3、引物和探针设计
基因探针设计方法
基因探针设计方法引言：基因探针是一种用于检测、鉴定和定量基因组中特定序列的工具。
基因探针设计方法是指在设计基因探针时所采用的一系列策略和技术。
本文将介绍几种常见的基因探针设计方法。
一、序列比对法序列比对法是一种常见的基因探针设计方法。
该方法首先通过比对已知基因组中的目标序列和待测样本中的序列，找出两者之间的相同和差异。
然后，根据差异的部分设计探针，以便在待测样本中检测目标序列的存在。
二、引物法引物法是一种常用的基因探针设计方法。
该方法通过设计一对引物，其中一个引物与目标序列的前端相互配对，另一个引物与目标序列的后端相互配对。
然后，在PCR反应中使用这对引物来扩增目标序列。
通过引物的设计和优化，可以提高扩增的特异性和效率。
三、杂交法杂交法是一种常见的基因探针设计方法。
该方法基于DNA或RNA 的互补配对原理，设计一条探针序列与目标序列互补配对。
当待测样本中存在目标序列时，探针与目标序列发生杂交。
通过检测杂交信号的强度或位置，可以判断目标序列的存在与否。
四、测序法测序法是一种高精度的基因探针设计方法。
该方法通过对待测样本进行DNA或RNA测序，获得样本中的所有序列信息。
然后，根据需要设计探针，以便在测序结果中检测目标序列的存在。
测序法能够提供更为准确和全面的信息，但相对来说成本较高。
五、基因芯片法基因芯片法是一种高通量的基因探针设计方法。
该方法通过将大量的基因探针固定在芯片上，然后将待测样本与芯片上的基因探针进行杂交。
通过检测杂交信号的强度或位置，可以判断待测样本中基因的表达水平或存在与否。
六、机器学习法机器学习法是一种基于人工智能的基因探针设计方法。
该方法通过训练计算机模型，使其能够从大量的基因组数据中学习，并根据学习结果设计探针。
机器学习法能够充分利用大数据的优势，提高基因探针设计的准确性和效率。
七、优化算法法优化算法法是一种基于数学优化理论的基因探针设计方法。
该方法通过建立数学模型，并使用优化算法来求解最优解。
引物探针设计简介
引物探针设计简介已有2993 次阅读2009-1-1 20:48|个人分类:课堂集锦|系统分类:科研笔记1．寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。
所选的引物序列将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。
一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。
计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。
通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。
因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。
需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5'端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。
2．基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
特异性是指发生错误引发的频率。
特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。
如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。
引物和探针设计
引物和探针设计 –PCR 和定量PCR基本原理引物设计的重要因素针对特殊应用的其他提示引物的质量和纯度目录1247基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3'-羟基由相配的引物提供。
引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。
这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。
在延长过程中，RNA 引物降解并由DNA取代。
体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。
通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。
对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
在开始引物设计之前，必须弄清以下几点：PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型）PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP)1引物设计的重要因素2有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。
它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。
最流行的软件为Primer 3，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。
典型的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。
非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。
应避免编码单一序列和重复序列的引物。
引物长度和专一性引物的GC 含量应介于40%和60%之间。
应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。
最常用的解链温度计算公式显示如下。
“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。
引物探针验证的实验方法
引物探针验证的实验方法在分子生物学领域，引物探针验证是一种常用的实验方法，用于检测目标DNA序列的存在与数量。
本文将详细介绍引物探针验证的实验方法，包括实验原理、实验步骤、注意事项等方面，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、实验原理引物探针验证实验基于聚合酶链式反应（PCR）技术，通过设计特定的引物和探针，使目标DNA序列在PCR过程中特异性扩增，并通过探针检测扩增产物，从而实现对目标序列的定量分析。
二、实验步骤1.设计引物和探针：根据目标DNA序列，设计特异性引物和探针。
引物长度一般为20-25个核苷酸，探针长度一般为15-25个核苷酸。
2.提取模板DNA：从待测样本中提取DNA，作为PCR反应的模板。
3.配制PCR反应体系：根据实验需求，配制含有引物、探针、dNTPs、DNA聚合酶等试剂的PCR反应体系。
4.PCR扩增：将PCR反应体系放入PCR仪中，进行以下循环扩增：- 94℃预变性5分钟；- 94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30-40个循环；- 72℃延伸5分钟。
5.分析PCR产物：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带的大小和亮度，初步判断实验结果。
6.探针检测：将PCR产物与标记有荧光的探针进行杂交反应，通过荧光检测仪分析荧光信号，实现对目标序列的定量分析。
三、注意事项1.引物和探针设计：确保引物和探针的特异性，避免非特异性扩增。
2.模板DNA提取：保证模板DNA的质量和浓度，以获得可靠的实验结果。
3.PCR反应体系：根据实验需求，调整各试剂的浓度和比例。
4.PCR扩增：严格控制PCR反应条件，避免扩增过程中的污染。
5.结果分析：结合琼脂糖凝胶电泳和荧光检测，综合判断实验结果。
四、实验总结引物探针验证实验是一种准确、高效的分子生物学检测方法。
通过掌握实验原理和步骤，严格遵循注意事项，可以获得可靠的实验结果。
探针设计的原则是什么？
探针设计的原则是什么？
1. 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
2. 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
3. 扩增长度应不超过400bp，理想的扩增长度在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
4. 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
5. 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G （不能有4个连续的G）。
6. 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
在原理上与引物设计是比较类似的。
只是因为探针序列要求匹配度很高，所以对于探针的GC含量和Tm值都是有严格要求的，而且还要考虑到与上下游引物相匹配。
假如你手头已经有了染料法的引物，然后想仍然使用这一对引物、在这一对引物对应的序列中间选一段作为探针可以吗？我们不建议这么做。
因为你单独设计的上下游引物没问题，单独设计的探针看起来也没问题，但把引物与探针放在一起，就有可能出现参数不兼容的问题。
所以还是三者放在一起设计才好。
引物探针区别_国际标准_解释说明以及概述
引物探针区别国际标准解释说明以及概述1. 引言1.1 概述引物和探针在生物学和分子生物学研究中起着至关重要的作用。
它们是使用特定序列来检测或扩增DNA或RNA分子的小片段。
通常情况下，引物和探针被设计成与目标DNA或RNA序列互补。
1.2 文章结构本文将详细介绍引物和探针的定义及其作用，并对它们之间的区别进行阐述。
同时，我们还将解释国际标准对于引物和探针的规范并对相关条款进行说明。
最后，我们将总结引物和探针的区别以及它们在不同应用场景中的作用，并提出对国际标准的评价与建议。
1.3 目的本文旨在帮助读者更好地理解引物和探针的概念、作用以及它们之间的区别。
此外，通过解释国际标准对于引物和探针的规范要求，了解如何正确地设计和使用这些分子工具。
通过阐明引物和探针在科学研究中的重要性，可以提高读者对于这些技术应用的认识水平，并为进一步开展相关研究提供基础知识。
2. 引物和探针的定义及作用2.1 引物的含义和作用引物是指在DNA分子复制、扩增以及序列测定等实验中，用于特异性识别并结合到目标DNA序列上的短链寡核苷酸。
引物通常由20-30个碱基组成，其序列应与目标DNA序列互补或部分互补，在实验过程中起到引导扩增反应、选择性检测目标序列等作用。
引物在聚合酶链反应（PCR）中起特异性识别某一目标基因片段的作用，通过与目标DNA序列互补配对形成稳定的引物-模板复合体，为DNA聚合酶提供一个起始点进行扩增。
引物的设计需要考虑多个因素，包括GC含量、长度、配对形式和温度等参数，以确保引物能够高效地结合目标序列而不与其他非特异性序列杂交。
2.2 探针的含义和作用探针是指在基因组学研究、荧光原位杂交等实验中使用的一类带有特定报告信号（如荧光染料或放射性同位素）的核酸分子。
探针通常由20-30个碱基组成，可以与目标DNA或RNA序列特异性结合，并通过检测信号来定位和识别目标序列。
探针的设计需要依据具体实验需求确定，可以是荧光探针、原位杂交探针、Northern分析中使用的RNA探针等。
定量PCR引物探针设计原则
定量P C R引物探针设计原则TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】定量P C R引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar 等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
2017第九章 PCR引物及杂交探针设计
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miRNA引物设计 主讲教师：赵雨杰
由于miRNA序列较短； 由于miRNA存在成熟和颈环序列； 用实时定量PCR检测生物样品中某种miRNA含量 引物设计是比较特殊的； 首先，需完成miRNA逆转录；然后，进行扩增。
2、茎环状结构的RT引物 （ABI产品为主）
由可以自身呈环茎状的特异序列＋6到8个miRNA3’端 反向互补碱基组成。(一条miRNA序列特异对应一个 茎环状结构的RT引物）。另外一条引物3‘端含有6-8 个目标miRNA5'端碱基序列，再加一段随机序列，以 确保引物的Tm值在60℃左右。
美国signosis公司的一种新方法
1. 引物应用模板核酸序列保守区内设计并具有特异性。 2. 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段，产物不能形成二级结构。 3. 引物长度一般在15~30碱基之间。 4. G+C含量在40%~60%之间。
5. 碱基要随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 6. 引物自身不能有连续4个碱基以上的互补。 7. 引物之间不能有连续4个碱基以上的互补。 8. 引物5′端可以修饰。 9. 引物3′端不可修饰。
pcr扩增时taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条dna链就有一个荧光分子形成实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步
PCR引物及杂交探针设计
3. 分子信标:是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的 发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补 配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。 PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定 DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
定量PCR引物、探针设计原则
精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
引物、探针设计原则浅析
概念
• 引物：一段寡核苷酸序列，其3’端为PCR(polymerase chain reaction）的起点。 分上游（正向）、下游（反向）引物，而扩增产物（扩增子）的长度就是由上下游引 物的位置决定 • 探针：一段经修饰寡核苷酸序列，用来实时监控扩增产物的量。 位于上或下游引物下游，通常紧贴引物。
• 与靶区域互补匹配 • 长度18~25bp • GC含量40%~60% • Tm值通常60±5℃ • 避免连续4个及以上碱基出现，尤其是G四联体 • 避免过多的二级结构，如二聚体、发卡结构 • 3’端严格匹配 • 上下游引物Tm值相差不超过1℃
引物设计原则
探针设计原则
• 与靶区互补匹配 • 确保靶区域高度保守，若保守序列不够长，先设计探针 • 探针长度20~28bp • Tm值比引物通常高10℃，为70℃左右 • 5’避免G碱基，因为其具有淬灭荧光的能力 • 避免4个及以上重复碱基出现 • 避免过多二级结构 • 确保C碱基数多于G碱基数，否者再设计引物 • 探针绝对保守，严格匹配 • 一般而言，引物探针无法完全避免二级结构，可允许二聚体出现，尽量保证ΔG绝对
值小于5 • 引物、探针设计好坏的根本在于序列比对（Sequence Alignment），序列比对成功
引物、探针设计基本完成，使用相应的软件即可 • 软件得出分高的未必就好，分低的未必不好，具体还需从实验结果判定
谢谢观看！
定量pcr的原理和应用
定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。
相比传统的定性PCR，定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。
本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。
二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术，通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。
其主要原理包括：1.设计引物和探针：定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列，引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。
2.实时检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列发生特异性结合，形成荧光信号。
通过实时监测PCR产物的荧光信号强度，可以确定目标序列的起始数量。
3.标准曲线法：定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。
标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成，根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系，可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。
三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤：1.样本处理：将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化，以获得高质量的核酸模板。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特异性和相关基因信息，设计引物和荧光探针。
3.PCR反应体系的配置：根据实验需求和PCR仪器要求，配置PCR反应混合液，包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。
4.PCR反应条件的设置：确定PCR反应的温度和时间参数，包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。
5.实时荧光监测：将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中，监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
6.数据分析：利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析，绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。
四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是定量PCR的主要应用领域：1.基因表达分析：通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平，揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
PCR引物和探针
引物设计原则：1．上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200 片段进行PCR 扩增。
所以引物的选取也要非常的保守。
2•上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62 C之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2C。
3．确保引物中 GC 含量在 30-80% 。
应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
引物的3'端最好不为G或/和C。
引物3'端的5个碱基不应出现2个G或/和C o4．避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
5•跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。
探针设计的基本原则：1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72 C之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10 °C，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
3. 确保探针中 GC 含量在 30-80% o4. 避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免 4个或超过4个的G碱基5. 探针的5 '端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
6. Taqman 探针应靠近上游引物，即 Taqman 探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。
两者的距离最好是探针的5'端离上游引物的3'有一个碱基。
7. 避免探针与引物之间形成二级结构。
8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则1.引物长度：最好控制在18-25个碱基对之间。
过短的引物会导致特异性降低，而过长的引物则会增加杂交的机会，影响PCR的特异性。
2.引物序列：引物应与目标基因序列高度匹配，避免引物与非特异性DNA结合。
引物的GC含量应在40-60%之间，以确保适当的结合力。
3.引物互补性：引物设计时，互补性不应超过3个碱基对。
互补性太高可能会导致杂交产物增多，影响PCR的特异性。
4.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应在55-65°C之间。
Tm值过高可能导致引物与非特异性DNA杂交，而Tm值过低可能导致引物无法精确结合目标DNA。
5.引物的位置：引物应设计在目标基因的保守区域，避免设计在多态性位点或重复序列区域。
1.引物-探针互补性：引物和探针应该具有很高的互补性，以确保探针与引物结合后能够产生一个稳定的引物-探针结合物。
2.探针设计：探针通常由一个荧光染料和一个QSY抑制剂构成。
荧光染料的选择应是稳定的、不受PCR反应条件的影响的。
QSY抑制剂充当了探针的标记基团，它通过修饰荧光染料对荧光信号进行猝灭。
3.探针-引物适配性：探针和引物之间应该是完全互补的，以确保引物和探针都能够准确结合目标DNA，并且防止任何非特异性杂交的发生。
4.简并位点：在设计探针时应避免引物和探针设计在简并位点上，这样可以确保在PCR过程中特异性扩增。
5.荧光信号强度：探针设计时还应考虑荧光信号的强度。
一般而言，较强的荧光信号会导致更高的检测灵敏度，但较低的信号可能会增加误差。
总而言之，定量PCR引物和探针的设计需要遵循一系列原则，以确保可靠性和准确性。
这些原则包括引物长度、序列、互补性和Tm值的控制，引物的位置选择以及荧光染料和QSY抑制剂的合理选择和设计。
通过遵循这些原则，可以提高定量PCR的特异性和灵敏度，并准确测量样本中的目标基因表达水平。
引物探针设计
自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，T aqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般T aqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
多重荧光定量pcr步骤_解释说明以及概述
多重荧光定量pcr步骤解释说明以及概述1. 引言1.1 概述多重荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的生物学实验方法，通过引入多个荧光探针实时监测PCR反应过程中特定DNA 序列的扩增情况。
与传统PCR相比，多重荧光定量PCR具有高通量、高灵敏度和高精确性的优点，广泛应用于基础科学研究、医学诊断和环境检测等领域。
1.2 文章结构本文将首先介绍多重荧光定量PCR的步骤，包括PCR反应体系、荧光探针选择和设计以及PCR条件调优等内容。
随后，详细解释多重荧光定量PCR的原理和工作机制，包括简要介绍PCR原理、多重荧光探针PCR的工作原理以及荧光信号检测和数据分析方法。
接着，讨论多重荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断和农业环境检测等领域中的应用，并展望其未来发展前景。
最后，在结论部分总结多重荧光定量PCR步骤及其优势点，并分析目前面临的挑战，提出进一步发展方向。
1.3 目的本文旨在全面介绍多重荧光定量PCR的步骤、原理和应用，帮助读者深入理解该技术，并掌握其操作要点和相关应用领域。
通过本文的阐述，读者将对多重荧光定量PCR有一个清晰而全面的认识，以便在实验和研究中更好地利用该技术，并为未来的探索和创新提供启示。
2. 多重荧光定量PCR步骤:2.1 PCR反应体系:多重荧光定量PCR是通过同时使用多个荧光探针对目标DNA进行定量分析的一种PCR技术。
在进行多重荧光定量PCR之前，需要准备一个合适的PCR反应体系。
该体系包含以下组成部分：1. 模板DNA：即待扩增的目标DNA片段，可以是基因组DNA或cDNA。
2. 引物：用于引导DNA聚合酶在目标序列上扩增。
根据所需扩增的目标片段，设计并购买合适的引物。
3. 荧光探针：用于检测PCR反应过程中产生的特定产品。
根据需要同时检测的不同靶序列，选择合适的荧光探针，例如TaqMan探针、Molecular Beacon 等。
引物探针设计总结报告
引物探针设计总结报告引言引物探针设计是分子生物学研究中常用的实验手段，用于检测、分析和定量目标DNA或RNA序列的存在与表达水平。
准确、高效的引物探针设计是实验成功的关键。
在本报告中，我们将总结引物探针设计的基本原则和常用策略，并讨论一些优化方法，以期帮助研究人员在进行引物探针设计时取得更好的实验效果。
基本原则引物探针设计的准确性和可靠性至关重要，以下是一些基本原则可以用来指导引物探针设计的过程。
1. 特异性：引物探针应具有较高的目标序列特异性，以避免与非目标序列杂交，导致假阳性结果。
这可以通过在引物和探针序列中加入一些特异性碱基或序列来实现。
2. 稳定性：引物和探针应具有适当的碱基组成和长度，以提高稳定性。
引物和探针长度通常在15到30个碱基对之间，GC含量约为40%-60%。
3. Tm值：引物和探针的熔解温度（Tm值）应该相似，以确保它们可同时在同一温度下进行PCR反应。
Tm值计算可以使用公式Tm = 2(A+T) + 4(C+G)，其中A、T、C、G分别代表引物或探针序列中相应碱基的个数。
4. 避免互补和二聚体形成：引物和探针之间以及引物自身之间的互补性碱基对和二聚体形成应该尽量避免。
这可以通过使用特殊的软件工具进行分析和预测来实现。
常用策略在引物探针设计过程中，有一些常用的策略可以提高设计的效果。
1. 引物设计：PCR反应中常用的引物设计策略包括：提取目标序列的保守区域进行设计，避免重复序列或多态性位点，避免SNP位点，避免GC-rich或AT-rich 区域等。
引物长度通常在18到30个碱基对之间。
2. 探针设计：探针设计是用于检测靶标物的存在，并进行定量分析。
设计可以基于一种原理如荧光探针、近红外探针、分子信标探针等，或者结合多种原理来设计多功能探针。
切忌设计过长或过短的探针，避免非特异结合和背景信号干扰。
3. 引物探针设计工具：现在有许多在线的引物探针设计工具可以帮助研究人员完成设计。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）和定量PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）是现代分子生物学中常用的实验技术，用于扩增和检测DNA序列。
在 PCR和定量 PCR 中，引物（primers）和探针（probes）的设计是非常重要的，因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。
引物是一对短的DNA分子，通常由15-30个核苷酸组成，它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。
引物的设计需遵循以下几个原则：1.引物的碱基组成：引物应具有合适的碱基组成。
GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性，但也更容易形成二聚体，影响PCR反应的特异性和效率。
通常引物的GC含量应在40%-60%之间。
2.引物的长度：引物的长度应在18-28个碱基对之间。
引物过短会导致扩增产物的非特异性，引物过长会降低扩增效率。
3. 引物的 Tm 值： Tm 值（熔解温度）是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。
引物的 Tm 值应保持一致，一般在55°C - 65°C 之间。
在设计扩增子（amplifier）时，引物的 Tm 值差异应在1°C 以内，以确保扩增的特异性。
探针是一种特殊的分子，它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。
探针的设计需遵循以下几个原则：1. 荧光染料的选择：选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。
常见的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素异硫氰酯（FITC）以及羧基甲基罗damine（ROX）等。
2. Quencher 的选择：设定探针的Quencher。
一般使用的Quencher是BHQ1，或者参考其他文献上的Quencher的讯息。
3.引物和探针的序列：引物和探针的序列应与目标序列完全互补。
引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤（G）或者鸟嘧啶（C），以避免互结和三聚体的形成。
4.引物和探针的位置：引物和探针的位置非常重要。
实时定量PCR步骤
实时定量PCR步骤实时定量PCR（Real Time Quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA序列或基因表达水平的方法。
它是PCR技术的变体，可以实时监测PCR反应的进行，并在放大过程中定量目标DNA序列的数量。
下面是实时定量PCR的详细步骤：步骤1：实验准备1.1收集所需的实验材料，包括PCR反应液组分（引物、探针、dNTPs、缓冲液、聚酶等）、PCR管和盖膜、模板DNA样品、阳性和阴性对照样品等。
1.2预先冷藏和解冻所有的试剂和样品。
1.3清洁操作台面，并准备离心机、实时荧光PCR仪和计算机等设备。
步骤2：引物和探针设计2.1根据待测目标序列，使用生物信息学工具设计引物和探针，确保具有高度特异性和高扩增效率。
2.2检查引物和探针的熔解温度是否相近，并避免二次结构和杂交问题。
步骤3：制备PCR反应液3.1根据PCR反应体系计算所需的试剂量，并根据实验板的数量和样品数量，按比例制备PCR反应液。
3.2在一个干净的离心管中，将缓冲液、dNTPs、引物、探针、酶和染料等反应组分按照特定顺序加入。
3.3使用纯水调整总反应体积，确保每个样品反应液体积相等。
步骤4：添加模板DNA4.1准备好模板DNA样品，可以是基因组DNA、cDNA或其他。
4.2将模板DNA分别加入各个PCR反应管中，注意避免污染和交叉污染。
步骤5：进行PCR反应5.1将PCR反应管密封，并在PCR仪上进行扩增。
此时，PCR仪应可提供实时荧光信号监测功能。
5.2设置PCR仪的温度程序和循环次数，通常包括热激活、扩增和延伸等不同的阶段。
5.3监测PCR仪上的实时荧光信号，并记录下所有的扩增曲线。
实时荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。
5.4在每个PCR循环的结束时，建议进行一次熔解曲线分析，以确定PCR产物的特异性。
步骤6：数据分析6.1使用PCR仪上的软件工具，导出扩增曲线数据。
6.2使用阈值周期（Ct）方法，根据扩增曲线与阈值线的交叉点来定量反应液中目标序列的数量。
探针法荧光定量pcr实验流程
探针法荧光定量pcr实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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12
Questions?
13
• 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G
• C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链 • 多态位点应尽量位于探针中央，可以±3个碱基
6
基因表达探针
R
TaqMan探针
Q 3'
Exon 1
Exon 2
Exon 3
基因表达、cDNA定量研究中，特别设计探针跨过两个外显子，以增强扩增特异性
8
TaqMan MGB探针
(non-fluorescent quencher) NFQ
R AGGCCTTGAGAGATAT
Q
MGB
Q
(minor groove binder)
提高探针Tm值 R Q AGGCCTTGAGAGATAT
| | | | | | | | | | ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ | | | | |
GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC
• 引物3’端的5个碱基中，G和C加起来不要超过2个
• 引物3’端不要是碱基A，避免出现3个以上相同碱基 • 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对 • 避免引物自身形成环状发卡结构 • 扩增片段的长度在50-150bp之间
11
检查引物特异性
• NCBI BLAST引物扩增特异性 /Blast.cgi
淬灭荧光
报告荧光 报告荧光 参比荧光
TEXAS Red
CY-5
~610
~670
报告荧光
报告荧光
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引物设计
• 引物尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠 • 引物长度9-40bp，最优20bp，GC含量保持在30-80%之间 • 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G • 引物Tm值在58-60C之间，上下游引物Tm不要超过2C
7
基因分型探针
polymorphism
DO NOT PLACE HERE
NN N N N N N N N N N N N N N N N N N
Try to position the polymorphism here (central third)
If necessary, put the polymorphism here (region of MGB)
Module 3: 引物探针的设计流程
The world leader in serving science 1
引物探针的设计流程
选择目标基因 / SNP位点
设计探针和引物
筛选引物、探针，优化各组分浓度
验证
完成
2
选择目的基因/SNP位点
3
序列查找
4
设计探针引物
5
探针设计原则
• 优先考虑探针位置 • 探针的5'端第一个碱基不能是G • 基因表达探针Tm值：68-70C；基因分型探针Tm值：65-67C • TaqMan探针长度13-30bp，TaqMan-MGB探针长度在13-25bp
R 报告荧光 NFQ 无荧光淬灭基团 MGB 小沟结合物
9
荧光标记基团选择
荧光染料
6-FAM SYBR Green I JOE VIC
最大发射峰 (nm)
~520 ~520 ~550 ~550
用途
报告荧光 报告荧光 报告荧光 报告荧光
TAMRA
NED CY-3 ROX
~580
~580 ~580 ~610