最新免疫酶组织化学技术
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HRP的底物为低浓度的H2O2， 供氢体为胺类及酚类化合物。
HRP显色反应： HRP＋H2O2 电子供体 HRP
＋H2O＋电子供体（氧化型）
电子供体被氧化后，迅速改变 颜色，通过聚合等反应，生成不溶 性有色颗粒，并就地原位沉淀。
HRP常用的电子供体：
● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ● 氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂， 易扩散，用水溶性封固剂。
一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体
（第一抗体）上，抗原--抗体● HRP复合物
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一
性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。
二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上，
抗原---特异性抗体---第 二抗体● HRP复合物 步骤：二步法
应用范围广
● 某些脏器存在内源性生物素 干扰
● Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应
SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase
Complex SABC法已代替ABC法
二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： ● Biotin标记第二抗体
酶桥法
一、PAP法 原理：抗原---特异性抗体---第
二抗体（桥抗体）--PAP复合物 步骤：三步法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
PAP法
特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物
二、双PAP法： 原 理 ： 在 PAP 的 基 础 上 再 重 复 第二抗体和PAP复合物
组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶
间接法
特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。
第四节 酶 抗 酶 法
● 制备抗酶抗体 ● 制备PAP复合物
组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP
LSAB法
● HRP标记Avidin 抗原---特异性抗体---Biotin标记
第二抗体---Avidin ● HRP复合物
步骤：三步法 特点：敏感性高，特异性强，
方法简便
第六节 多聚合物酶法
HRP---多聚合物---抗体 一、Epos法
Enhanced polymer one-step staining
符合上述条件：
辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶
（一）辣根过氧化物酶（HRP）
★ 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 ★ 稳定，易获得较高纯度酶 ★ 具有较高活性及特异性 ★ 可溶性佳，生成的产物不扩散 ★ 组织中内源性酶较少 ★ 可作用于多种底物，产生不同颜色 ★ HRP穿透力强，易进入细胞内
多聚合物酶法
组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架
EPOS 方法
原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP---多聚合物---特异性 抗体。
步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强，
敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵
二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer
● 4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保 存
● 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) ～黄色
AKP底物： AKP 常 用 的 底 物 为 α- 萘 酚
AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色
第三节 酶标记抗体法
酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在 抗体分子上，制备成酶标记抗体，通 过抗体去寻找相应抗原。
System 原理：HRP ---多聚合物---第二
抗体
组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架
第一步
第二步
EnVisionTM方法
特点：
敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和 10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin 的干扰。
第七节 基本操作步骤
1. 抗原修复 2. 内 源 性 过 氧 化 物抑制 3. 正常血清封闭 4. 第一抗体
原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin
酶素化Biotin＋Avidin --- ABC 复合物 抗原---特异抗体--- Biotin标记 第二抗--- Avidin ● Biotin ●HRP
组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素
ABC法
步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强，
（二）碱性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取
● 组织穿透能力较弱 ● 内源性AKP较高 ● 左旋咪唑具有抑制作用
（三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 ● 体内无内源性GOD ● 分子量大，穿透力较弱
二、底物及其特点
· 酶＋底物→酶 底物→酶＋
产物（显色）
HRP的底物：
抗体--- APAAP复合物 步骤：三步法
APAAP法
特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂
第五节 卵白素---生物素
Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同 亚基组成
Biotin小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力
一 、ABC法 Avidin Biotin Complex
免疫酶组织化学技术
第一节 基 本 原 理
抗原＋抗体（特异性） ＋酶标记抗体，通过酶与 底物作用生成有色反应物， 定位组织或细胞内抗原的 一门技术。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗 体）---PAP ---第二抗体--- PAP复合物
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双Pห้องสมุดไป่ตู้P法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双PAP法
步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特
异背景重
三、APAAP法 原理：抗原---特异抗体---第二
HRP显色反应： HRP＋H2O2 电子供体 HRP
＋H2O＋电子供体（氧化型）
电子供体被氧化后，迅速改变 颜色，通过聚合等反应，生成不溶 性有色颗粒，并就地原位沉淀。
HRP常用的电子供体：
● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ● 氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂， 易扩散，用水溶性封固剂。
一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体
（第一抗体）上，抗原--抗体● HRP复合物
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一
性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。
二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上，
抗原---特异性抗体---第 二抗体● HRP复合物 步骤：二步法
应用范围广
● 某些脏器存在内源性生物素 干扰
● Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应
SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase
Complex SABC法已代替ABC法
二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： ● Biotin标记第二抗体
酶桥法
一、PAP法 原理：抗原---特异性抗体---第
二抗体（桥抗体）--PAP复合物 步骤：三步法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
PAP法
特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物
二、双PAP法： 原 理 ： 在 PAP 的 基 础 上 再 重 复 第二抗体和PAP复合物
组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶
间接法
特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。
第四节 酶 抗 酶 法
● 制备抗酶抗体 ● 制备PAP复合物
组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP
LSAB法
● HRP标记Avidin 抗原---特异性抗体---Biotin标记
第二抗体---Avidin ● HRP复合物
步骤：三步法 特点：敏感性高，特异性强，
方法简便
第六节 多聚合物酶法
HRP---多聚合物---抗体 一、Epos法
Enhanced polymer one-step staining
符合上述条件：
辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶
（一）辣根过氧化物酶（HRP）
★ 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 ★ 稳定，易获得较高纯度酶 ★ 具有较高活性及特异性 ★ 可溶性佳，生成的产物不扩散 ★ 组织中内源性酶较少 ★ 可作用于多种底物，产生不同颜色 ★ HRP穿透力强，易进入细胞内
多聚合物酶法
组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架
EPOS 方法
原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP---多聚合物---特异性 抗体。
步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强，
敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵
二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer
● 4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保 存
● 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) ～黄色
AKP底物： AKP 常 用 的 底 物 为 α- 萘 酚
AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色
第三节 酶标记抗体法
酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在 抗体分子上，制备成酶标记抗体，通 过抗体去寻找相应抗原。
System 原理：HRP ---多聚合物---第二
抗体
组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架
第一步
第二步
EnVisionTM方法
特点：
敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和 10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin 的干扰。
第七节 基本操作步骤
1. 抗原修复 2. 内 源 性 过 氧 化 物抑制 3. 正常血清封闭 4. 第一抗体
原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin
酶素化Biotin＋Avidin --- ABC 复合物 抗原---特异抗体--- Biotin标记 第二抗--- Avidin ● Biotin ●HRP
组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素
ABC法
步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强，
（二）碱性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取
● 组织穿透能力较弱 ● 内源性AKP较高 ● 左旋咪唑具有抑制作用
（三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 ● 体内无内源性GOD ● 分子量大，穿透力较弱
二、底物及其特点
· 酶＋底物→酶 底物→酶＋
产物（显色）
HRP的底物：
抗体--- APAAP复合物 步骤：三步法
APAAP法
特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂
第五节 卵白素---生物素
Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同 亚基组成
Biotin小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力
一 、ABC法 Avidin Biotin Complex
免疫酶组织化学技术
第一节 基 本 原 理
抗原＋抗体（特异性） ＋酶标记抗体，通过酶与 底物作用生成有色反应物， 定位组织或细胞内抗原的 一门技术。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗 体）---PAP ---第二抗体--- PAP复合物
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双Pห้องสมุดไป่ตู้P法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双PAP法
步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特
异背景重
三、APAAP法 原理：抗原---特异抗体---第二