脂肪酶的提取与分离纯化
脂肪酶的分离纯化
脂肪酶——来源
脂 植物：油料作物的种子
肪
酶 的
动物：高等动物的胰脏和脂肪组织
来
源 微生物：细菌、酵母菌和霉菌
脂 提取法：从动植物器官或组织中提取
肪
酶 的 提
化学合成法：分析酶的氨基酸组成顺序 ,再用化学 方法合成
取
发酵法 ：利用微生物的生命活力 , 通过人工控制而
获得人们所需的酶--假单胞菌属，黑曲霉，米曲霉
脂肪酶——结构
• 绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser和His参与组 成, His，Ser与另一种氨基酸残基(如Glu或Asp 等)
一起构成脂肪酶催化活性中心的三联体。
残基 261 和 257 的羰基氧原子 为Ca2+配基;顶端的α螺旋( 浅色 的) 表示“盖子”状结构。当脂 肪酶与界面相接触时,此盖打开, 通过亲电子域的创造导致脂肪酶 的构象改变,此亲电子域在丝氨 酸残基周围,由疏水残基的暴露 和亲水残基的包埋来完成。这种 结构有利于催化过程中底物对活 性中心亲和力的提高以及活性 中间体的稳定。
• （氮源）大豆粉 2 ％ (NH4)2 SO4 0.1 ％ （碳源）玉米浆 5 ％ K2HPO4 5.5 ％ 聚乙二醇壬基笨 醚 0.6 ％
微生物脂肪酶的发酵过程
无 菌 空 气
发酵液
脂肪酶的下游分离提取工艺
预处理 过滤 菌体 水洗
（破碎）
过滤
滤液+ 洗液（含酶稀溶液）
硫铵
超滤
无菌过滤
浓缩液 辅料
• “盖子”是两性分子结构，在关闭状态，酶的结 构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部， 当酶转变到开放状态时，疏水端会暴露出来，隐 藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域， 引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的 亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。 酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了 脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活
脂肪酶实验方案
脂肪酶实验方案富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0.溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0.3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0.4 mL , pH 6. 0 ,7.0 ,8. 0.种子培养基( %) :葡萄糖2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0. 1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0.发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。
观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。
脂肪酶高产菌株的筛选：（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。
黑曲霉脂肪酶的分离纯化
黑曲霉脂肪酶的分离纯化（1）背景简介：脂肪酶全称为三酰基甘油水解酶，是一类能够将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和二甘酯、单甘酯或甘油的生物酶。
它除了能够水解脂肪外，还具有催化酯化反应、酯交换反应、酸解反应、醇解反应以及氨解等反应的性质。
（2）理论途径：脂肪酶是蛋白质，因此大部分蛋白质的纯化方法也适用于脂肪酶。
常见的非特异性蛋白纯化方法有沉淀法、疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤等。
文献研究以从极端生境下筛选得到的一株产脂肪酶菌株为研究对象，采用层析的方法分离纯化得到纯脂肪酶，并对其酶学性质进行了研究。
（3）具体操作流程及方法：1）利用形态分析和分子方法对产脂肪酶菌株进行鉴定，并对产酶条件进行优化；2）研究温度、pH、金属离子和蛋白酶抑制剂对粗酶活性影响；3）利用硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等分离纯化脂肪酶；4）对纯脂肪酶进行酶学性质研究和一级结构鉴定。
（4）分离纯化具体方法及结果采用植物油1%（v/v）、酵母提取物1%（w/w）、KH2PO4 0.2%（w/w）、MgSO4 0.05%（w/w）、KCl 0.05%（w/w）等组成的培养基，接种量为1.5%（v/v）时，在28℃、180 r/m 下培养96h 后，发酵液中脂肪酶水解活性最大达到30IU/mL。
经过硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析，从黑曲霉发酵液中分离纯化了脂肪酶，脂肪酶的酶活回收率为22.1%，纯化倍数为203 倍。
获得的脂肪酶在SDS- PAGE 图谱上显示为单条带，分子量约为41kDa。
酶的最适反应温度为50℃，在20-60℃内有较好的稳定性，60℃处理12h 仍残留90%的酶活；最适反应pH 为 5.0，在pH 3.0-5.0 内具有较好稳定性，pH 3.0 时处理20h 仍存有99%的酶活。
Cu2+、Ca2+对酶活有较大促进作用，而Fe2+基本使酶完全失活；多种极性较大的有机溶剂对其有激活作用。
经MALDI-TOF-MS 鉴定，该脂肪酶与黑曲霉CBS513.88 酯酶具有较高的同源性。
脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。
脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。
包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。
脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。
植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。
迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。
总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。
溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。
这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。
酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。
酶在油脂制取、精炼、改性中的应用
中的应用2023-11-08•酶在油脂制取中的应用•酶在油脂精炼中的应用•酶在油脂改性中的应用目录•酶在油脂工业中应用的前景•结论01酶在油脂制取中的应用脂肪酶在油脂水解中的应用脂肪酶具有高度的专一性，能够将甘油三酯分解成甘油二酯、甘油单酯和脂肪酸。
脂肪酶在油脂水解过程中具有高效性和专一性，能够提高水解产物的纯度和收率。
利用脂肪酶进行油脂水解可以获得高纯度的脂肪酸和甘油单酯等中间产物，这些中间产物在食品、化妆品、药品等领域具有广泛的应用价值。
蛋白酶在动物脂肪液化中的应用蛋白酶能够催化蛋白质的分解，在动物脂肪液化过程中，利用蛋白酶可以将动物脂肪中的胶原蛋白等蛋白质成分分解成小分子肽和氨基酸，从而提高了脂肪的流动性。
蛋白酶在动物脂肪液化中的应用可以提高脂肪的品质和口感，同时也可以提高脂肪的利用率和附加值。
淀粉酶能够将淀粉分解成低分子糖类，在植物油提取过程中，利用淀粉酶可以破坏植物细胞壁，提高油脂的提取率。
淀粉酶在植物油提取中的应用可以提高油脂的产量和品质，同时也可以提供低分子糖类副产品，具有较高的经济价值。
淀粉酶在植物油提取中的应用02酶在油脂精炼中的应用脂肪酶在油脂脱臭中的应用脂肪酶在油脂脱臭过程中具有反应条件温和、对底物专一性要求较低、能耗低等优点。
脂肪酶脱臭方法对不同来源的油脂都具有良好的适用性，如大豆油、菜籽油、葵花籽油等。
脂肪酶可有效降低或消除油脂中不良气味，提高油脂的感官品质。
通过脂肪酶催化油脂中的不饱和脂肪酸，产生具有挥发性的小分子，从而消除油脂异味。
的加工性能。
利于保留油脂中的营养成分。
脂肪酶脱胶法适用于各种植物油和动物油的脱胶处理，如大豆油、花生油、鱼油等。
脂肪酶脱色方法适用于各种植物油和动物油的脱色处理，如大豆油、花生油、橄榄油等。
在使用脂肪酶进行油脂脱色处理时，需要控制反应温度、时间以及底物浓度等因素，以达到最佳的处理效果。
脂肪酶可催化油脂中色素成分的水解，从而实现油脂的脱色。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
酶的提取与分离纯化
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三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
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3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
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酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
酶溶法的不足：
1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要 增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低；
因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混 入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。
2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确 定最佳的溶解条件。
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第二节 提取（ Extraction ）
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液 处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当 的溶剂：
极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极 性的有机溶剂中，
酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶 剂中。
脂肪酶综述
五、脂肪酶的发酵生产及分离纯化
产脂肪酶发酵分两类: 固体发酵和液体发酵法。相对液体发酵法，固体发酵
生产脂肪酶具有简洁，经济的优点 。
影响菌株发酵产脂肪酶的因素有： 氮源、碳源、底物诱导剂、表面活性剂、矿物质、pH,
培养温度、摇床转速、培养时间、接种量等。
（1）发酵培养基
有机氮源:
大豆粉、大豆饼粉、大豆蛋白、业麻饼粉、奶粉、酪蛋白、蛋白陈、酵母膏、 牛肉膏、玉米浸汁和无机氮硫酸钱、硫代硫酸钱、氯化氨、磷酸氢氨、磷酸二 氢氨等
碳源
包括13种碳水化合物如葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、甘露糖等和15种油 脂如荷荷芭油、玉米油、豆油、棕搁油、橄榄油、业麻油等
表面活性剂
包括吐温系列、Span系列、Triton x-405等
发酵培养基优化
由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成 。
速效碳源
如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如 玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。
(2)最适pH及pH稳定性
脂肪酶最适pH受多种因素影响，如来源、底物 种类和浓度、缓冲液种类和浓度等。来源不同脂肪 酶，在一定条件下都有其特定最适pH和pH稳定范 围。大多数细菌脂肪酶的最适pH值在中性或碱性 范围内，稳定范围一般在pH值为4.0-11.0。真菌脂 肪酶pH值稳定范围较宽，如红曲酶保持基本活力 的pH值范围在pH4.0-6.0，少根根霉脂肪酶的酶活 在pH值为6.0-8.0的范围内都较稳定毛根霉脂肪酶 的pH值稳定范围为7.0-10.0。
大豆粉大豆饼粉大豆蛋白业麻饼粉奶粉酪蛋白蛋白陈酵母膏牛肉膏玉米浸汁和无机氮硫酸钱硫代硫酸钱氯化氨磷酸氢氨磷酸二碳源包括13种碳水化合物如葡萄糖淀粉麦芽糖乳糖甘露糖等和15种油脂如荷荷芭油玉米油豆油棕搁油橄榄油业麻油等表面活性剂包括吐温系列span系列tritonx405等发酵培养基优化由碳源氮源诱导物及常见的无机盐等组成速效碳源如葡萄糖蔗糖麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成
酶的分离纯化
酶的分离纯化摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。
酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。
现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。
关键词：酶；分离；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。
一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。
酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。
正文：1. 酶的分离与纯化的概念[1]酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。
酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料的选取选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素2. 酶的分离纯化 2.1 细胞破碎[2]各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。
1.）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
研磨法：用研钵直接研磨。
常用于微生物的微生物材料的破碎。
匀浆法：利用高压匀浆泵、玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机将细胞破碎。
脂肪酶的提取与分离纯化
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3.2.1 ATPS系统的选择
连接带长度的影响 ：
研究了不同的连接带长度在体积比维持在1左右时PEG/NA2HPO4系统的影响 。表3A代表在各自系统不同连接带长度下的脂肪酶分配情况。在MTCC5695脂 肪酶最大脂肪酶回收率为85.95％的情况下，高纯化因子为4.51，比活力为 4024.56U / mg，TLL为41.24％。超过41.24％，MTCC5695的脂肪酶产量下 降，从85.95％降至57.43％。 在任何一种情况下，分离更倾向于底相。 随着两 相成分组分的浓度增加，两相的自由体积减小。
金属离子
组特异 性试剂
修饰剂 温度
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3.1 MTCC5695脂肪酶活力的影响因素
PH
MTCC5695脂肪酶显示在pH值10.8的最佳活性表明它是碱性的。
PH值在7.0-12.0之间时酶呈现了稳定性。在强酸性环境下，活动完全丧失
了活性，pH值为6.0时，酶活性很弱。
温度
MTCC5695脂肪酶活性的最佳温度是40度。脂肪酶在30-70摄氏
最适宜的系统是磷酸氢二钠系统，其中恢复率为61.87%的脂肪酶具有特 异性活性417.43U/mg和净化因子2.62。对细胞内甘油醛-3-磷酸脱氢酶和小 麦面粉的植物酯酶被ATPS提取和纯化效果不错，净化因子(PF)为18.46倍，产 量为83.16%。
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3.2.1 ATPS系统的选择
相形成高聚物的影响
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3.2.2 双水相萃取技术的分离与超滤
底相的超滤作用下使得磷酸钠与MTCC5695脂肪酶分 离，从而将纯化因子从4.12提高到5.99，酶的回收率为 82.09%。纯度的增加可以归因于通过膜和磷酸钠进行的 污染物蛋白的渗透。超滤装置的使用促进了MTCC5695脂 肪酶的分离;这反过来又增加了浓度，而纯度却未受影响。 先前的研究报告说，膜处理(超滤)与ATPE的整合不仅促进 了相形成成分与产品的分离，而且也增加了蛋白的纯度。
产脂肪酶菌株的筛选
产脂肪酶菌株的筛选实验目的:以橄榄油作为唯一碳源筛选出能产生出脂肪酶的菌株。
橄榄油乳化法是测定脂肪酶活性的常用方法，其测定的原理是天然油脂被水解产生的游离脂肪酸可以被氢氧化钠中和。
橄榄油乳化：聚丙烯醇3:1橄榄油乳化，水包油型，然后装在合适的瓶子里。
实验原理：脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，产脂肪酶的微生物广泛的分布，主要以各类真菌为主；在富含油脂的地方进行采样，利用稀释平板分离法筛选产脂肪酶菌株，再以乳化橄榄油为底物。
脂肪酶作用于橄榄油乳化液，催化酯键水解，生成脂肪酸，用标准氢氧化钠滴定脂肪酸，利用酚酞滴定终点，记录消耗的氢氧化钠体积，根据氢氧化钠的用量来计算脂肪酶的活力。
材料：烧杯、玻璃棒、锥形瓶、试管、平板、接种环、制备乳化状态的针筒等。
土壤采集：在土门菜市场油污重地进行土壤采样。
富集培养基配置：硫酸铵0.1% 磷酸氢二钾0.1% 七水硫酸镁 0.05% 七水硫酸亚铁0.001% 酵母膏0.5% 橄榄油乳化液12% 氯化钠l% PH自然，115℃灭菌30min选择培养基平板：乳化橄榄油 12% 蛋白胨 1% 硫酸铵0.2% 磷酸氢二钾0.1% 磷酸二氢钾0.3% 七水硫酸亚铁0.1% 维多利亚蓝0.004% 琼脂1.5% PH=8.0灭菌115℃30min 复筛培养基平板：乳化橄榄油12% 蛋白胨1% 硫酸铵0.2% 磷酸氢二钾0.1% 磷酸二氢钾0.3% 七水硫酸亚铁0.1% 琼脂1.5% PH=8 115℃灭菌30min实验方法：1、取土样2g悬于20ml无菌水中，震荡，在100ml培养基中加入5ml的悬液，30℃ 180r/m 培养3d。
2、取富集液稀释分别涂布于选择培养基平板上，经培养观察菌落周围的蓝色圈，然后挑取该菌落于富集培养基斜面上。
30℃培养箱3d。
3、将初筛得到的菌株在复筛培养基平板划线，然后放于30℃培养箱中3d。
4、挑取单菌落，镜检并纯化，得到纯菌株保存。
5、活力测定：U=(V-V.)/t×50×n。
脂肪酶产生菌的筛选与分离
脂肪酶产生菌的筛选与分离姓名：赵倩班级：12生物技术学号：12103179 摘要:近年来随着化石资源的枯竭，能源危机越演越烈，生物柴油作为可再生的绿色能源得到了人们的广泛关注。
目前用于制备生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝酵母、无根根酶和青霉等微生物脂肪酶，还有下面即将介绍的一麻疯树油为主要原料生产生物柴油的脂肪酶。
该脂肪酶来自于一种用麻疯树油筛选出的细菌。
关键词:脂肪酶生产菌;筛选;产酶条件一、脂肪酶及其应用前景脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，它可以在油——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。
在微——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。
在微生物及动植物体内普遍存在。
目前已发现多种具有不同酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。
脂肪酶广泛运用于食品加工及风味改革、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、化妆、洗涤、医药、能源等领域。
二、材料和方法1.1试样麻疯树种子油预处理半年以上的土壤1.2培养基及试剂富集培养基(g/L):酵母膏2g ,K2HPO41 g，MgSO4,·7H20 0.1g，(NH4)2S041.0g,NaCl 0.5 g，pH 7. 0.驯化培养基(g/L ): (NH4)2SO4, 2.0 g,K2HPO41.0 g，K2HPO41.0 g，Na2HPO41.0g，NaCl 0.5g, MgSO4,·7H20 0.5 g, pH7.0.选择性平板培养基(g/L):酵母粉0.5 g , (NH4)2SO40.5 g，KH2PO40.3 g，NaCl 0.5 g，MgSO4,·7H20 0.2g，琼脂20.0 g,pH7.0.将上述溶液灭菌冷却至60℃左右加入均质后的2%的三丁酸甘油酯溶液,用紫外灯照射灭菌30 min以上备用.种子培养基(g/L):蛋白陈10.0 g,酵母膏5g，NaCl 5.0 g.产酶培养基(g / L):大豆油5.0 g , (NH4)2SO42.0 g，MgSO4,·7H20 3.0 g，K2HPO4 1.0 g,胆汁1. 0 g.三、脂肪酶产生菌的分离取6克含经粉碎处理麻疯树种子油预处理半年以上的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与30℃ 180r/min培养48h后取15ml转接入 30℃、180r/min培养48h后取15ml 转接入 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3次。
酶分离纯化过程中需要注意什么问题为什么进行酶活力酶比活力的测定
酶比活力
酶比活力是在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有 的酶活力单位数。比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位 数，一般用u/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡 量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。 利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催 化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。
总活力水收率=纯化后总活力/纯化前总活力*100% 由于酶是具有生物活性的催化物质，对反应的条件要求高，所 以反应后会由于环境的变化失活。 2.酶比活力提高比：指的是反应前后的酶比活力的比值。 酶比活力提高比=纯化后比活/纯化前比活
测定酶活力需测定其初速度，如图所示，曲线的斜率表示单 位时间内产物生成量的变化，所以曲线上任何一点的斜率就 是该相应时间的反应速率。随着时间的延长，曲线逐渐平坦， 斜率降低，反应速度也就降低，显然这个时候测得的酶活力 不能代表真实的酶活力。引起酶促反应速率随时间延长而降 低的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加加速了逆反 应进行，产物对酶的抑制等等。因此，测定酶活力，应该测 定酶促反应的出速率，从而避免上述种种复杂因素对反应速 率的影响。
酸溶液提取。提取时需注意溶液的pH不能太低，以免酶变性失活。 如胰蛋白酶可用0.12mol/l硫酸溶液提取。
3.碱性溶液提取： 有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用碱
溶液提取，操作时注意pH不能过高，以免影响酶活，同时加 碱液时要一边搅拌一边缓慢加进，避免局部过碱而引起酶变 性失活。
4.有机溶剂提取： 有些酶与脂类物质结合牢固或含有较多非极性基团，可采
电点时的pH值下，酶分子的溶解度最小。为了提高酶的溶解度， 提取时pH应避开酶的等电点以提高酶的溶解度。
产脂肪酶菌株的筛选及其固定化的研究
产脂肪酶菌株的筛选及其固定化的研究随着人们生活方式的改变和食物极限的提高，肥胖和心脑血管疾病等疾病也日益增多。
白领和学生等群体中，人们的饮食习惯和健康状况引起了更多的关注。
研究表明，脂肪酶能够降低脂肪的含量，对于健康人群以及需要减肥的人来说，这种酶被应用广泛。
因此，本文主要讨论如何通过菌株的筛选和固定化研究，实现产脂肪酶的目标。
1.产脂肪酶菌株的筛选(1)菌株分类首先我们需要得到具有脂肪酶产生能力的微生物株。
目前，研究人员从不同来源的环境中筛选得到脂肪酶分解菌株。
一般来说，脂肪酶菌株按照细菌、真菌、酵母菌的类型划分。
以细菌领域为例，产脂肪酶的细菌具有广泛的分布。
研究表明，主要包括属于芽孢杆菌属（Bacillus）、乳酸菌属（Lactobacillus）、放线菌属（Streptomyces）、泥炭菌属（Pseudomonas）等。
其中，芽孢杆菌属的应用比较广泛。
其次，酵母菌的产酶能力比较强，因此也是研究的热点对象。
真菌也是研究的对象之一。
上述微生物大多数有代表性的株系都已经分离鉴定过程中分离纯化和筛选中，通过选择合适的产酶基质，调节适宜的菌株培养环境，确定了不同的产酶体系。
基于活性、脂肪酶酶特异性和影响、菌株生产含量等方面着手，最终确定了适宜的菌株，如Bacillus subtilis CICC 40224，Bacillus pumilus CICC 1316。
(2)筛选菌株的影响因素1.酸碱度：脂肪酶的酸碱度是影响酶活性的一种因素，特别是在温度较高的条件下，酸碱度会对酶的活性和稳定性产生较大的影响。
2.温度：温度也是影响脂肪酶活性的因素之一。
根据研究，脂肪酶在40-50℃时的活性最为理想。
3.基质：脂肪酶对基质的种类和特性有一定的要求。
研究表明，基质的溶解度、分子大小、分子构型等因素会影响脂肪酶的分解能力。
4.浓度：产酶菌株的营养状态也会影响到它的产酶性能。
不同浓度的培养基对产酶菌株的贡献不同，太浓或太稀的培养基均会对脂肪酶的产生产生不利影响。
脂肪酶活力测定方法及其比较
脂肪酶活力测定方法及其比较一、本文概述脂肪酶是一类能够催化脂肪酸酯水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，其在生物体内起着重要的代谢作用。
脂肪酶活力测定方法的研究对于了解脂肪酶的催化性质、生物合成、调控机制以及在工业、医药和农业等领域的应用具有重要意义。
本文旨在介绍常见的脂肪酶活力测定方法，包括滴定法、比色法、荧光法、高效液相色谱法等，并比较它们的优缺点，以期为读者提供一个全面、系统的脂肪酶活力测定方法参考。
通过本文的阐述，读者可以了解各种测定方法的基本原理、操作步骤、适用范围以及注意事项，从而根据自身研究需求选择最合适的测定方法。
本文还将探讨脂肪酶活力测定方法的未来发展趋势，以期为相关领域的研究提供有益的参考和启示。
二、脂肪酶活力测定的基本原理脂肪酶活力测定主要基于脂肪酶水解脂肪酸的特性，通过测量水解产物的生成速率来评估酶的活性。
脂肪酶是一种能够催化脂肪酸酯水解的酶，其催化反应可以表述为：脂肪酶 + 脂肪酸酯→脂肪酸 + 醇。
在测定脂肪酶活力时，通常使用特定的底物，如三乙酸甘油酯（p-nitrophenyl butyrate）或橄榄油等，这些底物在脂肪酶的作用下会水解生成相应的脂肪酸和醇。
在测定过程中，通常使用比色法、滴定法或高效液相色谱法等方法来检测水解产物的生成量。
例如，当使用p-nitrophenyl butyrate 作为底物时，水解产生的p-nitrophenol在碱性条件下会呈现黄色，其颜色深浅与浓度成正比，因此可以通过比色法来测定其浓度，从而推算出脂肪酶的活力。
不同的测定方法具有各自的优缺点，比如比色法操作简便，但可能受到颜色干扰和pH值变化的影响；滴定法则需要精确的化学计量和反应条件控制；高效液相色谱法则具有更高的灵敏度和准确性，但设备成本较高，操作相对复杂。
因此，在选择脂肪酶活力测定方法时，需要根据实验条件和目的来综合考虑各种因素。
脂肪酶活力测定的结果还受到多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、反应温度、pH值等。
脂肪酶的分离纯化
贺州学院课程考核试卷（论文）（2013—2014学年第 1 学期）课程名称：酶工程开课单位：化生学院考核年级、专业：11生物工程任课教师：何彩梅论文题目：脂肪酶的分离纯化脂肪酶的分离纯化摘要：采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法，对Candida sp. 99−125 脂肪酶进行了纯化，比活提高了10.0倍，达到27200 U/mg，回收率为35.5%. SDS−PAGE 电泳分析显示该酶的分子量约为38 kDa. 酶学性质研究表明，该酶最适反应温度为40℃，最适反应pH 值为8.5，在室温下具有良好的稳定性. 钙离子和Tween80 能够促进提高脂肪酶的活性，而铁离子、铜离子和SDS 对其有明显的抑制作用.一．前言脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一类重要的酯键水解酶. 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶的制备周期短，作用pH 和作用温度范围广，底物专一性强，便于进行工业生产和制备高纯度制剂[1].在众多脂肪酶中，假丝酵母系(Candida sp.)脂肪酶的用途最为广泛，特别是用于合成短碳链酯类化合物如香料、生物柴油等物质[2]和手性化合物的拆分反应[3].Candida sp. 99-125 是本实验室保存的一类菌种，目前已应用于生物柴油[4]、维生素A 酯[5]、棕榈酸异辛酯[6]等物质的催化合成研究. 然而该菌株生产的脂肪酶中含有大量的杂质，不仅影响脂肪酶的酶活水平，而且对酶促催化反应带来许多不利因素. 为此，本研究采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法分离纯化Candida sp. 99-125 脂肪酶，并对纯化后酶的性质进行了研究.2 材料与方法2.1 试剂与仪器粗酶粉，产酶菌株为Candida sp. 99−125，实验室自制；聚丙烯酰胺；液相色谱仪；SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)电泳仪；DEAE Sepharose FF 层析柱和PhenylSepharose FF (Low sub)层析柱.2.2 实验方法2.2.1 粗酶液的制备取2 g 粗酶粉溶于20 mL Tris-HCl (20 mmol/L, pH=7.5)缓冲液，待搅拌均匀离心，取上清液为上柱用的粗酶液. 粗酶液中蛋白的比活为2710 U/mg.2.2.2 离子交换层析法纯化脂肪酶以20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH=7.5)平衡离子交换层析柱，上样4 mL 粗酶液. 先以Tris-HCl 缓冲液冲洗掉未被离子交换层析柱结合的蛋白，再用0~0.4 mol/L的NaCl 溶液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为15 倍柱体积，最后以1 mol/L NaCl 溶液彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分.2.2.3 疏水层析法纯化脂肪酶向上节得到的高活性脂肪酶样品溶液中加入固体硫酸铵至0.8 mol/L，将该溶液注入经0.8 mol/L 硫酸铵(AS)缓冲液(pH=7.0)平衡的疏水层析柱中. 先用0.8mol/L 硫酸铵缓冲液冲洗掉未被结合的蛋白，再用0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵缓冲液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为10 倍柱体积，最后以20 mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)缓冲液继续冲洗至彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析.2.2.4 脂肪酶活力的测定脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法[7].酶活定义：脂肪酶在40℃, pH 为8.0 的条件下水解橄榄油乳化液产生1 μmol/min 脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位(记为1 U).2.2.5 蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford 检测法[8]. 标准蛋白质为1 mg/mL 牛血清蛋白(BSA).2.2.6 SDS−聚丙烯酰胺凝胶电泳合并2.2.3 节得到的高活性脂肪酶样品溶液，加入2 倍SDS−PAGE 上样缓冲液，经沸水浴加热3∼5 min，得到电泳样品. 电泳采用浓度为12%的分离胶，控制电压在150 V. 电泳结束后进行考马斯亮蓝染色.3 结果与讨论3.1 脂肪酶的纯化3.1.1 离子交换层析采用DEAE Sepharose FF (1 mL)作为离子交换层析柱，紫外检测器的检测波长为280 nm，流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被DEAE 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，结果表明，洗脱液中不存在酶活性物质. 然后用NaCl 溶液梯度洗脱，结果如图1 所示.图1 层析柱DEAE 分离纯化脂肪酶图1 显示有2 个蛋白吸收峰(A, B)，A 峰的峰形与酶活值构成的峰吻合，说明A 峰为纯化得到的目标脂肪酶蛋白峰，B 峰为杂蛋白峰. 活性测定表明，A 峰的比活为16600 U/mg，纯化倍数为6.1 倍，酶收率为55.7%.但2 峰之间有牵连现象，无法实现完全分离，说明DEAE柱对Candida sp.脂肪酶的分离效果一般.3.1.2 疏水层析采用Phenyl Sepharose FF (1mL)作为疏水层析柱.流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被Phenyl 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，表明没有酶活性物质被洗脱出来. 用硫酸铵溶液梯度洗脱酶液的实验结果见图2.图2 表明，以梯度为0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵溶液洗脱时，脂肪酶蛋白并没有被洗脱下来，说明脂肪酶蛋白的疏水性比较强，与Phenyl 柱结合牢固；而以20mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱时，洗脱液则表现出较高的脂肪酶活性. 脂肪酶经Phenyl Sepharose FF 层析柱进一步纯化后，收率为63.7%，纯化倍数为1.6 倍.图2 层析柱Phenyl 分离纯化脂肪酶综上所述，Candida sp. 99-125 脂肪酶在经过DEAE离子交换层析和Phenyl 疏水层析两步纯化后，其比活为27200 U/mg，比粗酶提高了10.0 倍，产品收率为35.5%.3.2 脂肪酶的性质3.2.1 脂肪酶的最适反应温度分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同温度下的酶活性，结果见图4，表明该脂肪酶的最适反应温度为40℃.3.2.2 脂肪酶的最适反应pH 值在37℃下，分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同pH下的酶活性，结果见图5，表明该脂肪酶的最适反应pH 值为8.5.3.2.3 脂肪酶的温度稳定性将纯化后的酶液在不同温度下放置1 h 后测定酶活性，结果见图6. 该脂肪酶在高于35℃的条件下容易失活，但在室温(20∼30℃)下放置时具有较好的稳定性. 将酶在室温(20℃)下放置2d，其酶活收率在95%以上.3.2.4 金属离子对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入5 mmol/L 的MgSO4, CuSO4, FeSO4, CaCl2 溶液和2.5 mmol/L 的K2SO4 溶液，在30℃下放置30 min，以不加离子的酶液为对照，分别测定其酶活.图7 表明，Fe2+和Cu2+对此酶有明显的抑制作用；而Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%. 这说明适量的Ca2+能够促进脂肪酶活性的提高，对酶分子的最佳活力构象起稳定作用. 因此，可选择CaCl2 作为活化剂以提高酶活性.3.2.5 表面活性剂和酶抑制剂对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入1 mmol/L 的EDTA, β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT)和SDS,以及0.1%的Triton-X100, Tween80, Span60 和Span85，在30℃下放置30 min 后测定酶活，以不加表面活性剂或抑制剂的酶液为对照，结果见图8. 可见加入0.1%的Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而1 mmol/L 的SDS 的引入对酶有抑制作用，EDTA 对酶活性的影响不大，说明该酶不是金属结合酶. 其他表面活性剂和抑制剂对酶活性的影响不大.3.3 假丝酵母系脂肪酶性质的比较Candida antarctica 脂肪酶B 的催化活性强，比活约为9 U/mg (Fluka 公司商品酶，62288 lipase B, Candidaantarctica，recombinant from Aspergillus oryzae)，温度稳定性好，立体选择性高[9]，特别是商品固定化产品Novozyme 435 在60∼80℃下仍保持较高的催化活性[10].Candida rugosa 脂肪酶包含5 个同工酶[11]，不同的同工酶对不同碳链脂肪酸的选择性差别较大，纯化的LipA 比活为750 U/mg[12]，最适反应温度在35∼40℃，最适反应pH 值为7∼8[11].Candida lipolytica 脂肪酶报道较多，姜延程等[13]对该酶采用DEAE−Cellulose DE-52 和DEAE−SephadexA-50 离子交换层析等步骤纯化，比活提高27.4 倍，达到169 U/mg，收率11%；徐岩等[1]采用盐析和透析的方法将比活提高2.69 倍，收率45%；张金红等[14]采用疏水层析法对其进行分离纯化，比活提高了10 倍以上. 但该酶的温度稳定性差，在30℃下存放24 h，酶活损失50%以上[13].4. 结论通过Candida sp. 99-125 脂肪酶的分离纯化及其酶学性质研究，得到如下结论：采用DEAE Sepharose FF 离子交换层析和PhenylSepharose FF (Low sub)疏水层析两步进行纯化，使Candida sp. 99-125 脂肪酶的比活显著提高，达到27200U/mg，为粗酶的10.0 倍，收率为35.5%. 经分析该酶的分子量约为38 kDa.(2)Candida sp. 99−125 脂肪酶纯化后的最适反应温度为40℃，最适反应pH 为8.5. 该脂肪酶在室温(20℃)条件下具有较好的稳定性，放置2 d，其酶活保留达95%以上. Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而Fe2+, Cu2+和SDS 对其有明显的抑制作用.参考文献：[1] 徐岩, 李建波, 王栋. 解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究 [J].无锡轻工大学学报, 2001, 20(3): 257−260.[2] Bourg-Garros S, Razafindramboa N, Pavia A A. Large-scalePreparation of 3-Hexen-1-yl Acetate Using Candida antarctica Immobilized Lipase in Hexane [J]. Biotechnol. Bioeng., 1998, 59(4):498−500.[3] Maria S C, Jose V S G. Lipase-catalyzed Synthesis of Chiral Amides:A Systematic Study of the Variables that Control the Synthesis [J].Tetrahedron, 1998, 54: 2877−2892.[4] Deng L, Nie K L, Wang F, et al. Studies on Production of Biodiesel byEsterification of Fatty Acids by a Lipase Preparation from Candida sp.99-125 [J]. Chin. J. Chem. Eng., 2005, 13(4): 529−534.[5] Yin C H, Liu T, Tan T W. Synthesis of Vitamin A Esters byImmobilized Candida sp. Lipase in Organic Media [J]. Chin. J. 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酶的提取和分离纯化
酶分离纯化的工艺流程设计
设计时需要考虑的因素：
酶源材料 前期工艺过程 产品对纯度的要求 酶存在的状态 设备条件 动力、原料成本及工时费用
酶分离纯化的工艺流程设计
合理的工艺应以降低成本，提高效能，同时 又提高产品纯度和质量为前提。
对一个方法好坏的评价标准是： 1.酶的回收率 2.酶产品的比活力
此法效率较低
机械破碎法
3.匀浆法
利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破 碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也 可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来 破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小 的组织细胞。
此法细胞破碎程度较高，对酶的破坏也较 少，但难于在工业生产上应用。
11.2.2 物理破碎法
通过温度、压力、声波等各种物理因素的 作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物 理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎
所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀法 可浓缩并去除部分杂质，此外，浓缩的方 法有 （1）蒸发法 （2）反复冻融法 （3）胶过滤 （4）超滤法
2.初步提纯
除去大分子的核酸和粘多糖 （1）加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或
MnCl2可使核酸沉淀移去。必要时使用核酸酶。 （2）常用醋酸铅、乙醇、单宁和离子型表面活性
材料选择及其前处理
动物材料：事先剔除结缔组织、脂肪组织 植物材料：果实种子事先去皮壳，油质种
子用乙醚等脱脂 微生物发酵物：先将菌体和发酵物分离 胞外酶
酶 胞内酶 结酶 溶酶
11.2 细胞破碎
除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之 外，大多数酶都存在于细胞内，因此提取和分 离纯化前须将进行细胞的破碎。 破碎细胞的方法有:
剂等处理解决，有时也用酶。
经过初步提纯，余下来的大分子为酶与杂蛋白， 分离纯化的主要工作，同时也是比较困难的工作， 就是将酶从杂蛋白中分离出来。
反胶束法分离提纯黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶及其酶学性质研究、酶的固定化
反胶束法分离提纯黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶及其酶学性质研究、酶的固定化1,3-甘油二酯（1,3-DAG）是一种健康的油脂,它能在体内以能量的形式释放而不会在体内积累,从而可以减少肥胖发生的机率。
酶法制备1,3-甘油二酯是最为有效的方法,而脂肪酶是该法常用的一种酶。
1,3-甘油二酯的脂肪酶法制备包括酯合成、甘油解、转酯化法、甘油三酯水解四种,其中最为简便的应为甘油三酯直接水解法,但这需要能专一性水解Sn-2位酯键的脂肪酶参与,而该类型的脂肪酶在国内外报道极少。
本课题组在富含油脂的土壤中筛选得到一株产高Sn-2位选择性且酶活较高的胞外脂肪酶菌株黑曲霉GZUF36。
然而,该菌株产胞外Sn-2脂肪酶性状出现了衰退。
因此,本文从该菌株出发,对黑曲霉GZUF36产胞外Sn-2脂肪酶性能的复壮、胞外Sn-2脂肪酶分离纯化、酶学性质、酶固定化进行研究,从而为进一步研究该酶酯键选择性机理做铺垫。
首先对黑曲霉GZUF36稳定生产胞外Sn-2脂肪酶培养基的探索,发现培养基配方（牛肉膏0.5%,蛋白胨0.5%,橄榄油1.0%,硫酸铵0.2%,磷酸氢二钾0.5%,硫酸镁0.02%,氯化钙0.01%,氯化钠0.5%）能恢复其产酶性能。
对该菌株产的胞外Sn-2脂肪酶进行水解酶活力和油酸甘油三酯水解反应产物进行测定,发现水解酶活力为7.92±2.23 U/m L,1,3-DAG得率为16.34±1.27%,1,3-DAG选择性为82.67±3.01%。
相较于衰退前的胞外Sn-2脂肪酶催化性能,该培养基下产的胞外Sn-2脂肪酶的水解酶活力和1,3-DAG得率偏低,但选择性已经恢复到先前水平,说明衰退的黑曲霉GZUF36重新复壮后仍能生产高Sn-2选择性的脂肪酶。
而水解酶活力和1,3-DAG得率偏低可以通过培养基和培养条件优化来改善。
其次对发酵液中胞外Sn-2脂肪酶进行分离纯化,采用丙酮沉淀和反胶束萃取法相结合来实现。
脂肪酶实验方案
脂肪酶实验方案富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0.溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6.0 ,7.0 ,8. 0.种子培养基( %) :葡萄糖 2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0.1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0.发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。
观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。
脂肪酶高产菌株的筛选：（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按 1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。
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3.2.3 纯化脂肪酶的分子量测定
为了估计部分纯化的脂肪酶的近似分子量，采用标准蛋白质标记物进行了
sds-page的研究。所获得的这些带都是银染色的，并与活性染色所获得的区
域进行比较，以确定近似的分子量。为了确定分子的重量，用标记(mr)的分 子量和每一种蛋白质(mm)所移动的距离绘制了一个校准曲线。测定了目标蛋 白质的距离，并通过方程(从校准曲线中获得)来确定蛋白质的近似分子量。发 现MTCC5695脂肪酶的分子量大约在19.172 kDa。研究了与水解区相对应 的相应区域，并对该酶的分子量进行了分析。实验重复了三次，并研究了距 离的平均值。
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3.2.1 ATPS系统的选择
连接带长度的影响 ：
研究了不同的连接带长度在体积比维持在1左右时PEG/NA2HPO4系统的影响
。表3A代表在各自系统不同连接带长度下的脂肪酶分配情况。在MTCC5695脂
肪酶最大脂肪酶回收率为85.95％的情况下，高纯化因子为4.51，比活力为 4024.56U / mg，TLL为41.24％。超过41.24％，MTCC5695的脂肪酶产量下 降，从85.95％降至57.43％。 在任何一种情况下，分离更倾向于底相。 随着两 相成分组分的浓度增加，两相的自由体积减小。
蛋白结合的钙离子可以稳定结构。在Fe3+和Hg2+离子的情况下，脂肪酶活 性完全消失。Hg2+的强烈抑制表明，Hg2+与硫醇基团结合使得酶中存在关 键的半胱氨酸残基。
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3.1 MTCC5695脂肪酶活力的影响因素
有机溶剂 在乙醚存在下的活性最大，然后是甲醇，丁醇，吡啶和乙腈。在乙 醇和二甲苯的存在下观察到活性稍微增加，而丙酮，丙醇和己烷引起脂肪酶 活性略有降低。相反，DMSO和乙酸乙酯导致非常高的活性降低。
脂肪酶的纯化
脂肪酶的纯化 过程进行了双水相 体系的参数优化， 并且下面描述的所 有实验至少重复三
脂肪酶的表征
PH、温度、 金属离子、有机 溶剂、修饰剂、 组特异性试剂
次，并报告平均值。
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2.1 脂肪酶的分离纯化
2.1.1 双水相体系的介绍：
双水相萃取技术是近年来基于液－液萃取理论并考虑保持生物活性所开 发的一种新型分离方法。是利用生物大分子物质在由高聚物/高聚物/水或者 高聚物/无机盐/水形成的体系中的分配系数不同而实现对生物大分子的分离 的。当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐(一种是离散盐且另 一种是亲液盐)在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成
2.1 脂肪酶的分离纯化
2.1.2 双水相系统的相图： Albertsson使用云点方法制作出了双节点曲线。 通过折射率和电导率测量分别分析了聚乙二醇和盐的浓度。盐的 浓度是由一系列标准的盐浓度建立起来的校准曲线决定的。聚乙二醇 在相中的固定浓度是通过减去由盐份贡献的折射率值来确定的。 2.1.3 细菌培养以及酶提取： 最优条件下，在鱼的排泄物中培养了肠球菌MTCC5695。然后培 养物通过冷冻离心机（8000r/s）获得，并且细菌颗粒被重新悬浮到 蒸馏水中，再次离心完全去除培养基。然后，这些洗过的细胞颗粒被 重新溶解在磷酸盐缓冲液中(pH值7.0)，并储存在零下20摄氏度的环 境中。
纯化因子的估计
脂肪酶的纯化因子被定义为脂肪酶在上/下相的特定活性与粗提物的特定活性 的比值。 酶活性恢复比例 连接线的长度 TLL表示连接双水相体系的顶部和底部阶段的组成的线的长度。 相体积比 相体积比被定义为顶相和底相的体积比。Vt和Vb分别是顶相和底相的体积。
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2.1 脂肪酶的分离纯化
2.1.7 超滤 ： 将双水相体系与超滤结合，超滤装置中对MTCC5695的纯化脂肪 酶滤液进行过滤，来去除酶上的聚乙二醇。 为了从系统的底部分离 PEG / Na2HPO4，使用超滤离心单元（10kDa膜阻挡值， 10,000rpm，约10分钟）。 2.1.8 SDS-PAGE来测定分子量： 在5％聚丙烯酰胺堆积凝胶和12％聚丙烯酰胺分辨凝胶上进行电泳 。电泳最初在50V下进行，直到样品进入分离凝胶，然后施加100V的 恒定功率，直到电泳完成。使用范围为14.3至94.7kDa的蛋白质标记 物用于比较分子量的标准标记。用银染色法将蛋白带进行可视化。
量为83.16%。
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3.2.1 ATPS系统的选择
相形成高聚物的影响
为了研究PEG分子量对脂肪酶分配的影响（A: PEG 1000; B: PEG
4000; C: PEG 6000; D: PEG 8000）;，PEG/NA2HPO4系统被选择。蛋白
质的配分系数随重量的增加而降低，这可能是由于在顶部的相的亲水性造成 的。与此相对的是，聚乙二醇的分子量增加导致聚合物链长度的增加，从而 导致了自由值的减少。因此，生物分子会有选择地划分为底相，基于体积排 阻效应，也进行了类似的观察。MTCC 5695脂肪酶分配了PEG 8000 / NA2HPO4的底相，比活性为6325.04U / mg，酶回收率为75.69％，纯化 因子为2.881。芦荟多糖是使用PEG 6000 /(NH4)2 SO4双水相系统。
类型。结果表明，在这种特殊情况下，聚合物-盐体系更受青睐。限制 聚合物-聚合物系统在工业上的使用的原因是由于相组成成分之间的低
密度差异而导致的缓慢的分层。此外，聚合物-聚合物系统(例如。聚
乙二醇/葡聚糖)相对更贵，这限制了他们在工业上的使用。
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3.2.1 ATPS系统的选择
相形成盐的影响
MTCC5695脂肪酶在磷酸氢二钾系统中产量是最高的；恢复率是80.34% ，净化因子为2.04。在硫酸钠系统中发现了最大的恢复(99.2%)，但其纯度却 非常低(0.44)。硫酸镁体系被认为不适用，因为在添加了搅拌下不变化的酶提 取物后观察到沉淀形成，并且静置2小时后增加。 最适宜的系统是磷酸氢二钠系统，其中恢复率为61.87%的脂肪酶具有特 异性活性417.43U/mg和净化因子2.62。对细胞内甘油醛-3-磷酸脱氢酶和小 麦面粉的植物酯酶被ATPS提取和纯化效果不错，净化因子(PF)为18.46倍，产
Graduate paper defense, ZaoZhuang university.
通过PEG/磷酸双水相系统和它的生化特性将脂肪 酶从肠球菌MTCC5695中提取及纯化
高娜 17722960
01
摘 要及介 绍
02
材料与方法
03
酶活力及酶纯度的影响因素
04
总
结
0201PART OEAbstract and Introduction
23
3.2.2 双水相萃取技术的分离与超滤 底相的超滤作用下使得磷酸钠与MTCC5695脂肪酶分
离，从而将纯化因子从4.12提高到5.99，酶的回收率为
82.09%。纯度的增加可以归因于通过膜和磷酸钠进行的 污染物蛋白的渗透。超滤装置的使用促进了MTCC5695脂 肪酶的分离;这反过来又增加了浓度，而纯度却未受影响。 先前的研究报告说，膜处理(超滤)与ATPE的整合不仅促进 了相形成成分与产品的分离，而且也增加了蛋白的纯度。
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2.1 脂肪酶的分离纯化
2.1.4 双水相体系的准备： 称取预定量的相形成溶质，并加入到粗酶提取物中，使体系的总 重量为100％（w / w）在实验过程中，粗酶提取物的重量百分比保持
在20％（w / w）。使用磁力搅拌器将内容物充分混合并平衡，并在
分液漏斗中分离约2小时。两相清楚分离后，观察体系的顶部和底部 的体积，分析脂肪酶活性和总蛋白。所有分区实验在2571℃下重复三
改性剂
β -巯基乙醇和DTT增加了脂肪酶活力。 由于这些化合物通过使二硫
键变性起作用，这表明脂肪酶可能在催化部位附近没有任何二硫键。在 EDTA（二价金属螯合剂）存在下完全丧失活性。 这表明该活性依赖金属离 子，本质属于金属酶。碘化钾使得活性显著降低，抗坏血酸使活性完全丧失。
组特异性试剂
MTCC5695脂肪酶被所有化学改性剂和柠康酸酐抑制，DEPC导致
法开始越来越被业界接受。本次研究主要探讨粪肠球菌MTCC5695的细胞内
脂肪酶的纯化及其表征。另外，MTCC5695的脂肪酶被发现是碱性的，表明 它适合在洗涤剂工业中应用。
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02
PART TWO
Materials and Methods
底物和化学物质
e.faecium MTCC5695、聚乙 二醇硫酸铵、硫酸 钠、硫酸镁、磷酸 二氢钾、氨基酸修 饰剂、蛋白标志物
完全丧失活性。
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3.2 脂肪酶纯化过程的优化
LOREM IPSUM
LOREM IPSUM
LOREM IPSUM
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3.2.1 ATPS系统的选择
在选相盐的选择过程中，聚乙二醇的分子量是不同的，同时保持 聚乙二醇的浓度在一个特定的值。最初的实验是使用聚合物-聚合物和
聚合盐进行MTCC5695脂肪酶的实验，以确定更适合提取的相系统的
次。
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2.1 脂肪酶的分离纯化
2.1.5 酶活力的估值： 将清洗过的细胞颗粒在磷酸缓冲溶液中进行了超声处理，使得细 胞完全分解。为了释放胞内脂肪，0.2克的处理过的细胞被悬浮在1毫
升的裂解缓冲液中(0.05 m磷酸盐缓冲，pH 7)并且为了最大酶的复苏
，在冰浴上借助在15KHz的超声波发生器进行了五轮的细胞破坏.超声 处理过的细胞悬浮物进行了离心（8000xg for 15min）以及裂解产生
的无细胞提取液(LCFE /胞内脂肪酶)被收集。以p -硝基苯乙酸为底物
的分光光度脂肪酶测定法被用于LCFE来测定脂肪酶活性。 蛋白质的浓度是由使用了考马氏蓝的染料结合法测定的。
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2.1 脂肪酶的分离纯化
2.1.6 参数介绍：
分配系数的确定 总氮的分配系数是顶相蛋白质与底相蛋白质在平衡浓度下二者的比值。