甲基化引物探针设计方法
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本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法,目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多,都有使用成功的案例,经过初步多方尝试,本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业,参数详尽且可自由设置,模块化设计,学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换,有较多的在线工具和联机软件都可实现,这里使用/methprimer/,较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中,此也可直接用于相关引物的设计,不过本人没使用过,因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息,如下图:
以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C,可直接复制到Word标注使用,下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了,如果是设计非甲基化引物探针,则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数,主要参考invtrogen的建议:
Primer设计的基本原则:
a)引物长度一般在18-35mer。
b)G-C含量控制在40-60%左右。
c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
f)避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。
g)退火温度Tm控制在58-60C左右。
h)如果是设计点突变引物,突变点应尽可能在引物的中间。
TaqMan 探针设计的基本原则:
a)TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp),但不能与引物重叠。
b)长度一般为18-40mer 。
c)G-C含量控制在40-80%左右。
d)避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。
e)在引物的5’端避免使用G。
f)选用比较多的碱基C。
g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。
另:目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置,保证扩增特异性,对于甲基化,则最好是C。
打开软件,有以上几种方式可以建立新的序列文件,建立好的文件可保存,下次继续处理,此处直接复制转化后的序列。
建立好的用来设计引物和探针的序列。
如果选择自动搜索,选择如下菜单,选择后弹出相应的设置项。
Search for Primer& Probes的主要设置项目在Parameters和Ranges两个子项中。
以上根据优化后的PCR反应体系调整,这里主要是反应体系中各离子浓度。对于甲基化PCR影响较大的应该是镁离子浓度,如果需要可以重点优化一下。
Constraints是各约束条件设置,每个设置项在帮助文件中有详细解释,我在这里只设置Primer Length和Tm值相关的选项,前边的锁形标记表示强制要求和建议要求。对于甲基化PCR,有一种理论认为增加引物长度(30mer左右)减小产物长度(小于150mer)能增加PCR反应的敏感性,即更容易得到扩增,经过尝试,有一定效果。
Search Ranges选项,做一些序列位置和产物长度的限定。
除以上提到的设置条件,其他条件可根据项目含义调整,如果不了解则使用默认设置即可。以上条件都设置后,可能会出现Search Filed的情况,是因为设置的条件无法满足,此时需要修改为更宽松的条件,另外如果序列太长Search时间可能会较长。
Seacrh完成后,如下图,这里同时调出Current Oligo和Selected Oligos的Key Info,如下图:
这里最重要的信息是Score,基本上大于700points的,据我测试都能成功,可见此处的算法比较合理。本人还做个一个实验,用不同软件对同一段序列设计引物探针,相互评估,就算完全一样的序列各自计算出的不管是Tm值还是其他分数都差距不小,所以只能选择一个软件设计的合成后测试了,Oligo7是目前设计使用成功率较高的一个,差别的原因是各家算法不同,部分软件会给出详细的计算公式,如果感兴趣可以查看了解。
虽然指定了大致设计位置,但以上设计的引物探针位置不一定是我们需要的位置,特别是我们需要指定某几个CpG被包含的情况,这就需要用到软件的评估功能了。
打开Edit菜单下的对话框,其中用Upper Oligo或Lower Oligo表示Probe,分别为正链和反链互补序列。
打开编辑框后,根据自身需求调整引物和探针的长度及位置,输入下图中的编辑框后确认,这里主要需要关注如下图红色框中的信息,原则有几点:
a)Edit Foward Primer输入正向序列,Edit Foward Primer输入反向互补序列,Edit
Upper/Lower Primer输入正向/反向互补序列,每项编辑后点击确认小勾,相应的参数会列出,这里重点调出Analyze下的Key Info和Composition& Tm两个选项,对应每个引物或探针的信息。
b)修改后得到的Score是根据前述Search中设置的参数得来,所以这里需要设置的相
关参数也是在前述相同的Search选项下修改,其中的诸如Primer Length,Primer Tm Range等参数的设置同样会影响最后的Score,详见Search Parameters下的Scores 选项卡,所以如果有相关不适宜的设定,可能会降低Score值。
c)关于Tm值,此软件列出了3中不同算法的Tm值,对于引物,3种算法的Tm值会相
近,如果不能满足,以nearest neighbor method算法的Tm值为准,此处的探针法的引物以接近60℃为优。对于探针,以nearest neighbor method算法的Tm值为准,另外两种算法会偏高,以接近70℃为优。
d)关于Score,如果Length和Tm以及其他辅助项,如G+C含量等,基本符合要求后,
Score只要大于700即为优秀,越高越好,这里主要考量了除目标参数外,还有二级结构,错配等各方面,分数越高则排除的越多。