酶组织化学概论.ppt

二、光镜酶组织化学证明法 1．金属-金属盐法 金属盐法一般是指金、银、铜、铁、
铝、钴等金属。金属、金属盐及其化合物 都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶 的分解产物和金属多半可以结合。因此， 捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合， 利用其呈色反应，再显现出酶反应的部位， 就可以证明某种酶的存在。
酶作用于底物后生成的分解产物与底 物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着 于酶的反应局部，然后使其显色。其反应 式如下：
（2）靛酚蓝法 靛酚蓝法用于检测 氧化酶的方法，把二甲基-对-苯二胺和 α- 萘酚加入底物混合液中，由酶作用 而释放的氧与此二者发生结合，形成把酶底物在载物片上涂 成膜，然后再将含酶的组织切片贴附其上， 给以条件让酶发生反应，使底物分解。接 着剥离贴附的切片，对膜进行特殊染色， 只有底物被分解的部位不着色，而未被分 解的部位被染色，故未着色部位就是酶的 定位。
3.酶活性丧失对照 实验用过长时间固定或恒温60℃处理 60min的方法，使酶活性丧失后进行孵育 反应。 4.阳性对照 事先不知某种组织细胞是否存在某种 酶的活性，可用已知有活性的组织或细胞 做对照，以确定待测组织或细胞内有该酶 活性的存在。
三、电镜酶组织化学证明法 1．氧化还原酶 （1）四唑盐法 四唑盐是水溶性
的，在水溶液中几乎无色，还原后则 难溶于水和脂质，变成有色的高电子 密度的甲 。现在最常用的四唑盐有 NBT和TNBT等。
（2）高铁氰化物还原法 本法是金 属盐法的一种，高铁氰化物作为人工受 氢体而被使用。高铁氰化物接受由酶作 用而游离出来的氢，从而变成亚铁氰化 物，此物质不溶于水，并以电子密度高 的亚铁氰化铜的形式在酶活性部位被捕 捉而沉着。
酶组织化学概论
酶是一种具有催化活性的特殊蛋白 质。人体的各种机能活动都与酶的活性 有密切关系。
国际生物化学酶学委员会已登记的 酶有2200多种。但当前组织化学技术所 能显示的酶仅200多种。
酶组织化学是用组织化学的方法证 明酶的存在，它的基础是组织化学，目 的在于阐明组织细胞内的化学反应、功 能及其生物学意义。
Pb2+
(NH4)2S
R-PO4Na2 + H2O ――→ ROH + PbHPO4↓――→ PbS
酶反应
显色
这种方法在底物溶液中的H+浓度为中 胜或弱酸性，常常可利用易获得的硝酸铅 或醋酸铅。因此，本法常被应用于酸性磷 酸酶和在中性附近起作用的磷酸酯酶类。 通常称本法为硫化铅法。
证明碱性磷酸酶时，通过形成可见的 黑色硫化钴，称为硫化钴法。
琥珀酸 ――――――→延胡索酸
琥珀酸脱氢酶
Fe(CN)63- ――――――→ Fe(CN)64-
高铁氰化物
亚铁氰化物
Cu2+
――――→ Cu2Fe(CN)6·XH2O 亚铁氰化物
（3）二氨基联苯胺法 二氨基联苯 胺法（diaminobenzidine method，DAB） 法主要用在直接证明细胞色素氧化酶、 过氧化物酶（内源性）、过氧化氢酶活 性检测。DAB还用于形成嗜锇性多聚体。
目前，可用这种方法证明的酶有： 碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、β-葡 苷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、 N-乙酰基β-氨基葡糖酶、氨基肽酶、硫 酸酯酶等等。
3.色素形成法 （1）四唑盐法 四唑盐法是指含有 四唑盐或双四唑盐的底物混合液，在脱 氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原 子与无色的四唑盐或双四唑盐相结合， 形成红色或蓝色的甲 （formazan）或 二甲 （diformazan）色素。该法主要 证明各种脱氢酶。
一、酶的分类 1.氧化还原酶 是催化氧化还原反应
的酶。包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶 和加单氧酶。如苹果酸脱氢酶、黄嘌呤氧 化酶、谷胱甘肽过氧化物酶与羟化酶或混 合功能氧化酶。
5.异构酶 催化同分异构体的相互转 化。磷酸葡萄糖异构酶，磷酸丙糖异构酶 等。
6.合成酶（又称连接酶） 系指能将 两种物质合成为一种物质，并必须与ATP 分解相偶联的酶。
基于重氮盐种类不同，其偶氮颜色也 各有差异，可显示出蓝色、紫色、红色、 褐色、黑色、棕色等各种颜色。
根据偶联的时间不同，将偶氮色素法 分为两种。
1）同时偶联法 同时偶联法是在底 物混合液中，通过酶的分解作用所得到的 沉着物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。
2）后偶联法 后偶联法是为了防止 重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内 发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍 于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素。
Ca2+ R-PO4Na2 + H2O ―――→ ROH + CaHPO4↓
酶反应
Co2+
（NH4)2S
―――→ CoHPO4 ―――→ CoS
金属置换
显色
用这些金属盐法能够证明的酶多半是 水解酶。其中有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、 脲酶、酯酶、硫酸酶、碳酸酐酶、胆碱酯 酶等。此外，根据磷酸酶的理论，利用组 织化学的鉴别法能证明的酶还有磷酰胺酶、 5’-核苷酸酶、ATP酶、葡萄糖-6-磷酸酶 等。
2.水解酶
（1）胆碱酯酶活性检查法
1）乙硫羧酸法根据使用的捕捉金属种类
的不同可有铅－乙硫羟酸法等，在酶的作用下，
游离的硫化氢与铅反应，形成硫化铅沉着于酶
的活性部位。
酯酶
Pb(NO3)2
CH3COSH ――→ CH3COOH + H2S ――→ PbS↓
2）嗜锇性硫酯法 是以嗜锇性硫 酯作为底物，用坚牢蓝BBN做偶联剂的 方法。
四、对照实验 1.抑制剂对照 用酶活性的抑制剂确认酶活性受到抑制。
环化酶
cATP 磷酸二酯酶 腺苷 + Pi
茶碱
ATP 四氧嘧啶 PPi ATP酶 ADP + Pi
特异性底物：5’-腺苷酰-亚氨二磷酸
ATP-PNP
环化酶 cATP + PNP（亚氨二磷酸） ATP酶 无水解作用
2.去底物对照 用去底物的无底物孵育液进行反 应，确认反应的消失或明显减弱。
2．偶联偶氮色素法 偶联偶氮色素法，此法又称偶氮色素 法，是指用人工合成的酶底物，在酶的作 用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合， 引起偶联偶氮反应，使其形成不溶性的偶 氮色素，以此证明酶的定位。
在这种方法中，最常用的分解产物是 茶酚系列的化合物，如2-萘酚、1-萘酚、 萘酚AS、萘酚AS衍生物等。但这些化合物 本身也有一定的溶解性，因而其分解产物 有扩散的缺点。