CD45和CD90鉴定大鼠骨髓间充质干细胞

每３ ｄ 换液 １ 次， 去除非 贴壁 生长细胞 ， 使 Ｂ ＭＳ Ｃ纯化 。细胞 生 长融合至 ８ ０ ％时 ， 用含 乙二胺 四 乙酸 （ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ） 的０ ． ２ ５ ％的 胰蛋 白酶消化细胞 ， １ ： ３ 传代 ， 传至第 ３代。
１ ． ４ Ｃ Ｄ ４ ５和 Ｃ Ｄ ９ ０对 Ｂ Ｍ Ｓ Ｃ鉴 定 ： 取 生 长 状 态 良好 、 融 合 至 ８ ０ ％的第 ３ 代 Ｂ ＭＳ Ｃ 。 消化离心吹打成单细胞悬液 。 调 整 细 胞
此免疫原性低 ，综上特点 ， Ｍ Ｓ Ｃ移植成为 当今生物治疗 的研
究热点 ， 成 为 细胞 治 疗 的重 要 工 具 。 ＭＳ Ｃ不 仅 存 在 于 骨髓 ， 也
存在 于其他组织如 骨髓 、 脂肪 、 肌肉、 心、 肝、 脐 带血 、 羊水及
胎盘等成体组织 中 ， 但骨髓取材方便 ， 成为 主要 的取材部 位。 ＭＳ Ｃ在骨髓 中含量很小 ， 仅 占骨髓有 核细胞总数 的 ０ ． ０ ０ １ ％～
０． １ ％Ⅲ
，
密度为 ｌ ｘ ｌ ０ ６ ／ ｍ １ ． 取 ２ ０ ０ Ｉ ｘ １ 分别 加入 ４支 Ｅ Ｐ管 中 ． 依次分别
加入适 量 Ｃ Ｄ ４ ５ 、 Ｃ Ｄ ９ ０ 、 Ｃ Ｄ ４ ５和 Ｃ Ｄ ９ ０ ， Ｐ Ｂ Ｓ ，混合 均匀后 ， 避
光３ ０ ａ ｒ ｉ ｎ ， 用Ｐ Ｂ Ｓ 洗涤 ３次 ， 用流式细胞仪检测细胞 阳性率 。 连续 ３次重复试验。 １ ． ５ Ｂ Ｍ Ｓ Ｃ多项分化潜能鉴定 ： Ｂ ＭＳ Ｃ成脂分化 ： 取成取生长 状 态 良好 、 融合 至 ８ ０ ％的 Ｂ ＭＳ Ｃ ， 以２ ｘ １ ０ ５ ／ ｍ ｌ 接种 于 ６孔板 上， 放入 培养 箱中培养 ２ ４ ｈ ， 更换新鲜完全培养液 ， 以后每 隔 ３ ｄ换液 １ 次， 至 细胞完全融 合 ， 加入成脂 诱导 Ａ液 ， 培养 ３ ｄ ， 换 Ｂ液 ， 诱导 １ ｄ ， 如此循环 ３ － ５次后 ， 用 Ｂ液维持 ７ ｄ ， 每
４ ０ — ６ ０ ｇ （ 山西 医科 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供 ） ， 实 验过 程 中对 动
物 的处置 符合 中华人 民共 和 国科 学技 术部 ２ ０ ０ ６年颁 布 的
《 关 于善待实验动物的指导性意见》 标准 。
１ ． ２ 主要试剂 ： 低糖达 氏修正伊 氏培养 基 （ Ｌ — Ｄ ＭＥ Ｍ） 培养液 （ Ｈｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ， 美 国） ；胎牛血 清 （ 杭 州 四季青 ） ； ０ ． ２ ５ ％ 胰蛋 白酶 （ Ｓ ｉ ｇ ｍａ ，美 国） ； 双抗储存液 （ 博士德 ） ； ０ ． ０ １ 磷酸盐缓 冲液
・
１ ６ ４ ６ ・
生旦垫 塑 量堕
生
筮 鲞箜 塑Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｒ ｅ ｍ ｅ ｄ ｉ ｅ ｓ Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ｓ ， Ｄ ｅ ｃ ｅ ｍ ｂ ｅ ｒ ２ ０ １ ４ ， Ｖ ｏ １ ． １ ４ ， Ｎ ｏ ． １ ２
・
基 础 研 究 ・
ｇ ｅ ｎ ｉ ｔ ｏ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， ＭＰ Ｃ ） ， 并继续分化 为脂肪 、 骨、 软骨 、 血管 内皮 、
成纤维 细胞等各种结缔组织细胞 。Ｍ Ｓ Ｃ在 体外 贴壁生长 ． 能
分 泌多种细胞 因子 ， 具有多种 分化潜 能 ， 表 面不表达 主要组 织相容性复合体 （ Ｍ ＨＣ ） 一 Ⅱ分子 ， 仅表达微量 ＭＨ Ｃ — １ 分子 。 因
ｍｉ ｎ ， 弃 上清 ， 加入 Ｌ － Ｄ ＭＥ Ｍ培养液 约 ５ ｍ １ ． 再 次吹打 成单细 胞悬液 ， 调节 细胞密为 ｌ ｘ ｌ ０ ｑ ｍｌ ， 将细胞培养瓶置于恒温细胞
培养箱 中（ 温度 ３ ７℃， 体积 分数 ５ ％Ｃ Ｏ ： ， 饱和湿度 ） 每天于倒
置 相 差 显 微 镜 下 观 察 细胞 形 态 变化 。４ ８ ｈ首 次 全 换 液 ， 以后
（ Ｐ Ｂ Ｓ ） 缓 冲液（ 博士德 ） ； 小 鼠抗 大 鼠 Ｃ Ｄ ４ ５ 一 藻红蛋 白（ Ｐ Ｅ ） 及 小 鼠抗 大 鼠 Ｃ Ｄ ９ ０ ． 异硫氰酸荧光素 （ Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ） 单 克 隆抗 体 （ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｅ —
Ｂ ＭＳ Ｃ的成 骨分化 ： 取生长状态 良好 、 融合至 ６ ０ ％的第 ３
隔３ ｄ 换液 １ 次。 用 油红 Ｏ染 色 。
必须通过体 外培养扩增获得 足够数量 的细胞 ， 因此 ，
对离体培养细胞 进行 鉴定 尤为重要 。本实验 旨在 为体外培养
骨髓间充质干细胞 Ｂ ＭＳ Ｃ提供一种简单肯定 的鉴定方法
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 实验动物 ：清 洁级 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ 雄性大 鼠 ， ４周 龄 ，体质量约
ｇ ｅ ｎ ｄ ， 美 国） ； 成脂诱导液及成骨诱导液（ 赛业 ， 中国） ： 油红 Ｏ 、
代Ｂ ＭＳ Ｃ，以 ３ ｘ １ ０ ４ ／ ｍｌ 接种于 ６ 孔板上 ，放入培养箱 中培养
２ ４ ｈ ， 弃 旧完全培养液 ， 每孔加 入 ２ ｍ ｌ 新鲜 成骨诱 导液进行
培养 ， 以后每 ３ ｄ 换液 １ 次， 诱导 Ｉ ８ ｄ后 ， 用茜素红行钙化结
节染色 。
主要观察指标 ：倒置相差 显微 镜下观察每代细胞形 态 ， 流式细胞仪检测 Ｃ Ｄ ４ ５和 Ｃ Ｄ 源自 ０的阳性表达率 ．分别用 成脂
Ｃ Ｄ ４ ５和 Ｃ Ｄ ９ ０鉴 定 大 鼠骨 髓 间充质 干 细胞
韩 艳 崔建军 李秀花 贾晓静
问充质干细胞 （ ＭＳ Ｃ ） 来源于 中胚层 ， 属非 造血成体干细 胞， 在适 当条件 下 ， 体外 可 以大量 扩增 ， 分 化为 间充质 细胞
（ ｍ ｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ， ＭＣ ） ， 即间充 质祖 细胞 （ ｍ ｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｐ ｒ ｏ —