现代分子生物实验技术PPT(上)

3. Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数(Log值）存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数， 横坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合 适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有 重nomic library: a storable collection of cellular clones that contains copies of every sequence in the whole genome inserted into a suit基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功 能和调控机理。
常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 Tris-乙酸 （TAE） 工作溶液 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA 贮 存 液（1000 ml） 50×: 242g Tris 57.1ml冰乙酸 100ml0.5mol/L EDTA （pH8.0） 10×: 108g Tris 15.5ml85%磷酸（ 1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0） 5×: 54g Tris 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
核酸电泳技术要点
• 制备凝胶：准确称取琼脂糖粉末，以电泳缓冲液（ TAE/TBE）溶解，微波加热至沸腾，待温度降至约60℃ 时，加EB液，混匀后，迅速倒入预先制好胶槽内。 • 电泳：随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分 子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的 DNA可以5-20 V/cm电压电泳。
Tris-磷酸 （TPE）
1×:0.09mol/L Tris-磷酸 0.002mol/L EDTA
Tris-硼酸 （TBE）
0.5×:0.045mol/L Tris-硼 酸0.001mol/LEDTA
琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系
琼脂糖凝胶浓度/（%） 可分辨的线性DNA大小范围/（kb）
技术要点
• 感受态细菌的制备： • DNA转化：氯化钙法和电转法
3. PCR技术
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应， 是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与 母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增 任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达 调控，基因多态性研究等许多方面。
第五章 分子生物学研究方法
DNA、RNA、蛋白质 操作技术
Yanshan university
Han Zengsheng PhD
DNA
•核酸凝胶电泳技术 NA的合成 •cDNA的构建RNA蛋白质
蛋白质电泳技术 蛋白质印迹 质谱技术
荧光强度 循环数 循环数
4. 荧光探针和荧光染料
1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一 对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探 针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基 团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团 发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时， Taq酶外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光 基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光信号可被监 测到。
实时荧光定量PCR技术
Real time Quantitative PCR
• 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲 线对未知模板进行定量分析的方法。
Ct
1. Ct 值的定义 C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定 的域值时所经历的循环数. 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 3~15个循环的荧光信号的标准偏差的Байду номын сангаас0倍.
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
60~5 20~1 10~0.8 7~0.5 6~0.4 4~0.2 3~0.1
2. DNA转化技术 DNA transformation
• 质粒DNA的转化是指将质粒或以它为载体构建的 重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受 态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子 操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保 证荧光信号的增加与PCR Construction
• 1. 变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双 链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。 • 2. 退火 (annealling)：当温度降低时，引物与模板 DNA中互补区域结合成杂交分子。 3’ 5’ • 3. 延伸(extension)：在DNA聚合酶、 dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’ 方向 3’ 5’ 延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 • 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物 均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目 的DNA以2n的形式增加。
1. 核酸凝胶电泳技术 agarose gel electrophoresis
琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定、 DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段 分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。 由于这种方法操作方便，设备简单，需样品少，分辨 能力高，已成为分子生物学研究中常用方法之一。