第七章高效液相色谱法教材
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《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱法(精细化学品分离提纯技术)
• 在RPC中，有机水溶液作流动相，溶质在非 极性的配基（烷基、苯基等）上的保留， 就是由于溶质中的疏水基团倾向于与配基 结合而造成的。
• 溶质中的疏水性越强，与配基的结合地越 牢。所以有机同系物中随着烷基链长的增 加，其保留值也增大。
（2）计量置换模型
• 样品分子和固定相上的配基在流动相中都是溶剂化的。当 样品分子保留在柱子上时，样品分子与配基接触，两者之 间结合面上的溶剂化分子被“挤”走，进入流动相。被 “挤”走的溶剂分子有Z个。当样品分子被洗脱下来时，样 品分子进入了流动相，样品分子与配基的接触面重新被溶 剂化，重新溶剂化所需的溶剂分子是Z个，与保留时被“挤” 走的溶剂分子相等。
2.与GC相比 (1)样品受限制少，对易分解、不容易气化、 分子量大、高极性的有机物（70~80%的有机 物）可用HPLC分析。 (2)不用制备衍生物，减少了误差。 (3)进样量大（500~800μL），易制备。 (4)分离效率降低。
二、一般分离流程
高效液相色谱仪及一般分离流程见图7-1。 三、色谱原理 1、概念 HPLC：以溶剂或某种溶液为流动相，
§7-1 一般流程及分离原理
一、简介 1.与经典的液相柱色谱法相比 (1)柱内径↓，填充剂粒度↓、均匀性↑， 新型固定相的问世 → 分离效率↑。 (2)柱长↓，填充剂机械强度↑，供液压力 和进样压力↑，流动相流速↑（1~5ml/min） →分离速度↑（7~8个峰/10min）。 (3)采用光学原理的检测器→灵敏度↑。
• 另外，对照（a）和（d）可以 发现刚上样后，溶质分子形成的 色带（又叫谱带）较窄，而到了 （d）中，各组分的谱带明显变 宽，这说明同一组分沿柱子移动 时，存在着扩散问题，即谱带的 扩散。
图7-2 三组分样品 分离过程示意图
《高效液相色谱法》课件
– 分离机理：组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面 活性中心
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱
7高效液相色谱法 ppt课件
1. 在食品分析中的应用
• 1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类 等；
• 2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等； • 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。
2. 在环境分析中的应用
• 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
3. 在生命科学中的应用
• 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等 的分离和测定。
2021/2/20
(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
2021/2/20
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六 通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白 质、酶等
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以 凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂 糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
其结构如图所示：
2021/2/20
(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱 柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2021/2/20
(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
• 1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类 等；
• 2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等； • 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。
2. 在环境分析中的应用
• 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
3. 在生命科学中的应用
• 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等 的分离和测定。
2021/2/20
(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
2021/2/20
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六 通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白 质、酶等
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以 凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂 糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
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五、高效液相色谱法的应用
其结构如图所示：
2021/2/20
(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱 柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2021/2/20
(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
郑州大学药物分析课件：第七章色谱法
② 极性小，用量体积小可溶解样品。
洗脱剂：极性适中使各组分分开 极性：石油醚（烷烃）＞苯＞乙醚＞氯仿＞丙酮 ＞醇＞水＞酸，必要时采用混合溶剂或梯度洗脱。
二、实验步骤：
（1）柱均匀不能有气泡裂缝 干法 1、装柱 湿法 注意事项 （2）上层盖脱脂棉、滤纸 （3）上端保持一段溶剂 （4）吸附剂高度为
2、加样及洗脱 混合物 分段收集洗脱液 纯品
使待测离子形成中性离子对 如：阴离子型 庚烷磺酸 R-SO3十二烷基磺酸钠 钠 R SO R H RSO3 分离碱用 N 3 RN3 阳离子型：磷酸四基铵 （C4H9N+
3
·
4 9 N 分离酸时用 R COO 4 ( CH)
4 +
用途：分离在溶液中为形成离子的化合物，如：生物碱、胺类 举例：对氨基水杨酸钠中，间氯基酚的检查
分别收集 荧光
分段
影响分离因素： （1）各组分极性 （2） 洗脱剂极性
（3）吸附剂的活性
3、吸附剂和洗脱剂的选择 （1） 吸附剂
色谱专用 粘度：100-150目 碱性：PH=9~10用于烷烃、胺、生物碱 氧化铝 中性：PH=7.5 用于醛、酮、醌、酯
酸性：PH=4-4.5 用于有机酸的分离
（2）溶剂和洗脱剂 溶剂的要求：①不与吸附剂起化学反应
第三节
气相色谱法
一、概述 1、气相色谱：以气相为流动相的色谱
2、分类：固定相 重点：气-液色谱 3、分离原理：
载体+固定液 （高沸点液体）
分配型
4、应用特点： （1）高灵敏度 （2）高选择性 （3）高效能 （4）分析速度快（5）自动化程度高
5、应用范围：分析对热稳定，具有一定挥发性的样品，
二、气相色谱仪的组成 1、构成 色谱柱：U型或螺旋型 金属管、 固定液、
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱法PPT课件
12
13
开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
14
15
正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）， 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
23
进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式（头）过滤器
24
仪器：手动进样器-六通阀/定量环
25
手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
26
手动进样器
27
28
仪器：检测器
29
仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
6
色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的，色谱法(Chromatography)因之得 名。
7
色谱法的分离原理是：
溶于流动相中的各组分经过固定相时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
8
色谱分离过程
流动相 Temporal
course
9
液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效 低、时间长（常有几个小时）。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上，于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。
13
开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
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15
正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）， 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
23
进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式（头）过滤器
24
仪器：手动进样器-六通阀/定量环
25
手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
26
手动进样器
27
28
仪器：检测器
29
仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
6
色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的，色谱法(Chromatography)因之得 名。
7
色谱法的分离原理是：
溶于流动相中的各组分经过固定相时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
8
色谱分离过程
流动相 Temporal
course
9
液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效 低、时间长（常有几个小时）。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上，于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。
高效液相色谱分析法
现代食品检测技术第一部分——色谱分析——高效液相色谱第七章高效液相色谱分析法High performance liquid chromatograph 第一节高效液相色谱的特点与仪器第二节主要分离类型与原理第三节液相色谱的固定相与流动相第四节影响分离的因素与操作条件的选择第五节新型液相色谱简介2010-1-25第一节高效液相色谱的特点与仪器2010-1-25一、高效液相色谱法的特点在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论。
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。
高效液相色谱法的突出特点：1）高效（柱效约为30000n /米）2）高速（较经典色谱法））3）高压（150 -350*105Pa4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光：10-11g ）2010-1-251. HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1）经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1～3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀；常压输送流动相，柱效低（H↑，n↓）；分析周期长、无法在线检测。
2）HPLC：分离和分析柱内径2～6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）；高压泵输送流动相，柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩短、可以在线检测。
2010-1-252. HPLC与GC差别9相同：兼有分离和分析功能，均可以在线检测9主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别1）分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，仅能分析有机物的20％。
HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80％。
2010-1-252）流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3）操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大）2010-1-25二、液相色谱仪器2010-1-25三、流程及主要部件Process and main assembly of HPLC 1.流程2010-1-252.主要部件(1) 高压输液泵♥主要部件之一，压力：150～350×105Pa。
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
高效液相色谱方法及应用课件
未来发展趋势与展望
超高效液相色谱（UPLC）的普及与发展
随着色谱填料制造技术的进步，UPLC将逐渐成为主流技术，进一步提高分离效率和检 测灵敏度。
联用技术的发展
HPLC将与其他分析技术（如质谱、红外光谱等）更紧密地结合，实现多维、多组分的 同时分析，提高分析速度和准确性。
微纳流控芯片的集成与应用
随着微纳加工技术的发展，HPLC将与微纳流控芯片集成，实现样品制备、分离和检测 的一体化，为便携式、即时分析提供可能。
PART 06
高效液相色谱法的挑战与 展望
技术挑战与解决方案
01 02
分离效率的提高
随着样品组分的日益复杂，分离效率的提高成为HPLC技术面临的重要 挑战。解决方案包括开发新型填料、优化色谱柱参数以及采用先进的色 谱分离技术。
检测灵敏度的提高
对于痕量组分的分析，提高检测灵敏度是关键。解决方案包括采用高灵 敏度检测器、优化检测条件以及发展超高效液相色谱技术。
实验操作流程
流动相制备
根据实验要求，制备适量的流动 相，确保其比例、纯度和稳定性 符合要求。
样品处理
对样品进行预处理，如溶解、过 滤、稀释等，以便进行后续的液 相色谱分析。
柱子安装与条件优化
根据实验需求，选择合适的色谱 柱，并进行安装和条件优化，以 提高分离效果和实验效率。
进样与检测
将处理好的样品注入进样器，按 照设定的条件进行分离和检测， 记录数据。
发展历程与趋势
发展历程
HPLC技术自20世纪60年代问世以来， 经历了不断改进和完善的过程，已成 为一种成熟且广泛应用的分析方法。
发展趋势
随着科技的进步，HPLC技术正朝着 高分离度、高灵敏度、自动化和智能 化的方向发展，同时与其他分析技术 的联用也成为了研究热点。
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c. 不同样品的类型、洗脱类型相近
（2） 二元混合溶剂的应用
分离复杂混合物时，常采用二元混合溶剂
溶剂A（ 0小）与溶剂B（ 0大）以不同比例混
合时，混合溶剂的 ab
可以在纯A的
0 a
和纯
B的
0 b
之间变化。
即:
0 a
0 b
0 ab
0 a
0 ab
0 b
0
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.35 0.40
溶剂 正戊烷
0 0.00
溶剂 甲苯
0 0.29
石油醚 0.01
丙酮
0.56
环己烷 0.04
乙腈
0.65
二硫化碳 0.15
甲醇
0.95
四氯化碳 0.18
乙二醇 1.1
b. 对不同的吸附剂， 0 的绝对值不同，但 相对强度变化不大。
因为氧化铝、硅胶是极性物质，流动相的极 性小于固定相，所以溶剂强度随着溶剂极性的增 加而增大。
总体性质检测器：测量流动相中总的 物理性质变化（差示折光，电导电检测）
（1） 紫外检测器
光源
氘灯：190－350nm连续波长 氢弧光灯：200－300nm连续波长
汞灯 低压：254nm 中压：280nm
光谱通带：2－5nm
池体
池长：一般为10mm 直径：Φ＝1mm 池体积：8µL左右 池材料：石英
n1－溶剂的折射率 n2－溶质的折射率 c1－溶液中溶剂的浓度分数 c2－溶液中溶质的浓度分数
c1+c2=1 ns-n1=n1c1+n2c2-n1 =n1(1-c2)+n2c2-n1 =c2(n2-n1)
一定稀溶液：折射率之差（ns-n1) c2
优点：适用性好 缺点：①灵敏度较低(10-6g·mL-1)
输入色谱柱。
（2） 高压梯度洗脱装置（内梯度）
由两台或三台高压泵，梯度程序控制器组成。 各台泵将不同溶剂送入混合器，经充分混合后进 入色谱柱。
7.2.4 进样系统
直接注射进样，进样阀，自动进样系统
六通阀动画
7.3.5 检测器
类型
溶质性质检测器：仅对溶质的物理性 质或物理化学性质有响应（紫外、荧 光检测器）
固定相：极性吸附剂 流动相：弱极性的有机溶剂 应用：适于分离不同类化合物或异构体。
不适宜分离同系物，固定相的种类少， 应用不十分广泛。 性能：重现性能差，样品有时会异构化解。
（3）离子色谱
根据离子交换树脂对组分的亲和力不 同而进行分离。 固定相：离子交换剂 流动相：多为缓冲溶液 应用：一般用于分离离子型化合物
R1 4
n
k' 1 k '
a 1 a
流动相性质直接影响 k ', a
流动相的选择对分离起着极其重要的作用
7.4.1 对溶剂的要求
（1）化学稳定性好，不与固定相互溶，不 发生不可逆反应; （2）纯度高; （3）对给定的样品有合适的极性和良好的 选择性; （4）适合于所使用的检测器; （5）粘度低;
适于梯度洗脱
光二极管阵列检测器
由1024(512或211)个光电二极管组成,各检测 特定波长;计算机快速处理，可同时检测 180~600nm波长范围内全部紫外光和可见光波的 信号.可获得A-λ-t三维立体色谱图.
(2)差示折光检测器
测量参比池和样品池之间的折射率之差
溶液的折射率：ns=n1c1+n2c2
④Si－O－Si－C（硅胶与有机硅烷反应产物）
这类固定相是将硅胶表面用有机氯硅烷 或烷氧基硅烷处理。最常用的十八烷的键合 形式可表示如下：
CH3
Si
OH + Cl Si
(CH2)17CH3
CH3
CH3
Si O Si
(CH2)17CH3 + HCl
CH3
通过硅烷化反应导入的基团可以是从强极性 到非极性的官能团，如十八烷基、辛烷基（C8）、 氨基、氰基、苯基等.
（2）泵的种类
① 恒流泵（往复泵，注射泵） 输出流量稳定，与外界阻力变化无关，为
保护泵，设有最高压力限制装置。
② 恒压泵（气动放大泵） 输出压力恒定，流量随色谱体系的压力而
变化。 保留时间重现性差，较少应用。
7.2.3 梯度洗脱装置
（1）低压梯度洗脱装置（外梯度） 常压下溶剂按一定比例混合后再由高压泵
7.3.4 柱的保养
①溶剂用0.5μm孔径的过滤器处理，防止柱堵塞；
②柱的实际操作压力应低于填装时的最高，最好在 最高压力的一半以下；
③防止反冲（流动相逆向流动），否则固定相层位 移，柱效下降；
④使用完柱子后用纯有机溶剂清洗，并将柱子保 存在纯有机溶剂中；
⑤含有强烈滞留组分的样品应使用保护柱。
7.4 流动相及其选择 基本保留方程式：
壁抛光 长度：一般150－250mm，少量30mm短柱，
500mm长柱 内径：一般4－5mm，标准柱径：4.6mm，
痕量分析<3mm，凝胶色谱柱：8mm
7.3.2 固定相的种类 （1）按承受的压力分类 ①刚性固体
以SiO2为基质，表面键合各种官能团，可以 承受压力70－100MPa.
优点：机械强度大，化学稳定性好，容易控 制孔结构和表面积。 缺点：只能在pH＝2 7.5条件下使用，碱度 过大，硅胶容易粉碎溶解，pH太低，连结有机 基团的化学键易断裂。
正相色谱
固定相：极性物质 流动相：非极性或弱极性物质
反相色谱
固定相：极性小的物质 流动相：极性大的物质（水系溶剂）
应用：分离不同类化合物或同系物, 对分离异构体不优越,固定相 的种类多，用途广.
性能：重现性佳，溶质保持稳定
（2）液固吸附色谱（LSC）
基于不同组分吸附能力的差异而进行混合物 的分离。
GC
LC
分析对象：挥发性和 热稳定性高的物质（约 20％的有机物） 流动相：种类少，但组分 没有作用力 操作条件：恒温，压力小
不受分析对象热稳定性 的限制
种类多对分离起很大 作用 室温，高压
7.1.2 高效液相色谱法的分类 （1）液－液分配色谱（LLC）
不同组分在固定相与流动相中的分配 系数差异进行分离。 固定相：涂渍在担体表面或键合到担体 上的固定液。
③ 软胶
葡聚糖，琼胶糖等 用于凝胶过滤色谱中分离水溶性物质。
（2）按表面形状分
①表面多孔：基体是实心玻珠，外覆活性多孔材料， 如硅胶、氧化铝、离子交换剂等，多孔表层薄，孔 浅，传质快，柱效高.
缺点：柱容量小，已较少使用。
② 全多孔型：比表面积大,粒径3-5µm，柱容量高， 保留值大。
缺点：由于孔深，传质阻力大，所以 10 µm以上柱效低。
（4）分子排阻色谱
按分子的尺寸大小进行分离。
凝胶过滤
固定相：亲水性凝胶 流动相：水系溶剂
凝胶渗透
固定相：疏水性凝胶 流动相：有机溶剂
应用： ① 分离分子量大于2000的物质 ② 测高聚物分子量分布 ③ 分离各种大分子（蛋白质，核酸）
7.2 高效液相色谱仪
7.2.1 流动相输送系统
流动相输送系统由过滤器、储液装置，脱气 装置，高压泵、压力脉冲阻尼器、梯度淋洗装置 组成。
定义为溶剂分子在单位吸附表面积A上的吸附自由能，表
征了溶剂分子对吸附剂的亲和程度。
0 Al2O3
Ea A
0越大，k越小，所以溶剂强度参数序列可作为吸附色谱
的洗脱系列
规定：对氧化铝吸附剂，正戊烷 0 0，其余溶剂的 0相对 大小与正戊烷的 0 相比较。
表：氧化铝吸附剂上的溶剂强度参数
荧光强度∝组分浓度 应用：测量在紫外线照射下能发出荧光的物质
优点：①检测限低（10-12g·mL-1） ②选择性强
（4）电化学检测器
检测具有电活性的物质，如含有硝基、 氨基的有机化合物及无机阴、阳离子。
优点：①灵敏度高（10-9g） ②选择性高 ③结构简单
7.3 色谱柱
7.3.1 柱材质与结构 材料：不锈钢、氟塑料 要求：耐高压，抗腐蚀，精密管径，内
光接收元件：光敏电阻，光电管或光电倍增管。
光源
参比池 测量池
光敏电阻1 光敏电阻2
若两池通过的都是纯流动相，则两光敏电阻 接收的辐射强度相等，无信号输出。
当组分进入测量池时，吸收紫外辐射，两光 电阻接收的辐射强度不等，有信号输出。
吸光度：
A lg I参比 ＝ bc
I测量
优点
灵敏度高（10-9g·mL-1） 选择性好 线性范围宽（10-5－10-8） 对温度不敏感
7.4.2 溶剂强度及选择
与色谱分离过程密切相关的最重要的溶剂特性参数 则有溶剂强度参数0、溶解度参数、极性参数P
溶剂强度－流动相将组分从固定相上洗脱 下来的能力
对给定的组分： 溶剂强度 ，k ' , tR
（1）吸附色谱中的溶剂强度
①溶剂强度与溶剂强度参数
a. 吸附剂强度参数 0
吸附色谱的溶剂强度以溶剂强度参数 0 表示
第七章 高效液相色谱法（HPLC）
7.1 概述 7.1.1 两个比较
（1）与经典液相色谱比较
相同点: 分析原理相同 主要差别：固定相的性质、形状、粒度 经典：>10µm的全多孔吸附剂，不均匀， 不耐高压，操作方式为间断式，速度慢。
（2）HPLC 与GC比较
主要差别：作为流动相的液体和气体之间 的性质差别。
溶剂序列
硅胶吸附剂 戊烷 3％二氯甲烷/戊烷 7％二氯甲烷/戊烷 14％二氯甲烷/戊烷 26％二氯甲烷/戊烷 82％二氯甲烷/戊烷 3％乙腈/苯 11％乙腈/苯
氧化铝吸附剂 戊烷 1.5％二氯甲烷/戊烷 4％二氯甲烷/戊烷 8％二氯甲烷/戊烷 13％二氯甲烷/戊烷 34％二氯甲烷/戊烷 54％二氯甲烷/戊烷 84％二氯甲烷/戊烷
（2） 二元混合溶剂的应用
分离复杂混合物时，常采用二元混合溶剂
溶剂A（ 0小）与溶剂B（ 0大）以不同比例混
合时，混合溶剂的 ab
可以在纯A的
0 a
和纯
B的
0 b
之间变化。
即:
0 a
0 b
0 ab
0 a
0 ab
0 b
0
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.35 0.40
溶剂 正戊烷
0 0.00
溶剂 甲苯
0 0.29
石油醚 0.01
丙酮
0.56
环己烷 0.04
乙腈
0.65
二硫化碳 0.15
甲醇
0.95
四氯化碳 0.18
乙二醇 1.1
b. 对不同的吸附剂， 0 的绝对值不同，但 相对强度变化不大。
因为氧化铝、硅胶是极性物质，流动相的极 性小于固定相，所以溶剂强度随着溶剂极性的增 加而增大。
总体性质检测器：测量流动相中总的 物理性质变化（差示折光，电导电检测）
（1） 紫外检测器
光源
氘灯：190－350nm连续波长 氢弧光灯：200－300nm连续波长
汞灯 低压：254nm 中压：280nm
光谱通带：2－5nm
池体
池长：一般为10mm 直径：Φ＝1mm 池体积：8µL左右 池材料：石英
n1－溶剂的折射率 n2－溶质的折射率 c1－溶液中溶剂的浓度分数 c2－溶液中溶质的浓度分数
c1+c2=1 ns-n1=n1c1+n2c2-n1 =n1(1-c2)+n2c2-n1 =c2(n2-n1)
一定稀溶液：折射率之差（ns-n1) c2
优点：适用性好 缺点：①灵敏度较低(10-6g·mL-1)
输入色谱柱。
（2） 高压梯度洗脱装置（内梯度）
由两台或三台高压泵，梯度程序控制器组成。 各台泵将不同溶剂送入混合器，经充分混合后进 入色谱柱。
7.2.4 进样系统
直接注射进样，进样阀，自动进样系统
六通阀动画
7.3.5 检测器
类型
溶质性质检测器：仅对溶质的物理性 质或物理化学性质有响应（紫外、荧 光检测器）
固定相：极性吸附剂 流动相：弱极性的有机溶剂 应用：适于分离不同类化合物或异构体。
不适宜分离同系物，固定相的种类少， 应用不十分广泛。 性能：重现性能差，样品有时会异构化解。
（3）离子色谱
根据离子交换树脂对组分的亲和力不 同而进行分离。 固定相：离子交换剂 流动相：多为缓冲溶液 应用：一般用于分离离子型化合物
R1 4
n
k' 1 k '
a 1 a
流动相性质直接影响 k ', a
流动相的选择对分离起着极其重要的作用
7.4.1 对溶剂的要求
（1）化学稳定性好，不与固定相互溶，不 发生不可逆反应; （2）纯度高; （3）对给定的样品有合适的极性和良好的 选择性; （4）适合于所使用的检测器; （5）粘度低;
适于梯度洗脱
光二极管阵列检测器
由1024(512或211)个光电二极管组成,各检测 特定波长;计算机快速处理，可同时检测 180~600nm波长范围内全部紫外光和可见光波的 信号.可获得A-λ-t三维立体色谱图.
(2)差示折光检测器
测量参比池和样品池之间的折射率之差
溶液的折射率：ns=n1c1+n2c2
④Si－O－Si－C（硅胶与有机硅烷反应产物）
这类固定相是将硅胶表面用有机氯硅烷 或烷氧基硅烷处理。最常用的十八烷的键合 形式可表示如下：
CH3
Si
OH + Cl Si
(CH2)17CH3
CH3
CH3
Si O Si
(CH2)17CH3 + HCl
CH3
通过硅烷化反应导入的基团可以是从强极性 到非极性的官能团，如十八烷基、辛烷基（C8）、 氨基、氰基、苯基等.
（2）泵的种类
① 恒流泵（往复泵，注射泵） 输出流量稳定，与外界阻力变化无关，为
保护泵，设有最高压力限制装置。
② 恒压泵（气动放大泵） 输出压力恒定，流量随色谱体系的压力而
变化。 保留时间重现性差，较少应用。
7.2.3 梯度洗脱装置
（1）低压梯度洗脱装置（外梯度） 常压下溶剂按一定比例混合后再由高压泵
7.3.4 柱的保养
①溶剂用0.5μm孔径的过滤器处理，防止柱堵塞；
②柱的实际操作压力应低于填装时的最高，最好在 最高压力的一半以下；
③防止反冲（流动相逆向流动），否则固定相层位 移，柱效下降；
④使用完柱子后用纯有机溶剂清洗，并将柱子保 存在纯有机溶剂中；
⑤含有强烈滞留组分的样品应使用保护柱。
7.4 流动相及其选择 基本保留方程式：
壁抛光 长度：一般150－250mm，少量30mm短柱，
500mm长柱 内径：一般4－5mm，标准柱径：4.6mm，
痕量分析<3mm，凝胶色谱柱：8mm
7.3.2 固定相的种类 （1）按承受的压力分类 ①刚性固体
以SiO2为基质，表面键合各种官能团，可以 承受压力70－100MPa.
优点：机械强度大，化学稳定性好，容易控 制孔结构和表面积。 缺点：只能在pH＝2 7.5条件下使用，碱度 过大，硅胶容易粉碎溶解，pH太低，连结有机 基团的化学键易断裂。
正相色谱
固定相：极性物质 流动相：非极性或弱极性物质
反相色谱
固定相：极性小的物质 流动相：极性大的物质（水系溶剂）
应用：分离不同类化合物或同系物, 对分离异构体不优越,固定相 的种类多，用途广.
性能：重现性佳，溶质保持稳定
（2）液固吸附色谱（LSC）
基于不同组分吸附能力的差异而进行混合物 的分离。
GC
LC
分析对象：挥发性和 热稳定性高的物质（约 20％的有机物） 流动相：种类少，但组分 没有作用力 操作条件：恒温，压力小
不受分析对象热稳定性 的限制
种类多对分离起很大 作用 室温，高压
7.1.2 高效液相色谱法的分类 （1）液－液分配色谱（LLC）
不同组分在固定相与流动相中的分配 系数差异进行分离。 固定相：涂渍在担体表面或键合到担体 上的固定液。
③ 软胶
葡聚糖，琼胶糖等 用于凝胶过滤色谱中分离水溶性物质。
（2）按表面形状分
①表面多孔：基体是实心玻珠，外覆活性多孔材料， 如硅胶、氧化铝、离子交换剂等，多孔表层薄，孔 浅，传质快，柱效高.
缺点：柱容量小，已较少使用。
② 全多孔型：比表面积大,粒径3-5µm，柱容量高， 保留值大。
缺点：由于孔深，传质阻力大，所以 10 µm以上柱效低。
（4）分子排阻色谱
按分子的尺寸大小进行分离。
凝胶过滤
固定相：亲水性凝胶 流动相：水系溶剂
凝胶渗透
固定相：疏水性凝胶 流动相：有机溶剂
应用： ① 分离分子量大于2000的物质 ② 测高聚物分子量分布 ③ 分离各种大分子（蛋白质，核酸）
7.2 高效液相色谱仪
7.2.1 流动相输送系统
流动相输送系统由过滤器、储液装置，脱气 装置，高压泵、压力脉冲阻尼器、梯度淋洗装置 组成。
定义为溶剂分子在单位吸附表面积A上的吸附自由能，表
征了溶剂分子对吸附剂的亲和程度。
0 Al2O3
Ea A
0越大，k越小，所以溶剂强度参数序列可作为吸附色谱
的洗脱系列
规定：对氧化铝吸附剂，正戊烷 0 0，其余溶剂的 0相对 大小与正戊烷的 0 相比较。
表：氧化铝吸附剂上的溶剂强度参数
荧光强度∝组分浓度 应用：测量在紫外线照射下能发出荧光的物质
优点：①检测限低（10-12g·mL-1） ②选择性强
（4）电化学检测器
检测具有电活性的物质，如含有硝基、 氨基的有机化合物及无机阴、阳离子。
优点：①灵敏度高（10-9g） ②选择性高 ③结构简单
7.3 色谱柱
7.3.1 柱材质与结构 材料：不锈钢、氟塑料 要求：耐高压，抗腐蚀，精密管径，内
光接收元件：光敏电阻，光电管或光电倍增管。
光源
参比池 测量池
光敏电阻1 光敏电阻2
若两池通过的都是纯流动相，则两光敏电阻 接收的辐射强度相等，无信号输出。
当组分进入测量池时，吸收紫外辐射，两光 电阻接收的辐射强度不等，有信号输出。
吸光度：
A lg I参比 ＝ bc
I测量
优点
灵敏度高（10-9g·mL-1） 选择性好 线性范围宽（10-5－10-8） 对温度不敏感
7.4.2 溶剂强度及选择
与色谱分离过程密切相关的最重要的溶剂特性参数 则有溶剂强度参数0、溶解度参数、极性参数P
溶剂强度－流动相将组分从固定相上洗脱 下来的能力
对给定的组分： 溶剂强度 ，k ' , tR
（1）吸附色谱中的溶剂强度
①溶剂强度与溶剂强度参数
a. 吸附剂强度参数 0
吸附色谱的溶剂强度以溶剂强度参数 0 表示
第七章 高效液相色谱法（HPLC）
7.1 概述 7.1.1 两个比较
（1）与经典液相色谱比较
相同点: 分析原理相同 主要差别：固定相的性质、形状、粒度 经典：>10µm的全多孔吸附剂，不均匀， 不耐高压，操作方式为间断式，速度慢。
（2）HPLC 与GC比较
主要差别：作为流动相的液体和气体之间 的性质差别。
溶剂序列
硅胶吸附剂 戊烷 3％二氯甲烷/戊烷 7％二氯甲烷/戊烷 14％二氯甲烷/戊烷 26％二氯甲烷/戊烷 82％二氯甲烷/戊烷 3％乙腈/苯 11％乙腈/苯
氧化铝吸附剂 戊烷 1.5％二氯甲烷/戊烷 4％二氯甲烷/戊烷 8％二氯甲烷/戊烷 13％二氯甲烷/戊烷 34％二氯甲烷/戊烷 54％二氯甲烷/戊烷 84％二氯甲烷/戊烷