甲基化引物探针设计方法
引物探针验证的实验方法
引物探针验证的实验方法在分子生物学领域，引物探针验证是一种常用的实验方法，用于检测目标DNA序列的存在与数量。
本文将详细介绍引物探针验证的实验方法，包括实验原理、实验步骤、注意事项等方面，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、实验原理引物探针验证实验基于聚合酶链式反应（PCR）技术，通过设计特定的引物和探针，使目标DNA序列在PCR过程中特异性扩增，并通过探针检测扩增产物，从而实现对目标序列的定量分析。
二、实验步骤1.设计引物和探针：根据目标DNA序列，设计特异性引物和探针。
引物长度一般为20-25个核苷酸，探针长度一般为15-25个核苷酸。
2.提取模板DNA：从待测样本中提取DNA，作为PCR反应的模板。
3.配制PCR反应体系：根据实验需求，配制含有引物、探针、dNTPs、DNA聚合酶等试剂的PCR反应体系。
4.PCR扩增：将PCR反应体系放入PCR仪中，进行以下循环扩增：- 94℃预变性5分钟；- 94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30-40个循环；- 72℃延伸5分钟。
5.分析PCR产物：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带的大小和亮度，初步判断实验结果。
6.探针检测：将PCR产物与标记有荧光的探针进行杂交反应，通过荧光检测仪分析荧光信号，实现对目标序列的定量分析。
三、注意事项1.引物和探针设计：确保引物和探针的特异性，避免非特异性扩增。
2.模板DNA提取：保证模板DNA的质量和浓度，以获得可靠的实验结果。
3.PCR反应体系：根据实验需求，调整各试剂的浓度和比例。
4.PCR扩增：严格控制PCR反应条件，避免扩增过程中的污染。
5.结果分析：结合琼脂糖凝胶电泳和荧光检测，综合判断实验结果。
四、实验总结引物探针验证实验是一种准确、高效的分子生物学检测方法。
通过掌握实验原理和步骤，严格遵循注意事项，可以获得可靠的实验结果。
荧光定量pcr甲基化检测指导原则
荧光定量pcr甲基化检测指导原则1.引言荧光定量PCR甲基化检测是一种常用的分子生物学技术，用于研究DNA 甲基化的程度和模式。
DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，对基因表达和细胞分化起着重要作用。
因此，准确、可靠地检测DNA甲基化状态对于研究生物学过程、疾病诊断和治疗具有重要意义。
本文旨在介绍荧光定量PCR甲基化检测的原则和方法，以帮助研究人员准确地进行该项实验。
2.实验准备2.1 样本采集与处理收集目标组织或细胞样本，并根据需要进行适当处理。
样本处理过程中应避免DNA污染或降解。
2.2 DNA提取选择适当的DNA提取方法，根据样本类型选择合适的提取试剂盒，并按照说明书进行操作。
确保提取到高质量、高纯度的DNA。
3.荧光定量PCR反应体系设计3.1 选择引物与探针根据目标位点设计合适的引物与探针。
引物应具有高特异性，避免引物间的相互作用。
探针应具有高亲和性和特异性，以确保准确的信号检测。
3.2 反应体系优化根据实验需要优化反应体系的浓度和组分。
反应体系包括模板DNA、引物、探针、酶和缓冲液等。
3.3 荧光信号检测选择适当的荧光信号检测方法，如荧光增长曲线分析或终点荧光分析。
根据实验需要选择合适的荧光通道。
4.标准曲线与定量分析4.1 构建标准曲线根据实验需要构建合适的标准曲线，以定量目标DNA甲基化程度。
标准曲线可以使用合成DNA片段或已知甲基化程度的DNA样本构建。
4.2 定量分析根据标准曲线对样本中目标位点甲基化程度进行定量分析。
计算每个样本中目标位点甲基化水平，并进行统计学分析。
5.质量控制与结果解读5.1 质量控制在每个实验中设置质量控制样本，用于检测实验的准确性和可重复性。
确保实验结果的可靠性。
5.2 结果解读根据定量分析结果，解读样本中目标位点的甲基化状态。
根据实验目的和研究问题进行结果分析和讨论。
6.实验注意事项6.1 防止DNA污染在实验过程中，应注意避免DNA污染。
使用无菌、无DNA污染的试剂和器具，并在操作过程中避免接触裸露的DNA。
甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)-2
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）-2此步细节：1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。
因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。
第四部分修饰后DNA用于PCR这一步也没有悬念。
我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。
如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。
如果不是这样，还是参考文献更好些。
首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。
查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。
然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。
用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。
我也是按此行事，算比较顺利。
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。
我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。
有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。
如何选择，可以根据自己的情况。
初作者还是用好一点的酶。
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。
其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。
甲基化特异性PCR(MSP)原理与引物设计说明
MSP原理其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。
扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。
引物设计原则标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外,“MethPrimer”应用3′端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。
因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。
DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列,设计引物。
对于BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。
对于MSP需要设计2对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。
根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。
MSP引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的3′端至少包含1个CpG位点,我们可以自己设定CpG的“C”距3′末端的最远距离。
“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”。
②引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。
③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端应处于相同的CpG位点。
如果,2对引物不在相同的CpG位点退火, PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。
但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。
甲基化引物探针设计方法
本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。
Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。
专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用/methprimer/，较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此网站也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。
submit后就有转化后的序列信息，如下图：以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word内标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议：Primer设计的基本原则：a)引物长度一般在18-35mer。
b)G-C含量控制在40-60%左右。
c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
g)退火温度Tm控制在58-60C左右。
h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
TaqMan 探针设计的基本原则：a)TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
b)长度一般为18-40mer 。
c)G-C含量控制在40-80%左右。
d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
e)在引物的5’端避免使用G。
f)选用比较多的碱基C。
g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。
另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。
DNA甲基化PCR引物的设计
DNA甲基化PCR引物的设计2010-08-03 12:01DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。
有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[1]。
目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)是研究DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。
国外互联网上有1个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测CpG岛,根据实验者要求设计硫化测序PCR(bisulfate-sequencing PCR, BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)引物。
本研究旨在介绍甲基化特异性PCR 引物设计的原则及“MethPrimer”设计程序的使用方法和有关注意事项。
1 材料与方法1. 1 序列的转换DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP。
1. 2 CpG岛的预测[2]哺乳类动物基因组中5% ~10%是CpG(二核苷酸),其中70% ~80%呈甲基化状态,称为甲基化的CpG(mCpG)。
CpG的聚集称CpG岛,已知在所有管家基因和一些组织特异基因的5′端调控区均有CpG岛呈高度甲基化,基因组中平均100个bp 有1个跨度为0. 5~5 kb的CpG岛。
“MethPrimer”设计程序默认的CpG岛跨度至少为200 bp,GC含量>50%,CpG 出现频率>0. 6。
甲基化实验方法和步骤
实战经验：甲基化检测方法总结——（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA 比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA 的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第一天只需下午半天即可下午3点开始，先配好试剂再开始做实验需提前消毒的物品：1.5mlEP管一大盒，双蒸水200ml，15ml离心管，开水浴锅，第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至45ul【20ulDNA+25ul双蒸水】；2：加5ul新鲜配制的3M NaOH【0.12g定容到1ml，用1.5mlEP管配制】；3： 42℃水浴30min；水浴完后把水浴锅调至50℃水浴期间配制： 4：20mM对苯二酚氢醌【0.022g氢醌定容至10ml，用15ml离心管配】，加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：用15ml离心管配，1.88 g 亚硫酸氢钠使用3ml 双蒸水稀释，【一次性加350ul 3M NaOH，，然后谨慎每次加入10ul 3M NaOH仔细观察】并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
甲基化引物探针设计方法
本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。
Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。
专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用/methprimer/，较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。
submit后就有转化后的序列信息，如下图：以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议：Primer设计的基本原则：a)引物长度一般在18-35mer。
b)G-C含量控制在40-60%左右。
c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
g)退火温度Tm控制在58-60C左右。
h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
T aqMan 探针设计的基本原则：a)T aqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
b)长度一般为18-40mer 。
c)G-C含量控制在40-80%左右。
d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
e)在引物的5’端避免使用G。
f)选用比较多的碱基C。
g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。
另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。
探针法引物设计原理
探针法引物设计原理今天来聊聊探针法引物设计原理。
探针法在分子生物学领域就像是一个敏锐的侦探，能够精准地找出我们想要检测的特定DNA序列。
引物在这个过程中可是相当重要的角色哦。
先从生活现象来理解一下吧，想象我们要在一个很大的图书馆里找到特定的一本书，这个图书馆里有成千上万册不同的书（相当于各种DNA序列）。
引物就像是我们事先知道的关于这本书的一些特殊线索，比如书名中的某个独特单词或者作者名字的部分内容。
说到探针法引物设计的原理呢，这可有点像设计一个寻宝路线。
首先，我们得确定这个引物的长度。
如果太短了，就像你给的线索太短，可能会在一堆相似的东西里找到好多并非我们真正要找的目标，在DNA世界里就是可能会和很多相似的非目标序列结合。
如果太长了，又像线索过于复杂冗长，找寻起来不方便，而且合成成本也会变高。
老实说，我一开始也不明白为啥引物的退火温度也那么重要。
后来才知道这就好比是和目标“接头”的合适温度。
想象你和一个人约定在某个地方见面，如果温度太高（环境过热），你们可能就匆匆错过（引物和模板不能正确结合）；温度太低（环境过冷），可能又有很多其他不合适的人会凑上来（会和非特异序列结合）。
说到这里，你可能会问那引物的特异性是怎么来保证的呢？这就要说到我们要在设计的时候尽量让引物的序列和我们的目标DNA序列独特的区域相匹配。
这就好比你找一个很有特点的人，他有一些别人都没有的外貌或者行为特征。
比如说在一个人群中（众多DNA序列），有个人戴了一顶特别古怪形状的帽子（目标序列独有的特征，对应引物特异性序列），你就可以很容易通过这个特征（引物特异结合）把他找出来。
从学习过程来讲，我当时做实验的时候，就发现如果不注意引物的设计，整个检测就会乱七八糟的。
这就像是你走在一条规划错误的寻宝路线上，肯定只能空手而归。
在实际应用中，比如说检测某种疾病的特定基因，只要引物设计得好，就能迅速而且准确地找到这个基因的存在与否。
不过呢，我也知道这里面还有些复杂的东西我没完全搞懂，比如在复杂的基因组情况下，怎样才是引物设计的最佳方案，可能还需要更多的实验和研究去探索。
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本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。
Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。
专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用/methprimer/，较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。
submit后就有转化后的序列信息，如下图：
以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议：
Primer设计的基本原则：
a)引物长度一般在18-35mer。
b)G-C含量控制在40-60%左右。
c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
g)退火温度Tm控制在58-60C左右。
h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
TaqMan 探针设计的基本原则：
a)TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
b)长度一般为18-40mer 。
c)G-C含量控制在40-80%左右。
d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
e)在引物的5’端避免使用G。
f)选用比较多的碱基C。
g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。
另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。
打开软件，有以上几种方式可以建立新的序列文件，建立好的文件可保存，下次继续处理，此处直接复制转化后的序列。
建立好的用来设计引物和探针的序列。
如果选择自动搜索，选择如下菜单，选择后弹出相应的设置项。
Search for Primer& Probes的主要设置项目在Parameters和Ranges两个子项中。
以上根据优化后的PCR反应体系调整，这里主要是反应体系中各离子浓度。
对于甲基化PCR影响较大的应该是镁离子浓度，如果需要可以重点优化一下。
Constraints是各约束条件设置，每个设置项在帮助文件中有详细解释，我在这里只设置Primer Length和Tm值相关的选项，前边的锁形标记表示强制要求和建议要求。
对于甲基化PCR，有一种理论认为增加引物长度（30mer左右）减小产物长度（小于150mer）能增加PCR反应的敏感性，即更容易得到扩增，经过尝试，有一定效果。
Search Ranges选项，做一些序列位置和产物长度的限定。
除以上提到的设置条件，其他条件可根据项目含义调整，如果不了解则使用默认设置即可。
以上条件都设置后，可能会出现Search Filed的情况，是因为设置的条件无法满足，此时需要修改为更宽松的条件，另外如果序列太长Search时间可能会较长。
Seacrh完成后，如下图，这里同时调出Current Oligo和Selected Oligos的Key Info，如下图：
这里最重要的信息是Score，基本上大于700points的，据我测试都能成功，可见此处的算法比较合理。
本人还做个一个实验，用不同软件对同一段序列设计引物探针，相互评估，就算完全一样的序列各自计算出的不管是Tm值还是其他分数都差距不小，所以只能选择一个软件设计的合成后测试了，Oligo7是目前设计使用成功率较高的一个，差别的原因是各家算法不同，部分软件会给出详细的计算公式，如果感兴趣可以查看了解。
虽然指定了大致设计位置，但以上设计的引物探针位置不一定是我们需要的位置，特别是我们需要指定某几个CpG被包含的情况，这就需要用到软件的评估功能了。
打开Edit菜单下的对话框，其中用Upper Oligo或Lower Oligo表示Probe，分别为正链和反链互补序列。
打开编辑框后，根据自身需求调整引物和探针的长度及位置，输入下图中的编辑框后确认，这里主要需要关注如下图红色框中的信息，原则有几点：
a)Edit Foward Primer输入正向序列，Edit Foward Primer输入反向互补序列，Edit
Upper/Lower Primer输入正向/反向互补序列，每项编辑后点击确认小勾，相应的参数会列出，这里重点调出Analyze下的Key Info和Composition& Tm两个选项，对应每个引物或探针的信息。
b)修改后得到的Score是根据前述Search中设置的参数得来，所以这里需要设置的相
关参数也是在前述相同的Search选项下修改，其中的诸如Primer Length，Primer Tm Range等参数的设置同样会影响最后的Score，详见Search Parameters下的Scores 选项卡，所以如果有相关不适宜的设定，可能会降低Score值。
c)关于Tm值，此软件列出了3中不同算法的Tm值，对于引物，3种算法的Tm值会相
近，如果不能满足，以nearest neighbor method算法的Tm值为准，此处的探针法的引物以接近60℃为优。
对于探针，以nearest neighbor method算法的Tm值为准，另外两种算法会偏高，以接近70℃为优。
d)关于Score，如果Length和Tm以及其他辅助项，如G+C含量等，基本符合要求后，
Score只要大于700即为优秀，越高越好，这里主要考量了除目标参数外，还有二级结构，错配等各方面，分数越高则排除的越多。
以上，即为探针法甲基化特异性PCR的设计方法，对于其他PCR，原理相同，设计完后就可以合成了，至于如何判断设计的引物探针是有效的，那，就只能PCR后看结果了。
VECTOR 2015.9。