脂肪酶的分离纯化
脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。
脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。
包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。
脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。
植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。
迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。
总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。
溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。
这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。
酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。
酶的分离提纯实验原理
酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。
此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。
酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。
常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。
2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。
例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。
3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。
亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。
在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。
通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。
2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。
3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。
4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。
离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。
5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。
例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。
6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。
7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。
8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。
总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。
黑曲霉脂肪酶的分离纯化
黑曲霉脂肪酶的分离纯化（1）背景简介：脂肪酶全称为三酰基甘油水解酶，是一类能够将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和二甘酯、单甘酯或甘油的生物酶。
它除了能够水解脂肪外，还具有催化酯化反应、酯交换反应、酸解反应、醇解反应以及氨解等反应的性质。
（2）理论途径：脂肪酶是蛋白质，因此大部分蛋白质的纯化方法也适用于脂肪酶。
常见的非特异性蛋白纯化方法有沉淀法、疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤等。
文献研究以从极端生境下筛选得到的一株产脂肪酶菌株为研究对象，采用层析的方法分离纯化得到纯脂肪酶，并对其酶学性质进行了研究。
（3）具体操作流程及方法：1）利用形态分析和分子方法对产脂肪酶菌株进行鉴定，并对产酶条件进行优化；2）研究温度、pH、金属离子和蛋白酶抑制剂对粗酶活性影响；3）利用硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等分离纯化脂肪酶；4）对纯脂肪酶进行酶学性质研究和一级结构鉴定。
（4）分离纯化具体方法及结果采用植物油1%（v/v）、酵母提取物1%（w/w）、KH2PO4 0.2%（w/w）、MgSO4 0.05%（w/w）、KCl 0.05%（w/w）等组成的培养基，接种量为1.5%（v/v）时，在28℃、180 r/m 下培养96h 后，发酵液中脂肪酶水解活性最大达到30IU/mL。
经过硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析，从黑曲霉发酵液中分离纯化了脂肪酶，脂肪酶的酶活回收率为22.1%，纯化倍数为203 倍。
获得的脂肪酶在SDS- PAGE 图谱上显示为单条带，分子量约为41kDa。
酶的最适反应温度为50℃，在20-60℃内有较好的稳定性，60℃处理12h 仍残留90%的酶活；最适反应pH 为 5.0，在pH 3.0-5.0 内具有较好稳定性，pH 3.0 时处理20h 仍存有99%的酶活。
Cu2+、Ca2+对酶活有较大促进作用，而Fe2+基本使酶完全失活；多种极性较大的有机溶剂对其有激活作用。
经MALDI-TOF-MS 鉴定，该脂肪酶与黑曲霉CBS513.88 酯酶具有较高的同源性。
11双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶
第37卷第5期2009年5月 化 学 工 程CHE M I CAL E NGI N EER I N G (CH I N A ) Vol .37No .5May 2009作者简介:杨建军(1973—),男,工程师,博士生,研究方向为生物催化与生物质转化,E 2mail:mysyjj@;马晓迅(1957—),男,教授,博士生导师,通讯联系人,电话:(029)88302633,E 2mail:maxy m@nwu .edu .cn 。
双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶杨建军,马晓迅(西北大学化工学院,陕西西安 710069)摘要:对南极假丝酵母脂肪酶(CAL )在双水相中的分配情况进行了研究,考察了温度、聚乙二醇(PEG )相对分子质量、NaCl 质量分数和(NH 4)2S O 4质量分数对分配系数K (C AL )的影响,结果表明:温度对K (C AL )影响不大;低相对分子质量PEG 与蛋白质的疏水作用可促进C AL 的分配;二相间电势差等对分配平衡、有较大影响。
在PEG2000/(NH 4)2S O 4双水相体系中,CAL 最佳的萃取分离条件为:室温下,质量分数20%PEG2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,此时,K (CAL )为8.16,C AL 回收率为91.2%。
关键词:脂肪酶;双水相;分离纯化中图分类号:Q 814.1 文献标识码:A 文章编号:100529954(2009)0520049204Separati on and puri fi cati on of Candida an ta rctica li pasei n aqueous two 2phase syste mYANG J i a n 2jun,M A X i a o 2xun(School of Che m ical Engineering,North west University,Xi ′an 710069,Shaanxi Pr ovince,China )Abstract:The partiti on behavi or of Candida an tarctica li pase (CAL )in aqueous t w o 2phase syste m (ATPS )was investigated .The effects of te mperature,relative molecular mass of polyethylene glycol (PEG ),the mass fracti onof NaCl and (NH 4)2S O 4on partiti on coefficient of CAL K (CAL )were studied .The results show that in ATPS,te mperature was uni m portant for partiti on coefficient of CAL K (CAL ),while the electric potential difference bet w een t op and bott om phase was i m portant .It was als o discovered that the less the molecule mass of PEG was,the more favorable conditi ons f or the CAL congregati on int o the phase because of the increased hydr ophobicity for med .A t the r oom te mperature,the op ti m ized extracti on conditi ons were as foll ows:mass fracti on 20%PEG 2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,and K (CAL )was 8.16,the recovery rate of CAL was 91.2%.Key words:li pase;ATPS;purificati on 固定化脂肪酶催化酯交换反应生产生物柴油已成为近年来新能源研究的热点之一。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
酶在油脂制取、精炼、改性中的应用
中的应用2023-11-08•酶在油脂制取中的应用•酶在油脂精炼中的应用•酶在油脂改性中的应用目录•酶在油脂工业中应用的前景•结论01酶在油脂制取中的应用脂肪酶在油脂水解中的应用脂肪酶具有高度的专一性，能够将甘油三酯分解成甘油二酯、甘油单酯和脂肪酸。
脂肪酶在油脂水解过程中具有高效性和专一性，能够提高水解产物的纯度和收率。
利用脂肪酶进行油脂水解可以获得高纯度的脂肪酸和甘油单酯等中间产物，这些中间产物在食品、化妆品、药品等领域具有广泛的应用价值。
蛋白酶在动物脂肪液化中的应用蛋白酶能够催化蛋白质的分解，在动物脂肪液化过程中，利用蛋白酶可以将动物脂肪中的胶原蛋白等蛋白质成分分解成小分子肽和氨基酸，从而提高了脂肪的流动性。
蛋白酶在动物脂肪液化中的应用可以提高脂肪的品质和口感，同时也可以提高脂肪的利用率和附加值。
淀粉酶能够将淀粉分解成低分子糖类，在植物油提取过程中，利用淀粉酶可以破坏植物细胞壁，提高油脂的提取率。
淀粉酶在植物油提取中的应用可以提高油脂的产量和品质，同时也可以提供低分子糖类副产品，具有较高的经济价值。
淀粉酶在植物油提取中的应用02酶在油脂精炼中的应用脂肪酶在油脂脱臭中的应用脂肪酶在油脂脱臭过程中具有反应条件温和、对底物专一性要求较低、能耗低等优点。
脂肪酶脱臭方法对不同来源的油脂都具有良好的适用性，如大豆油、菜籽油、葵花籽油等。
脂肪酶可有效降低或消除油脂中不良气味，提高油脂的感官品质。
通过脂肪酶催化油脂中的不饱和脂肪酸，产生具有挥发性的小分子，从而消除油脂异味。
的加工性能。
利于保留油脂中的营养成分。
脂肪酶脱胶法适用于各种植物油和动物油的脱胶处理，如大豆油、花生油、鱼油等。
脂肪酶脱色方法适用于各种植物油和动物油的脱色处理，如大豆油、花生油、橄榄油等。
在使用脂肪酶进行油脂脱色处理时，需要控制反应温度、时间以及底物浓度等因素，以达到最佳的处理效果。
脂肪酶可催化油脂中色素成分的水解，从而实现油脂的脱色。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
脂肪酶的提取与分离纯化
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3.2.1 ATPS系统的选择
连接带长度的影响 ：
研究了不同的连接带长度在体积比维持在1左右时PEG/NA2HPO4系统的影响 。表3A代表在各自系统不同连接带长度下的脂肪酶分配情况。在MTCC5695脂 肪酶最大脂肪酶回收率为85.95％的情况下，高纯化因子为4.51，比活力为 4024.56U / mg，TLL为41.24％。超过41.24％，MTCC5695的脂肪酶产量下 降，从85.95％降至57.43％。 在任何一种情况下，分离更倾向于底相。 随着两 相成分组分的浓度增加，两相的自由体积减小。
金属离子
组特异 性试剂
修饰剂 温度
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3.1 MTCC5695脂肪酶活力的影响因素
PH
MTCC5695脂肪酶显示在pH值10.8的最佳活性表明它是碱性的。
PH值在7.0-12.0之间时酶呈现了稳定性。在强酸性环境下，活动完全丧失
了活性，pH值为6.0时，酶活性很弱。
温度
MTCC5695脂肪酶活性的最佳温度是40度。脂肪酶在30-70摄氏
最适宜的系统是磷酸氢二钠系统，其中恢复率为61.87%的脂肪酶具有特 异性活性417.43U/mg和净化因子2.62。对细胞内甘油醛-3-磷酸脱氢酶和小 麦面粉的植物酯酶被ATPS提取和纯化效果不错，净化因子(PF)为18.46倍，产 量为83.16%。
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3.2.1 ATPS系统的选择
相形成高聚物的影响
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3.2.2 双水相萃取技术的分离与超滤
底相的超滤作用下使得磷酸钠与MTCC5695脂肪酶分 离，从而将纯化因子从4.12提高到5.99，酶的回收率为 82.09%。纯度的增加可以归因于通过膜和磷酸钠进行的 污染物蛋白的渗透。超滤装置的使用促进了MTCC5695脂 肪酶的分离;这反过来又增加了浓度，而纯度却未受影响。 先前的研究报告说，膜处理(超滤)与ATPE的整合不仅促进 了相形成成分与产品的分离，而且也增加了蛋白的纯度。
脂肪酶产生菌的筛选与分离
脂肪酶产生菌的筛选与分离姓名：赵倩班级：12生物技术学号：12103179 摘要:近年来随着化石资源的枯竭，能源危机越演越烈，生物柴油作为可再生的绿色能源得到了人们的广泛关注。
目前用于制备生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝酵母、无根根酶和青霉等微生物脂肪酶，还有下面即将介绍的一麻疯树油为主要原料生产生物柴油的脂肪酶。
该脂肪酶来自于一种用麻疯树油筛选出的细菌。
关键词:脂肪酶生产菌;筛选;产酶条件一、脂肪酶及其应用前景脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，它可以在油——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。
在微——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。
在微生物及动植物体内普遍存在。
目前已发现多种具有不同酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。
脂肪酶广泛运用于食品加工及风味改革、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、化妆、洗涤、医药、能源等领域。
二、材料和方法1.1试样麻疯树种子油预处理半年以上的土壤1.2培养基及试剂富集培养基(g/L):酵母膏2g ,K2HPO41 g，MgSO4,·7H20 0.1g，(NH4)2S041.0g,NaCl 0.5 g，pH 7. 0.驯化培养基(g/L ): (NH4)2SO4, 2.0 g,K2HPO41.0 g，K2HPO41.0 g，Na2HPO41.0g，NaCl 0.5g, MgSO4,·7H20 0.5 g, pH7.0.选择性平板培养基(g/L):酵母粉0.5 g , (NH4)2SO40.5 g，KH2PO40.3 g，NaCl 0.5 g，MgSO4,·7H20 0.2g，琼脂20.0 g,pH7.0.将上述溶液灭菌冷却至60℃左右加入均质后的2%的三丁酸甘油酯溶液,用紫外灯照射灭菌30 min以上备用.种子培养基(g/L):蛋白陈10.0 g,酵母膏5g，NaCl 5.0 g.产酶培养基(g / L):大豆油5.0 g , (NH4)2SO42.0 g，MgSO4,·7H20 3.0 g，K2HPO4 1.0 g,胆汁1. 0 g.三、脂肪酶产生菌的分离取6克含经粉碎处理麻疯树种子油预处理半年以上的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与30℃ 180r/min培养48h后取15ml转接入 30℃、180r/min培养48h后取15ml 转接入 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3次。
黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究
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摘
要
黑曲霉 W$JJ 脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、 透析、 GN8N Q29?,/’<2 W,<: W(’@ 阴离子交换层析和 Q29?,62X UL%Y 凝胶
［!-］ 活性平板定性检测法参照 1<JK 的方法。除特殊 说明之外， 脂肪酶活性测定均采用滴定法。
储油厂油污土壤中分离筛选得到。结合菌落 （包括 菌丝体） 形态、 342+ 序列同源聚类分析和 567 序列 限制性内切酶 （ !"# ! ） 酶切电泳图等特征， 参照齐
［!#］ ［!&］ 祖同 和 +889:;< 等的方法鉴定并命名为黑曲霉
!" 卷 # 期 !$$% 年 # 月
生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
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脂肪酶 （ :/4,30(;(032/’( ,30(?06/’(,<2，NI "Z#Z#Z"， 甘油三酰酯水解酶） 是一类能催化长链脂肪酸甘油 酯水解为甘油和长链脂肪酸 （或者是此反应的逆反
微生物酯酶的分离纯化技术及应用研究进展
微生物酯酶的分离纯化技术及应用研究进展酯酶，又称羧酸酯酶，是一类能够对羧酸酯酯键作用的水解酶，可在水分子的参与下，经由水解作用，将酯类切割成酸类与醇类。
酯酶普遍存在于动物、植物和微生物中，在水分子的参与下能够催化裂解酯键形成相应的醇和酸。
微生物酯酶作为生物催化剂，具有很高的催化功能、底物特异性和反应特异性，利用其水解反应、酯转换以及酯合成反应广泛应用于食品、化工、环保等领域。
在自然界中能产生酯酶的微生物资源是非常丰富的，主要来源是真菌，真菌中主要是青霉、镰孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等l2属，其次是细菌，细菌主要是假单胞菌、粘质赛氏杆菌、无色杆菌和葡萄球菌等。
另外，放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯酶。
对于微生物的胞外酯酶，发酵液经离心或过滤去除细胞，将上清液用超滤、盐析或有机溶剂沉淀等方法浓缩粗提;胞内酯酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用盐析或有机溶剂沉淀的方法进行粗提，为了获得更高的纯度，再用凝胶过滤或亲和层析等方法进行细分离。
1. 微生物酯酶的常规分离纯化技术1.1超滤超滤是利用压力或离心力，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化，根据蛋白质分子大小的不同而选择不同分子量的膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，从而使蛋白质得到分离。
1.2盐析法盐析一般是指溶液中加入无机盐类，蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。
一般粗抽提物常用该法进行粗分。
1.3 有机溶剂沉淀法利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。
有机溶剂能降低溶液的介电常数，削弱溶剂分子与蛋白分子间的作用力，从而增加蛋白质分子上带电粒子的相互吸引力，致使蛋白分子聚合沉淀;另有机溶剂溶解于水的同时，能从蛋白质周围的水化层中夺走水分子，破坏水化层，从而使蛋白质沉淀析出。
脂肪酶的分离纯化
贺州学院课程考核试卷（论文）（2013—2014学年第 1 学期）课程名称：酶工程开课单位：化生学院考核年级、专业：11生物工程任课教师：何彩梅论文题目：脂肪酶的分离纯化脂肪酶的分离纯化摘要：采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法，对Candida sp. 99−125 脂肪酶进行了纯化，比活提高了10.0倍，达到27200 U/mg，回收率为35.5%. SDS−PAGE 电泳分析显示该酶的分子量约为38 kDa. 酶学性质研究表明，该酶最适反应温度为40℃，最适反应pH 值为8.5，在室温下具有良好的稳定性. 钙离子和Tween80 能够促进提高脂肪酶的活性，而铁离子、铜离子和SDS 对其有明显的抑制作用.一．前言脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一类重要的酯键水解酶. 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶的制备周期短，作用pH 和作用温度范围广，底物专一性强，便于进行工业生产和制备高纯度制剂[1].在众多脂肪酶中，假丝酵母系(Candida sp.)脂肪酶的用途最为广泛，特别是用于合成短碳链酯类化合物如香料、生物柴油等物质[2]和手性化合物的拆分反应[3].Candida sp. 99-125 是本实验室保存的一类菌种，目前已应用于生物柴油[4]、维生素A 酯[5]、棕榈酸异辛酯[6]等物质的催化合成研究. 然而该菌株生产的脂肪酶中含有大量的杂质，不仅影响脂肪酶的酶活水平，而且对酶促催化反应带来许多不利因素. 为此，本研究采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法分离纯化Candida sp. 99-125 脂肪酶，并对纯化后酶的性质进行了研究.2 材料与方法2.1 试剂与仪器粗酶粉，产酶菌株为Candida sp. 99−125，实验室自制；聚丙烯酰胺；液相色谱仪；SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)电泳仪；DEAE Sepharose FF 层析柱和PhenylSepharose FF (Low sub)层析柱.2.2 实验方法2.2.1 粗酶液的制备取2 g 粗酶粉溶于20 mL Tris-HCl (20 mmol/L, pH=7.5)缓冲液，待搅拌均匀离心，取上清液为上柱用的粗酶液. 粗酶液中蛋白的比活为2710 U/mg.2.2.2 离子交换层析法纯化脂肪酶以20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH=7.5)平衡离子交换层析柱，上样4 mL 粗酶液. 先以Tris-HCl 缓冲液冲洗掉未被离子交换层析柱结合的蛋白，再用0~0.4 mol/L的NaCl 溶液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为15 倍柱体积，最后以1 mol/L NaCl 溶液彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分.2.2.3 疏水层析法纯化脂肪酶向上节得到的高活性脂肪酶样品溶液中加入固体硫酸铵至0.8 mol/L，将该溶液注入经0.8 mol/L 硫酸铵(AS)缓冲液(pH=7.0)平衡的疏水层析柱中. 先用0.8mol/L 硫酸铵缓冲液冲洗掉未被结合的蛋白，再用0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵缓冲液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为10 倍柱体积，最后以20 mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)缓冲液继续冲洗至彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析.2.2.4 脂肪酶活力的测定脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法[7].酶活定义：脂肪酶在40℃, pH 为8.0 的条件下水解橄榄油乳化液产生1 μmol/min 脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位(记为1 U).2.2.5 蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford 检测法[8]. 标准蛋白质为1 mg/mL 牛血清蛋白(BSA).2.2.6 SDS−聚丙烯酰胺凝胶电泳合并2.2.3 节得到的高活性脂肪酶样品溶液，加入2 倍SDS−PAGE 上样缓冲液，经沸水浴加热3∼5 min，得到电泳样品. 电泳采用浓度为12%的分离胶，控制电压在150 V. 电泳结束后进行考马斯亮蓝染色.3 结果与讨论3.1 脂肪酶的纯化3.1.1 离子交换层析采用DEAE Sepharose FF (1 mL)作为离子交换层析柱，紫外检测器的检测波长为280 nm，流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被DEAE 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，结果表明，洗脱液中不存在酶活性物质. 然后用NaCl 溶液梯度洗脱，结果如图1 所示.图1 层析柱DEAE 分离纯化脂肪酶图1 显示有2 个蛋白吸收峰(A, B)，A 峰的峰形与酶活值构成的峰吻合，说明A 峰为纯化得到的目标脂肪酶蛋白峰，B 峰为杂蛋白峰. 活性测定表明，A 峰的比活为16600 U/mg，纯化倍数为6.1 倍，酶收率为55.7%.但2 峰之间有牵连现象，无法实现完全分离，说明DEAE柱对Candida sp.脂肪酶的分离效果一般.3.1.2 疏水层析采用Phenyl Sepharose FF (1mL)作为疏水层析柱.流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被Phenyl 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，表明没有酶活性物质被洗脱出来. 用硫酸铵溶液梯度洗脱酶液的实验结果见图2.图2 表明，以梯度为0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵溶液洗脱时，脂肪酶蛋白并没有被洗脱下来，说明脂肪酶蛋白的疏水性比较强，与Phenyl 柱结合牢固；而以20mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱时，洗脱液则表现出较高的脂肪酶活性. 脂肪酶经Phenyl Sepharose FF 层析柱进一步纯化后，收率为63.7%，纯化倍数为1.6 倍.图2 层析柱Phenyl 分离纯化脂肪酶综上所述，Candida sp. 99-125 脂肪酶在经过DEAE离子交换层析和Phenyl 疏水层析两步纯化后，其比活为27200 U/mg，比粗酶提高了10.0 倍，产品收率为35.5%.3.2 脂肪酶的性质3.2.1 脂肪酶的最适反应温度分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同温度下的酶活性，结果见图4，表明该脂肪酶的最适反应温度为40℃.3.2.2 脂肪酶的最适反应pH 值在37℃下，分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同pH下的酶活性，结果见图5，表明该脂肪酶的最适反应pH 值为8.5.3.2.3 脂肪酶的温度稳定性将纯化后的酶液在不同温度下放置1 h 后测定酶活性，结果见图6. 该脂肪酶在高于35℃的条件下容易失活，但在室温(20∼30℃)下放置时具有较好的稳定性. 将酶在室温(20℃)下放置2d，其酶活收率在95%以上.3.2.4 金属离子对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入5 mmol/L 的MgSO4, CuSO4, FeSO4, CaCl2 溶液和2.5 mmol/L 的K2SO4 溶液，在30℃下放置30 min，以不加离子的酶液为对照，分别测定其酶活.图7 表明，Fe2+和Cu2+对此酶有明显的抑制作用；而Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%. 这说明适量的Ca2+能够促进脂肪酶活性的提高，对酶分子的最佳活力构象起稳定作用. 因此，可选择CaCl2 作为活化剂以提高酶活性.3.2.5 表面活性剂和酶抑制剂对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入1 mmol/L 的EDTA, β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT)和SDS,以及0.1%的Triton-X100, Tween80, Span60 和Span85，在30℃下放置30 min 后测定酶活，以不加表面活性剂或抑制剂的酶液为对照，结果见图8. 可见加入0.1%的Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而1 mmol/L 的SDS 的引入对酶有抑制作用，EDTA 对酶活性的影响不大，说明该酶不是金属结合酶. 其他表面活性剂和抑制剂对酶活性的影响不大.3.3 假丝酵母系脂肪酶性质的比较Candida antarctica 脂肪酶B 的催化活性强，比活约为9 U/mg (Fluka 公司商品酶，62288 lipase B, Candidaantarctica，recombinant from Aspergillus oryzae)，温度稳定性好，立体选择性高[9]，特别是商品固定化产品Novozyme 435 在60∼80℃下仍保持较高的催化活性[10].Candida rugosa 脂肪酶包含5 个同工酶[11]，不同的同工酶对不同碳链脂肪酸的选择性差别较大，纯化的LipA 比活为750 U/mg[12]，最适反应温度在35∼40℃，最适反应pH 值为7∼8[11].Candida lipolytica 脂肪酶报道较多，姜延程等[13]对该酶采用DEAE−Cellulose DE-52 和DEAE−SephadexA-50 离子交换层析等步骤纯化，比活提高27.4 倍，达到169 U/mg，收率11%；徐岩等[1]采用盐析和透析的方法将比活提高2.69 倍，收率45%；张金红等[14]采用疏水层析法对其进行分离纯化，比活提高了10 倍以上. 但该酶的温度稳定性差，在30℃下存放24 h，酶活损失50%以上[13].4. 结论通过Candida sp. 99-125 脂肪酶的分离纯化及其酶学性质研究，得到如下结论：采用DEAE Sepharose FF 离子交换层析和PhenylSepharose FF (Low sub)疏水层析两步进行纯化，使Candida sp. 99-125 脂肪酶的比活显著提高，达到27200U/mg，为粗酶的10.0 倍，收率为35.5%. 经分析该酶的分子量约为38 kDa.(2)Candida sp. 99−125 脂肪酶纯化后的最适反应温度为40℃，最适反应pH 为8.5. 该脂肪酶在室温(20℃)条件下具有较好的稳定性，放置2 d，其酶活保留达95%以上. Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而Fe2+, Cu2+和SDS 对其有明显的抑制作用.参考文献：[1] 徐岩, 李建波, 王栋. 解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究 [J].无锡轻工大学学报, 2001, 20(3): 257−260.[2] Bourg-Garros S, Razafindramboa N, Pavia A A. Large-scalePreparation of 3-Hexen-1-yl Acetate Using Candida antarctica Immobilized Lipase in Hexane [J]. Biotechnol. Bioeng., 1998, 59(4):498−500.[3] Maria S C, Jose V S G. Lipase-catalyzed Synthesis of Chiral Amides:A Systematic Study of the Variables that Control the Synthesis [J].Tetrahedron, 1998, 54: 2877−2892.[4] Deng L, Nie K L, Wang F, et al. Studies on Production of Biodiesel byEsterification of Fatty Acids by a Lipase Preparation from Candida sp.99-125 [J]. Chin. J. Chem. Eng., 2005, 13(4): 529−534.[5] Yin C H, Liu T, Tan T W. Synthesis of Vitamin A Esters byImmobilized Candida sp. Lipase in Organic Media [J]. Chin. J. Chem.Eng., 2006, 14(1): 81−86.[6] 陈必强，叶华，谭天伟. 固定化假丝酵母脂肪酶合成棕榈酸异辛酯 [J]. 化工学报, 2004, 55(3): 422−425.[7] 何耀强，王炳武，谭天伟. 假丝酵母99-125 脂肪酶的发酵工艺研究 [J]. 生物工程学报, 2004, 20(6): 918−921.[8] 汪家政，范明. 蛋白质技术手册 [M]. 北京：科学出版社, 2000.42−46.[9] 赵天涛，高静，李伟杰. 南极假丝酵母脂肪酶B 的催化机理及应用前景 [J]. 分子催化, 2005, 19(2): 155−160.[10] Borg P, Binet C, Girardin M, et al. Enzymatic Synthesis of Trieicosapentaenoylglycerol in a Solvent-free Medium [J]. J. Mol.Catal. B: Enzymatic, 2001, 11: 835−840.[11] Vakhlu J, Kour A. Yeast Lipases: Enzyme Purification, BiochemicalProperties and Gene Cloning [J]. Electro. J. Biotechnol., 2006, 9(1):69−85.[12] Rua M L, Fernandez V M, Ballesteros A, et al. Purification and Characterization of Two Distinct Lipases from Candida cylindracea [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1993, 1156: 181−189.[13] 姜延程，谢文磊，张文新. 解脂假丝酵母胞外脂肪酶的提纯和性质 [J]. 吉林大学自然科学学报, 1996, (3): 91−95.[14] 张金红，柳振宇，刘惠君，等. 疏水层析法分离纯化脂肪酶的研究 [J]. 南开大学学报, 2000, 33(2): 95−98.。
酶提取和分离纯化的大致流程
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1. 细胞破裂。
机械法，例如匀浆、研磨。
脂肪酶纯化工艺流程
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1. 细胞裂解，将脂肪酶来源（如微生物或动物组织）进行裂解，释放出脂肪酶。
碱性脂肪酶的纯化和酶学性质的鉴定
目录1 前言 (1)1.1 碱性脂肪酶概述 (4)1.2 脂肪酶的来源 (4)1.2.1 植物来源的脂肪酶 (4)1.2.2 动物来源的脂肪酶 (4)1.2.3 微生物来源的脂肪酶 (5)1.3 脂肪酶的性质 (5)1.3.1 脂肪酶的编码基因 (5)1.3.2 结构 (6)1.3.3 作用机理 (7)1.3.4 反应类型和底物特异性 (7)1.4 脂肪酶的研究现状 (8)1.4.1 脂肪酶的选育 (8)1.4.2 脂肪酶的发酵生产 (9)1.4.3 脂肪酶的活力测定 (10)1.4.4脂肪酶的分离纯化 (10)1.4.5 脂肪酶的固定化研究 (11)1.4.6 不动杆菌脂肪酶研究进展 (12)1.5 脂肪酶的应用 (13)1.5.1 洗涤剂工业 (13)1.5.2 环境治理 (13)1.5.3 食品工业 (14)1.5.4 造纸工业 (14)1.5.5 医药工业 (14)1.5.6 生物柴油 (14)1.5.7制革工业 (15)1.5.8 化妆品 (15)1.5.9有机相中酶催化合成 (15)1.6 复合诱变技术及其在菌种选育中的应用 (15)1.7 本课题的研究目的和意义 (16)1.8 研究内容 (17)2 材料与方法 (18)2.1 实验材料 (18)2.1.1 菌种 (18)2.1.2 质粒 (18)2.1.3 主要试剂 (18)2.1.4 仪器设备 (19)2.1.5 培养基 (21)2.1.6 溶液 (21)2.2 实验方法 (23)2.2.1 分析方法 (23)2.2.2 产稳定性碱性脂肪酶菌株筛选方法 (27)2.2.3 菌种鉴定及脂肪酶基因分析 (27)2.2.4 脂肪酶的分离纯化 (30)2.2.5 复合诱变 (31)2.2.6 菌种保存方法 (33)3 结果与讨论 (34)3.1 产稳定性碱性脂肪酶的筛选 (34)3.2 菌种鉴定及脂肪酶基因的分析 (34)3.2.1 菌种鉴定 (34)3.2.2 脂肪酶基因分析 (35)3.3 稳定性碱性脂肪酶的性质 (38)3.3.1酶的最适作用温度 (38)3.3.2酶的热稳定性 (38)3.3.3 酶的最适作用pH (39)3.3.4酶的pH稳定性 (40)3.3.5 脂肪酶的底物特异性 (40)3.3.6金属离子对酶活性的影响 (41)3.3.7酶对洗涤剂添加成分的稳定性 (42)3.4 稳定性碱性脂肪酶的分离纯化 (43)3.4.1 盐析 (43)3.4.2 脱盐浓缩 (43)3.4.3 Cellulose DE-52 离子交换层析 (43)3.4.4 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 (44)3.4.5 稳定性碱性脂肪酶的纯度鉴定及分子量测定 (45)3.4.6 稳定性碱性脂肪酶的纯化回收情况 (45)3.5 产酶培养基的优化 (46)3.4.1 碳源对产酶的影响 (46)3.5.2 诱导物质对产酶的影响 (46)3.5.3 氮源对产酶的影响 (48)3.5.4 磷源对产酶的影响 (49)3.5.5初始pH对产酶的影响 (50)3.5.6 7L罐放大试验 (50)3.6复合诱变选育脂肪酶高产菌 (52)3.6.1 菌体生长曲线的测定 (52)3.6.2 紫外诱变 (53)3.6.3 硫酸二乙酯（DES）诱变 (53)4 结论 (56)5 展望 (57)6 参考文献 (58)7 发表论文情况 (66)8 致谢 (67)1 前言1.1 碱性脂肪酶概述脂肪酶(1ipase)全称为甘油三酰酯水解酶，主要水解和合成由甘油和12个碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，它是一种特殊的酯键水解酶，只能在异相系统或不溶性系统的油-水界面水解酯。
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脂肪酶——来源
脂 植物：油料作物的种子
肪
酶 的
动物：高等动物的胰脏和脂肪组织
来
源 微生物：细菌、酵母菌和霉菌
脂 提取法：从动植物器官或组织中提取
肪
酶 的 提
化学合成法：分析酶的氨基酸组成顺序 ,再用化学 方法合成
取
发酵法 ：利用微生物的生命活力 , 通过人工控制而
获得人们所需的酶--假单胞菌属，黑曲霉，米曲霉
脂肪酶——结构
• 绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser和His参与组 成, His，Ser与另一种氨基酸残基(如Glu或Asp 等)
一起构成脂肪酶催化活性中心的三联体。
残基 261 和 257 的羰基氧原子 为Ca2+配基;顶端的α螺旋( 浅色 的) 表示“盖子”状结构。当脂 肪酶与界面相接触时,此盖打开, 通过亲电子域的创造导致脂肪酶 的构象改变,此亲电子域在丝氨 酸残基周围,由疏水残基的暴露 和亲水残基的包埋来完成。这种 结构有利于催化过程中底物对活 性中心亲和力的提高以及活性 中间体的稳定。
• （氮源）大豆粉 2 ％ (NH4)2 SO4 0.1 ％ （碳源）玉米浆 5 ％ K2HPO4 5.5 ％ 聚乙二醇壬基笨 醚 0.6 ％
微生物脂肪酶的发酵过程
无 菌 空 气
发酵液
脂肪酶的下游分离提取工艺
预处理 过滤 菌体 水洗
（破碎）
过滤
滤液+ 洗液（含酶稀溶液）
硫铵
超滤
无菌过滤
浓缩液 辅料
• “盖子”是两性分子结构，在关闭状态，酶的结 构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部， 当酶转变到开放状态时，疏水端会暴露出来，隐 藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域， 引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的 亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。 酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了 脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活
脂肪酶——影响因素
• 影响因子:生产培养基中存在单糖，双糖或甘油时 ,脂肪酶 的形成常受阻遏脂肪酶的大量生产是在葡萄糖在培养基中 消耗完及生长停止时。
• 温度：脂肪酶的最适作用温度在30℃~60℃之间， 在较高 和较低温度下酶仍具有较高活性。
• PH:大多数细菌脂肪酶最适pH在中性或碱性范围内，pH 稳定范围一般在 pH4.0~11.0 之间。真菌脂肪酶pH稳定范 围也较宽，通常在 pH4.0~10.0 之间。
固体酶 制粒机造粒 粘结剂
硫铵回收
筛分 涂膜
成品颗粒酶
微生物脂肪酶的下游分离提取工艺
发酵液 丙酮
50%硫酸铵盐化 上层丙酮 下层脂肪酶+丙酮
废丙酮精馏
脱水
转鼓过滤器
脱水 脂肪酶 丙酮
干燥
脂肪酶粉末
展望
• 分析纯：2000-3000元/1kg • 衣物除污脂肪酶：150/1kg • 食用级脂肪酶：150-500/1kg • 纯化次数越多，纯化倍数和比活也越高,但得率却
脂肪酶的分离纯化
姓名：曹净净 学号：111411201
生物柴油
纺织工业
脂肪酶——应用
洗涤剂 工业
食品工业
医药
脂肪酶——结构
• 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物 油脂水解：甘油三酯+水=甘油+游离脂肪酸 其氨基酸组成数目从 2 70 ~ 6 41 不等, 其分 子量 为29 000~ 100 000。
随之下降。 由于经过的层析柱较多, 成本也较高, 因此我们纯化微生物脂肪酶所面临的问题就是不 仅要提高纯化倍数和比酶活,还要降低成本