TaqManMGB双探针实时PCR快速检测_省略_核分枝杆菌rpoB基因多位点突

・论　著・
TaqMan M G B双探针实时PCR快速检测
结核分枝杆菌rpoB基因多位点突变方法的建立
王伟华,刘　伟
(聊城市人民医院中心实验室,山东聊城252000)
摘要:目的　建立快速、灵敏的检测结核分枝杆菌rpoB基因常见突变位点的新方法。

方法　采用TaqMan小沟结合物(M G B)探针技术,检测146例活动性肺结核患者和35例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况,测序方法为参考方法。

结果　146例活动性肺结核患者痰标本中,双探针方法检出阳性118例,其中rpoB基因突变56例,与测序方法比较符合率100.0%;35例非结核性肺部疾病患者痰标本双探针方法检测均为阴性,特异性100.0%;该方法最低检出下限为1×103拷贝/ml。

结论　TaqMan M G B双探针方法能快速、准确地检测结核分枝杆菌rpoB基因位点突变情况,适用于临床对耐药结核分枝杆菌的快速诊断。

关键词:结核分枝杆菌;利福平;rpoB基因;突变
中图分类号:R378.91+1 文献标识码:A 文章编号:100524529(2010)0320324203
R apid Detection of Rifampin Drug2resistant G ene Mutation of Mycobacterium t uberculosis by T aqMan MGB Dual2probe R eal2time PCR
WAN G Wei2hua,L IU Wei
(L i aocheng People′s Hos pit al,L i aocheng,S handong252000,Chi na) Abstract:OB JECTIVE To establish a new methed rapid,and sensitive detection of M ycobacteri um tuberculosis rpoB gene mutation.METH ODS M.tuberculosis rpoB gene mutation was detected by TaqMan minor groove binder (M G B)dual2probe real2time PCR with sputum of146active pulmonary tuberculosis patients and35non2 tuberculous pulmonary patients.Sequence analysis was regarded as a reference method.RESU LTS Totally146 sputum samples f rom active pulmonary tuberculosis patients were detected by TaqMan M G B dual probe method from them118were positive,of which rpoB gene mutation were found in56samples.It was competely accordant with the results by sequence analysis.The sensitivity of TaqMan M G B dual2probe was1×103copies/ml.
CONC L USIONS The method could detec the mutations of rpoB gene rapidly and accurately and could be used in diagnosis of rifampin drug2resistance in clinic.
K ey w ords:M ycobacteri um tuberculosis;Rifampin;rpoB G ene;Mutation
多药耐药结核病(MDR2TB)被W HO认定为全球结核病疫情回升的主要原因之一。

由于90%的结核分枝杆菌对利福平(RFP)耐药株同时也对异烟肼(IN H)耐药,因而RFP耐药被认为是多药耐药的重要性标志[1]。

RFP的耐药与其DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位编码基因(rpoB)的突变有关[2]。

目前检测rpoB基因突变的方法有多种,对有效降低耐药菌株在人群中医源性扩散并快速制定最佳抗结核方案十分重要。

本研究应用的TaqMan M G B双探针实时PCR技术结合了M G B探针的高度特异和实时PCR快速灵敏的优点,检测结核分枝
收稿日期:2009209214;　修回日期:2009211220杆菌利福平耐药基因突变,取得较好结果。

1　材料与方法
1.1　临床资料　146例临床诊断为活动性肺结核患者全部来自2005年5月～2008年12月聊城市人民医院传染科门诊及住院部,其中男82例,女64例,年龄24～69岁。

35例非结核性肺部疾病(慢性支气管炎18例,肺炎、肺部感染12例,肺癌5例)来自呼吸科、肿瘤科住院部,其中男20例,女15例,年龄39～71岁。

嘱患者(结核患者停抗结核药3d)留取晨痰2～5ml送检。

涂片抗酸染色、罗氏培养、PCR扩增rpoB基因均采用患者的同份晨痰标本进行。

1.2　试剂与仪器　荧光定量PCR仪为美国ABI
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・Chin J Nosocomiol Vol.20No.32010
公司7300;引物及探针由上海生工有限公司合成; PCR试剂盒、基因组DNA提取试剂盒等PCR试剂均购自Promega公司。

结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程公司(国药准字S2*******),改良罗氏培养基自配。

1.3　试验方法
1.3.1　痰涂片抗酸染色及罗氏培养　菌型鉴定操作方法参见《结核病诊断细菌学检验规程》[3]。

1.3.2　结核分枝杆菌DNA制备　4倍体积4% NaO H液化痰液,吸取1ml标本混悬液移入1.5ml 离心管内,12000r/min离心5min,吸弃上清液。

沉淀用Promega公司基因组提纯试剂盒提取DNA。

DNA溶于TE缓冲液中,-20℃保存待检。

1.3.3　结核分枝杆菌DNA定量检测　对所有标本进行结核分枝杆菌DNA测定,严格按照结核分枝杆菌DNA荧光定量PCR检测试剂盒操作,在ABI7300荧光定量PCR扩增仪上测定,PCR程序如下:37℃5min,94℃1min;94℃5s,60℃30s,共40个循环。

1.3.4　结核分枝杆菌rpoB点突变检测　引物和探针的设计:将GenBank中的结核分枝杆菌进行计算机对比分析、设计一对特异性扩增rpoB特定片段的引物,产物长度363bp。

根据rpoB基因已知常见突变位点(包括531、526、516、520、522位点),设计5条V IC标记的M G B探针和1条FAM标记的结核分枝杆菌特异性探针。

见表1。

表1　根据rpoB基因序列设计的引物和探针引物或探针序列(5′→3′)
rpoB引物ACACCGCA GACGT T GA TCA
CTA GT GA T GGCGGTCA GGTAC
M G B探针rpo520/524VIC2TCAACCCCGACA GC2M G B
rpo510/514VIC2CCA T GAA T T GGCTCA GC2M G B
rpo514/520VIC2T TCA T GGACCA GAACAA2M G B
rpo529/533VIC2CA GCGCCGACA GT2M G B
rpo524/529VIC2T GACCAACAA GCGC2M G B
结核分枝杆菌FAM2TCT TCGGCACCA GC2M G B
　特异性探针
TaqMan M G B双探针实时PCR检测:将引物与探针用双蒸水溶解,使终浓度为10μmol/L。

按照每个反应管检测1个标本1个突变位点来配制PCR反应液,即每个反应管里都有1条结核分枝杆菌特异性探针和1条包括突变位点的M G B探针。

反应液组成为:10×缓冲液2.5μl,引物、探针和DNA聚合酶(1U/μl)各1μl,模板2μl,双蒸水补足到25μl。

置于PCR仪上扩增。

循环条件为:94℃4min,94℃30s、60℃30s、72℃30s×40个循环,72℃时采集荧光。

荧光通道检测选择:结核分枝杆菌DNA定量检测选用FAM通道,rpoB 变异检测选用V IC通道。

1.3.5　DNA测序分析　将PCR产物送上海生工公司进行序列分析,以检测扩增的特异性和准确性。

1.3.6　敏感度、重复性试验　将已确定结核分枝杆菌DNA浓度的标本(1×107拷贝/ml)用TE缓冲液10倍梯度稀释,平行做4个反应,以稳定检测TB DNA阳性最低模板量作为该方法的最低检测值。

2　结　果
2.1　146例活动性肺结核患者痰标本　涂片抗酸染色阳性45例,阳性率30.8%。

罗氏培养阳性102例,阳性率69.9%。

菌型鉴定结核分枝杆菌96例,非结核分枝杆菌6株。

TB DNA定量试剂盒检测与双探针实时PCR检测结果相同,均检出118例阳性标本,阳性率80.8%。

35例非结核肺部疾病患者痰标本涂片抗酸染色、罗氏培养、双探针实时PCR 扩增均为阴性结果,特异率100.0%。

2.2　TaqMan M G B双探针实时PCR检测结果　rpoB基因无突变62例,rpoB基因有突变56例,其中531位突变35例,526位突变14例,516位突变6例,531、526双位点联合突变1例。

2.3　测序分析结果　TaqMan M G B双探针实时PCR方法检测的结核分枝杆菌rpoB基因突变的结果与DNA测序结果完全相符。

根据测序结果可判断出rpoB基因突变形式,531位点突变形式为TCG(Ser)→T T G(Leu);526位点突变形式为CAC (His)→GAC(Asp);516位点突变形式为G AC(Asp)→T AC(T yr)。

见突变位点测序图谱。

见图1。

2.4　敏感度及重复性　TaqMan M G B双探针实时PCR方法检测的敏感度及重复性:最低检出下限为1×103拷贝/ml,重复性良好。

结果见图2。

3　讨　论
目前实时荧光定量PCR技术因其国际公认的准确度高、重现性好的特点广泛用于基因表达研究、转基因研究、药物疗效考核和病原体检测等诸多领域。

TaqMan M G B探针是应用在实时定量PCR中进行特异PCR产物定量检测的一种荧光探针。

由于该探针的3′端连接有DNA双链小沟结合物(M G B),提高了探针与靶序列的结合力[4],因此,该类探针碱基序列较短,适合在A+T含量较高的DNA区域设计探针,是分析单碱基突变的有效工
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中华医院感染学杂志2010年第20卷第3期
图1　rpoB
基因区突变位点基因测序图
　①1×107拷贝/ml ;②1×106拷贝/ml ;③1×105拷贝/ml ;④1×　104拷贝/ml ;⑤1×103拷贝/ml ;⑥<1×103拷贝/ml 及空白阴性　对照。

图2　重复性实验结果图
具。

rpoB 基因编码区突变主要发生在507～533位
的27个氨基酸(81bp )组成的区域内,且以点突变最多[5]。

本研究通过GenBank 检索结核分枝杆菌rpoB 基因库,得到rpoB 基因序列,利用Oligo Blast
软件设计5条V IC 标记的M G B 探针,覆盖这一区域531、526、516、520和5225个常见突变位点,另设计1对结核分枝杆菌特异性引物和1条FAM 标记的结核分枝杆菌特异性探针。

在同一试管内包含两种荧光标记探针,TaqMan 探针针对TB 保守区,FAM 荧光素作为报告基团;M G B 探针针对rpoB 热
点突变区,V IC 荧光素作为报告基团。

监测荧光PCR 仪上双通道试验数据,既可以检测TB DNA 载
量,又可以判断rpoB 是否发生变异。

经在AB I 7300上完成荧光定量PCR 操作后,无须进行后处
理,直接判读。

减少临床检测的复杂度,加快患者的取报告时间。

多年来,人们对结核分枝杆菌rpoB 基因突变的检测使用临床分离株研究较多,由于以临床标本中获得结核分枝杆菌分离株,需要4～6周,难以满足临床的需要。

我们采用灵敏度高、特异性好的双探
针实时PCR 直接扩增146例活动性肺结核患者晨
痰标本中的结核分枝杆菌rpoB 基因118例阳性,阳性率为80.8%,与菌培养结果相比假阴性、假阳性均有效降低;检测到rpoB 基因无突变62例,rpoB 基因有突变56例,其中531位突变35例,526位突变14例,516位突变6例,531、526双位点联合突变1例,与DNA 测序结果完全相符;对35例非结核肺部疾病患者痰标本和6例分离出非结核分枝杆菌的痰标本进行TaqMan M G B 双探针实时PCR 扩增全为阴性结果,特异性100.0%;该方法经过敏感度实验,最低检出下限为1×103拷贝/ml 。

TaqMan M G B 双探针实时PCR 方法从标本采集到判断结果只需几小时,操作简便,敏感度高,特异性好,结果准确,且整个试验的扩增检测均在一个密闭体系中进行,减少了样本和扩增体系本身对环境的污染。

因此,我们认为此方法可作为临床上迅速判断结核患者对RFP 耐药性的有效手段,有利于医师尽早选择有效的抗结核药物进行治疗。

参考文献:
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耐利福平分离株rpoB 基因突变的研究[J ].中华医院感染学杂志,2005,15(8):8412844.
[3]　中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J ].中国防痨杂
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