多数反应特异性不高，故其应用受到限制。
同时因酶为蛋白质，它在福尔马林固定及石蜡包埋的组织中虽然失去了酶活性，但仍具有免疫原性，这使得应用较为特异的免疫组织化学方法显示酶成为可能，因而不少酶组织化学染色现已被免疫组织化学技术所代替。
但应指出的是，有一些酶组织化学方法仍以其良好的特异性在病理诊断及研究领域被广泛应用。
目前最常应用于诊断的酶组织化学方法有骨骼肌相关酶（用于诊断肌病）、乙酰胆碱酯酶（用于诊断先天性巨结肠）、氯乙酸酯酶（用于辨认骨髓髓细胞系统的细胞和肥大细胞）以及酸性磷酸酶等染色方法。
第一节酶组织化学反应的方法和基本原理一、酶组织化学反应的主要方法和基本原理1．金属沉淀反应法酶的分解产物可与大多数金属结合，金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物均具有颜色，因此，在酶反应时使其与金属结合，利用其呈色反应，显示出酶反应的部位，间接地证明某种酶的存在。
酶组织化学染色诊断-概述说明以及解释
酶组织化学染色诊断-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：酶组织化学染色是一种用来检测组织中特定酶活性的技术手段。
通过这种方法，可以直观地观察组织中的酶分布和活性水平，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
酶组织化学染色技术已经在医学领域得到广泛应用，例如肿瘤诊断、炎症检测等。
本文将介绍酶组织化学染色的原理、应用和优势，旨在帮助读者更好地了解和运用这一重要的诊断工具。
1.2 文章结构文章结构部分主要是指出本文的组织结构和内容安排。
首先，我们将介绍酶组织化学染色的基本原理，包括染色的方法和操作步骤。
然后，我们将探讨酶组织化学染色在医学诊断中的应用，包括疾病诊断和治疗效果监测等方面。
接着，我们将分析酶组织化学染色相比传统染色方法的优势和不足之处。
最后，我们将总结本文的主要内容，展望酶组织化学染色在未来的发展方向，并提出一些思考和建议。
通过这样的结构，读者可以清晰地了解本文的主要内容和观点，有助于更好地理解和评价酶组织化学染色在临床诊断中的应用。
1.3 目的酶组织化学染色作为一种重要的病理分析技术，在临床诊断、研究和治疗中起着至关重要的作用。
本文旨在深入探讨酶组织化学染色的原理、应用和优势，以帮助读者更好地了解这一技术的价值和意义。
通过系统性的介绍和分析，希望能够为医学和科研工作者提供更丰富的知识和实践经验，从而推动该领域的进一步发展和应用，为疾病的早期诊断和精准治疗提供更有效的支持和指导。
同时，也希望通过本文的阐述，引起更多学者和医生对酶组织化学染色技术的关注和重视，为医学科研领域的进步和人类健康事业的发展作出贡献。
2.正文2.1 酶组织化学染色的原理:酶组织化学染色是一种通过酶的催化作用来检测组织中特定分子的方法。
在这种方法中，首先需要选择适当的酶作为标记物，常用的酶包括过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
然后将标记的抗体与待检测的抗原特异结合，形成抗原-抗体复合物。
接着，加入对应的底物，酶会催化底物的化学反应，产生可见的染色产物。
免疫组织化学酶标法
免疫组织化学酶标法
免疫组织化学酶标法是一种常用的免疫组织化学技术，用于检测
组织或细胞中的特定蛋白质或抗原。
该方法利用酶标记的抗体与组织
或细胞中的抗原结合，然后通过酶促反应产生可检测的信号。
免疫组织化学酶标法的基本步骤包括：
1. 组织或细胞的制备：将组织或细胞固定在载玻片上，并进行切
片或细胞涂片。
2. 抗原的暴露：通过抗原修复或抗原暴露技术，使抗原在组织或
细胞中暴露出来。
3. 抗体孵育：将酶标记的特异性抗体与组织或细胞孵育，使抗体
与抗原结合。
4. 信号检测：通过酶促反应产生可检测的信号，例如颜色变化或
荧光信号。
5. 结果分析：通过显微镜观察组织或细胞中的信号分布和强度，
进行结果分析。
免疫组织化学酶标法具有高灵敏度、高特异性和高重复性等优点，广泛应用于生物医学研究、诊断和治疗等领域。
酶组织化学染色诊断
酶组织化学染色诊断酶组织化学染色是一种常用的病理学方法，用于诊断和研究组织和细胞中酶的活性和表达情况。
通过染色反应，酶活性的变化可以在组织切片中可视化，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
在酶组织化学染色中，常用的染色剂包括酶底物和染色显色剂。
酶底物是一种可以被特定酶催化反应的物质，而染色显色剂则是将酶催化反应转化为可见颜色的物质。
通过这种方式，可以通过染色显色的结果来间接评估组织和细胞中特定酶的活性水平。
酶组织化学染色的最大优势之一是可以在组织切片中直观地显示酶的分布和表达情况。
不同的酶在不同的组织和细胞类型中表达不同，因此，通过观察染色结果，可以对组织和细胞的类型进行初步鉴定。
例如，在肿瘤组织中，常常可以观察到某些特定酶的过表达，这可能与肿瘤的发生和发展有关。
酶组织化学染色还可以用于评估酶活性的定量变化。
通过对染色结果的定量分析，可以对不同组织和细胞中酶活性的差异进行比较。
这对于研究酶的功能和调控机制以及评估治疗效果具有重要意义。
然而，酶组织化学染色也存在一些限制。
首先，染色结果受到多种因素的影响，包括染色剂的浓度和反应时间、切片的处理和保存条件等。
因此，在进行酶组织化学染色时，需要严格控制这些因素，以确保结果的准确性和可靠性。
其次，染色结果通常只是一种间接指标，不能直接反映酶的功能状态。
因此，在对染色结果进行解读时，需要结合其他病理学和临床资料进行综合分析。
总的来说，酶组织化学染色是一种重要的病理学方法，可以用于疾病的诊断和研究。
通过对酶活性的可视化，可以直观地评估组织和细胞中酶的表达情况，并为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
然而，在使用酶组织化学染色时，需要注意染色条件的控制和结果的解读，以确保结果的准确性和可靠性。
酶组织化学应用汇总.
OH
OH （ H）
最适PH因组织而异。小鼠肾为7.5, 睾丸、脑、肝分 别为8.5、7.5~8.5、8.0
激活剂：Mg++，Mn ++ 抑制剂：氟化钠（0.1M NaF），硼酸钠
5′核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶
5′核苷酸酶的显示----铅法
【基本原理】5′Nase水解底物5′单磷酸腺苷
AMP
酶组织化学
---水解酶及氧化还原酶
组织化学原理及方法
显示酶的组织化学方法
1.金属沉淀法：磷酸酶的显示
甘油磷酸钠
酸性磷酸酶
磷酸酯+铅 酶
磷酸铅
硫化铅
2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法
底物 重氮盐 初级反应产物（PRP） 最终反应产物（FRP）
3.电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示
水解酶---这是一类增加或去除水，催化 水解反应的酶 AB+H2O AH+BOH
1. 小块组织液氮骤冷, 低温冰箱切片 2. 甲醛钙液(Fca)固定5分钟, 4℃, 然后蒸馏水洗, 也可不固定
3. 作用液5~60分钟, 37℃或室温 4. 蒸馏水洗 5. 4%甲醛固定15分钟~2小时, 室温 6. 自来水洗, 蒸馏水洗 7. 1%甲基绿(氯仿洗过)5~10分钟, 蒸馏水洗 8. 甘油明胶封片, 或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固
显示酸性磷酸酶的常用方法
1. 酸性磷酸酶硝酸铅法
【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似 ACP 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅
硫化铅（黑色）
【孵育液】硝酸铅，巴比妥-硝酸盐缓冲液，β-甘油磷酸钠 【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色
2. 同时偶联法
【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚ASTR和磷酸, 萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联, 在酶活性处形成红 色的不溶性复合物 【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯, 六偶氮对品红
酶免疫组织化学染色技术
酶免疫组织化学染色技术一、酶免疫染色原理酶免疫组织化学染色技术是一种利用酶催化反应原理，将抗体与酶结合，形成酶标抗体，并将其固定在组织上，通过显色反应，检测抗原-Ab的结合，从而对组织中的抗原进行定位、定量及定性的一种免疫组织化学技术。
酶免疫染色原理主要包括酶促反应和免疫反应两个阶段，其中酶促反应阶段主要是抗体与酶的结合，而免疫反应阶段则是抗原-Ab的结合。
二、酶免疫组织化学染色步骤1. 组织处理：将组织样本进行固定、脱水、透明化等处理。
2. 抗原修复：采用加热或化学方法使抗原从组织中释放出来，暴露出抗原表位。
3. 阻断：加入内源性过氧化物酶阻断剂，以消除组织中存在的过氧化物酶活性。
4. 孵育：加入酶标抗体，在组织中与抗原特异性结合。
5. 显色：加入底物溶液，在组织中形成有色产物，以可视化抗原-Ab 的结合。
6. 观察：观察并记录染色结果。
三、酶免疫组织化学染色的应用酶免疫组织化学染色技术广泛应用于医学和生物学领域，包括肿瘤诊断、病原微生物检测、细胞凋亡和坏死检测等方面。
通过对组织中特定抗原的检测，可以揭示疾病的发生、发展过程以及药物治疗的效果。
四、酶免疫组织化学染色技术的发展随着生物技术的不断发展，酶免疫组织化学染色技术也在不断改进和完善。
近年来，该技术已逐渐向自动化、定量化和标准化方向发展。
自动化技术可以减少人为操作误差，提高实验的重复性和准确性；定量技术可以实现对组织中抗原的定量检测，揭示抗原表达水平与疾病发生、发展的关系；标准化技术可以保证不同实验室之间的实验结果具有可比性，提高实验结果的可靠性。
五、未来趋势随着生物技术的不断发展，酶免疫组织化学染色技术的未来发展趋势将主要体现在以下几个方面：1. 多指标联合检测：将多种指标联合检测，可以更全面地揭示疾病的发生、发展过程以及药物治疗的效果。
例如，可以将肿瘤标志物、细胞因子等指标联合检测，以更准确地诊断肿瘤并评估治疗效果。
2. 免疫荧光与免疫组织化学联合应用：免疫荧光技术可以实现对组织中抗原的准确定位和定性分析，而免疫组织化学技术则可以对组织中抗原进行定量分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3．四唑盐法
细胞内的脱氢酶类作用于特定底物， 分离出氢原子，经辅酶、黄素蛋白或吩 嗪加硫酸酯（PMS）等受氢体传递，与 无色的四唑盐或双四唑盐结合形成红色 的甲月替 或蓝色的二甲月替 。 该法主要显示氧化还原酶类，如琥 珀酸脱氢酶、羟甾体脱氢酶、乳酸脱氢 酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。
4、底物膜法
酶组织化学
姓名：侯喜洋 专业：动物学
主要内容
酶组织化学的定义 酶组织化学常用的检测方法 影响酶组化的关键因素—酶活性的保存 常见几种酶显示原理 酶组织化学的应用
酶组织化学的定义
酶组织化学（Enzyme Histochemistry） 是利用组织细胞内酶具有催化某种反应的 特性来检测酶活性。一般是用冻结或固定 的切片，再一定条件下（具有酶的底物等） 全酶进行催化作用，产生一种可见产物， 沉淀在酶所在的部位，最终通过显微镜对 酶的活性进行定位或定量研究。
偶氮色素法的基本方法是，组织细胞内 的酶作用与人工合成的底物，形成的分解产 物与重氮盐结合，引起偶氮偶联，产生不溶 性的偶氮色素，从而显示酶的定位。 常用的底物有萘酚、萘酚AS的衍生物， 如萘酚AS-BI、萘酚AS-D等，多用于显示磷 酸酶、糖苷酶和酯酶；萘胺和吲哚胺的衍生 物，多用于显示肽酶。部分转移酶的组化也 用此法，如γ-谷氨酰转移酶等。
常见几种酶显示原理
一、钙—钴法显示碱性磷酸酶 〔原理〕以天然存在的β—甘油磷酸钠为底物， 经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为 磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴， 最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式如下：
碱性磷酸酶钙-钴染色 大鼠小肠绒毛吸收细胞呈深棕色为碱性磷酸葱阳性反应
二、偶氮色素法—非特异性酯酶
本法反应迅速，沉着颗粒微细，色调美丽， 且由于金属离子的高电子密度而可用于盐的移动、扩散或吸着等现 象发生，以得到准确定位。 该法多用于水解酶的显示。常用的有碱 性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶、三磷酸腺苷酶、 腺苷酸环化酶等。
2．偶氮色素法
9、对照： 必须设立对照，以防非特异反应。这对结果的 解释非常重要。 ★★★ 对结果的分析，应考虑如下几个问题： ① 经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟 能保留多少？ ② 酶是否在原位？ ③ 反应中多少酶起了作用？ ④ 酶的活性是否代表细胞生活时的活性？ ⑤ 沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延 长，会不会改变？ ⑥ 是否有扩散移位
5、捕获剂： 亦要求一定浓度，要以反应原位瞬时沉淀。 6、激活剂与抑制剂（对照） a）两者的选择都应具有特异性。 b）要有适当的浓度范围 7、时间： 通过实验自行摸索。任何配方都是一个很大 的范围（指时间），受多种因 素的影响，因药 品的质量、环境因素的变化而变化。故不可轻 信之。 8、扩散： 控制反应速度，避免扩散（冰冻切片 孵育 尤应注意）
〔原理〕非特异性酯酶常用偶氮色素法显示， 在pH5.0-8.0条件下，该酶可将底物α-乙酸萘 酯分解成萘酚，然后与重氮盐偶联形成偶氮 色素。
大鼠肾皮质呈砖红色为非特异性酯酶阳性反应
三、四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶
［原理］ 利用H受体的H2，使四唑还原 成甲 月替 ：反应式如下：
大琥 鼠珀 肝酸 细脱 胞氢 卞酶 充四 满唑 旱盐 深法 蓝 兰 的 琥 珀 酸 脱 氢 酶 阳 性 反 应 颗 粒
4、明胶膜法显示顶体酶
精子在薄层明胶上孵育，引起顶体反应， 释放顶体酶溶解明胶基质，使台酚蓝的背景 上出现以精子顶体为中心的亮区。
明 胶 膜 法 显 示 人 精 子 顶 体 酶
酶组织化学的应用
酶组织化学方法广泛用于病理、科研及药物毒性检 验。 酶组织化学将细胞形态、化学成分、生理功能的研 究有机结合，能够从微观水平反应证的病理变化、 中药方剂的作用机理，对中医药的研究起着一定的 促进作用。 当前随着医 学的发展，部分酶组织化学的运用领域 已被免疫组织化学取代， 但是在某些方面，如细胞 代谢研究、特殊细胞定位等方面它仍有 着一定优势， 特别是现代组织化学定量技术的运用，使酶组织化 学的准确性、客观性进一步提高。
酶组织化学的显色原理是将 组织切片置于含有特异性底物的 溶液中孵育，底物经酶的作用形 成初级反应产物，它再与某种捕 获剂结合，形成显微镜下可见的 沉淀物。 特点： ① 在原位检测 ② 检测酶的活性而不是 酶分子本身
酶组织化学常用的检测方法
1．金属沉着法
金属沉着法是利用某些金属本身具有颜色（如银， 黑色）或其化合物具有颜色（如硫化钴，黑色；硫 化铅，棕黑色等）的特性设计的。首先组织细胞内 的酶与底物作用形成分解产物，该产物被特定的金 属离子捕捉形成沉淀，然后经显色反应（有的须在 显色前经置换反应）显示该金属化合物的位置（即 酶存在的部位）。
底物膜法，是将酶底物制成薄膜，与含 酶的组织样品或切片孵育，然后对底物的膜 进行特殊染色，未着色部位（底物已被酶分 解）即为酶所在之处。 用于淀粉酶、透明质酸酶、精子顶体酶 等的检测。
影响酶组化的关键因素—酶活性的保 存
1、取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备 液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙 酮∶氯仿=1∶1）4℃，5～10分钟。 2、底物浓度 量要足够1∶20 V/ V 孵育法只能用一次，配制时要适量（节俭） 3、PH和渗透压 应以缓冲液调节 4、温度控制 一般为室温37℃