黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western_blot分析
葡萄及其制品中真菌毒素研究进展
葡萄及其制品中真菌毒素研究进展作者：谢汉忠，黄玉南，李君，庞荣丽，乔成奎，成昕来源：《农学学报》 2017年第12期摘要：葡萄在生产、贮藏和加工过程中，受环境条件的影响可能受到真菌的污染，进而产生不同的真菌毒素，影响葡萄及其制品的质量安全，给人类健康带来安全风险。
有关葡萄及其制品中真菌毒素的研究，多集中在欧美等葡萄产区国家，中国在这方面研究以及相关的文献报道还比较少。
笔者系统分析了污染葡萄及其制品的真菌类型、污染条件以及产生真菌毒素的种类和含量；通过真菌毒素产生环境的介绍，提出了防治真菌毒素污染的控制手段，特别是真菌毒素分子生物学的深入研究，在区分真菌毒素种类和制定真菌毒素污染的控制技术方面可有效提供技术支撑。
比较各国真菌毒素检测方法的研究，发现中国在研究水果及其制品中真菌毒素的检测方法、制定标准和真菌毒素在水果及其制品中的最大残留限量标准方面都存在不足。
最后，提出了中国开展真菌毒素在葡萄及其制品中的研究方向。
关键词：葡萄；葡萄制品；真菌毒素中图分类号：S-3 文献标志码：B 论文编号：cjas17050009Research Progress of Mycotoxins in Grapes and Its ProductsXie Hanzhong1, Huang Yunan1, Li Jun1, Pang Rongli1, Qiao Chengkui1, Cheng Xin2(1Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/ Laboratory of Quality andSafety Risk Assessment for Fruit (Zhengzhou), Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450009, Henan, China;2Center for Agri-food Quality and Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China)Abstract: Fungi are major pathogens that cause contamination during grape production, storage andtransportation. Several classes of mycotoxins produced by fungi could simultaneously contaminate grape. Inaddition to their ability to cause spoilage of grape fruit and its related products, these mycotoxins could causepotential harm to human health. Studies of mycotoxins in grapes and its products were more concentrated inthe main grape production areas such as Europe and the United States, but less in China. This papersystematically analyzed the kinds of fungus contaminating grapes and its related products, pollution conditions,mycotoxins types and pollution levels. Through the introduction of mycotoxins producing environment, itdeveloped prevention strategies and control methods for mycotoxin contamination. With advancement ofscientific research in molecular biology of mycotoxins, progress was achieved in the identification ofmycotoxins and the development of techniques in controlling mycotoxins contamination. This review found thatstandards of the maximum residue levels and determination methods of mycotoxins in fruit and its products inChina were insufficient by comparing determination methods of mycotoxins in other countries. Finally, itproposed future research direction of mycotoxins in grape and itsrelated products in China.Key words: Grape; Grape Products; Mycotoxins0 引言真菌毒素(mycotoxin)是真菌在食品、农产品或饲料中生长所产生的有毒次生代谢产物，可直接污染食品、农产品和饲料，间接污染动物产品，对人类健康构成风险，是食品安全最重要的风险因子之一。
酶工程课后问答题
酶⼯程课后问答题第⼀章绪论1.什么叫酶⼯程？酶⼯程的主要任务是什么？答：（1）酶的⽣产与应⽤技术过程称为酶⼯程。
（2）酶⼯程的主要任务是经过预先设计，通过⼈⼯操作，获得⼈们所需的酶，并通过各种⽅法使酶充分发挥其催化功能。
2.常⽤酶的活⼒单位及其定义是什么？答：常⽤酶的活⼒单位：IU和卡特（kat）IU：表⽰每分钟催化1umol的底物转化为产物的酶量为⼀个酶活⼒单位。
卡特（kat）:表⽰每1s催化1mol底物转化为产物的酶量定义为 1卡特3.液体酶的酶活⼒测定⼀般要经历哪些步骤？举例说明。
答：㈠液体酶的酶活⼒测定⼀般哟啊经过四个步骤：①根据酶催化的专⼀性，选择适宜的底物，并配制成⼀定浓度的底物溶液。
②根据酶的动⼒学性质，确定催化反应的温度、PH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。
③在⼀定的条件下，将⼀定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。
④反应到⼀定的时间，取出适量的反应液，运⽤各种⽣化检测技术，测定产物的⽣成量或底物的减少量。
㈡举例说明：如测定蛋⽩酶的活⼒时，选择蛋⽩作为底物，并配制成⼀定浓度的溶液；根据蛋⽩酶的动⼒学性质，确定溶液的温度为28℃，PH值为8.5；将底物蛋⽩液蛋⽩酶混合均匀，取出适量的反应液，测出产物的⽣成量或底物的减少量。
4、酶的⽣产⽅法有⼏种？各有何优缺点？答：酶的⽣产⽅法有三种。
㈠提取分离法：采⽤各种提取、分离、纯化技术从动物和植物的组织、器官、细胞或微⽣物中将酶提取出来，再进⾏分离纯化的技术过程。
优点：设备较简单，操作⽅便。
缺点：受⽣物资源、地理环境、⽓候条件影响，或者使⼯艺路线变得繁杂。
㈡⽣物合成法：利⽤微⽣物细胞、植物细胞或动物细胞的⽣命活动⽽获得⼈们所需酶的技术过程。
优点：⽣产周期短，酶产率较⾼，不受⽣物资源、地理环境和⽓候条件影响。
缺点：对发酵设备和⼯艺条件要求⾼㈢化学合成法：采⽤化学技术合成⼈们所需酶的技术。
优点：对认识和阐明⽣物体的⾏为和规律、设计和合成⾼效率具有重要理论意义。
黑曲霉_葡萄糖苷酶的筛选_克隆及表达
2009-06-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00423
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、 克隆及表达*
唐德芳1, 2 裴小琼1 李晓璐1 胡 承 2 陈 军3** 吴中柳1**
1.6 bgl1基因的克隆和序列分析
将 PCR 扩增产物纯化后连接到 pMD18-T克隆载体上， 转 化到 E. coli DH5α 感受态细胞 . 筛选得到含bgl1基因的阳性克 隆， 进行酶切鉴定和送 Invitrogen公司序列测序分析. 序列已 保存在 NCBI GenBank， 收录号为FJ431207.
反向引物为 FTAR： 5'-TTAGTGAACAGTAGGCAGAGACG-3'. 第 一步反转 录 反 应 组 成 为： 1 µ L 10 mmol/L dNTP、1 µ L 2.5 µ mol oligdT Primer、 1 µ L 黑曲霉 FTA-008总 RNA及 7 µ L ddH2O； 混合物在 65 °C下处理 5 min后冷却到 4 °C； 然后加入4 µL 5×Prime ScriptTM Buffer、 0.5 µL 40 U/µL Rnase inhibitor、 0.5 µL Rtase及 5 µL ddH 2O， 混匀后在 42 °C下处理 20 min后冷却 到 4 °C. 第二步 PCR反应为50 µL体系， 其中含有5 µL 10×PCR buffer、2 µL dNTP (10 mmol/L each)、 10 µmol引物各 0.5 µL、 0.5 µL 5 U/µL TaKaRa Ex TaqTM HS和 5 µL反转录反应液 . 反应 条件： 94 °C 30 s； 58 °C 30 s； 72 °C 3 min； 30个循环. PCR产物 用1%琼脂糖凝胶电泳检测并用回收试剂盒回收约 2.5 kb片段 .
黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
表达检测其蛋 白表达形式 和活性 ， 为构建食 品级载体做准备 。
基金项 目： 国家 自然科学基金（ ｏ ０ ７ ５０ ３ ８ ２９ ） 中央高校基本 国家重点实验室 ＭＥ Ｑ Ｎ ７ ２７ ， ７ ３３ ； ３ ０ Ｋ Ｏ博士构 建 的 ｐ Ｉ９ ．Ｇ２质 粒为模 ＰＣ Ｋ １ １ ３ 科研业务费专项资金资助（ ｏ Ｋ ２ ０ ０ １ Ｊ Ｑ ０９ ２ ） Ｎ Ｙ ０ ９ ２ ， ２０ ０ ２ Ｊ Ｋ
关于黑 曲霉 Ｂ葡 萄 糖苷 酶 基 因 的研 究 报道 仍 然 较 少 ］ 一 。
本课题 将 黑 曲 霉 的 Ｂ葡 萄 糖 苷 酶 基 因 （ ｅ Ｂ ｎ ． Ｇ ｎ ａｋ登 录 号
Ｅ ２ ３ ８ ． ） 隆到 原 核表 达 载 体 ｐ Ｔ２ ａ上 ， Ｕ３７８１ 克 Ｅ ．８ 转化 Ｅ ｃｌ ． ｏ ｉ Ｂ２１ Ｄ ３ 进行 ， Ｉ （Ｅ ） 运用 Ｃ ｌ ９培养基 筛 选 阳性 克隆 ， ｅ— Ｍ 并诱 导
的是丝状真菌 ， 主要为曲霉属和木霉属 ， 而细菌 中研究较 多的 是芽孢杆菌属 Ｊ 。 研究表 明， 黑曲霉 是 Ｂ葡 萄糖 苷酶 酶活 较高 的菌株 ， 一 但
２ ０ｍ ，２ ℃ 高压蒸 汽灭 菌 １ ｎ ２ ０ｍｌ１ｍｏ ・ Ｍｇ ０ ｌ１ １ ５ｍｉ） ０ ， ｌＬ ．
Ｂ ｌ ｌ１ｎｔ ｇｎ ａｍ ｎ ｙＰ Ｒ， ｌｎｄｉｔ ｐ Ｔ２ ａｖｃ ｒ ｎ ａｓ ｒ ｄｉｔ Ｅ ｃｌＢ ２ Ｄ ３ ， ｃｅｎｄｃ ｎ ｓ ｙＣ ｌ ｇ ｆ １ ｅｇ ｅｅｆ ｇ ｅ ｔ Ｃ ｃｏｅ ｏ Ｅ －８ ｅｔ ｄｔ ｎｆ ｍｅ ｏ ．ｏ Ｌ １（ Ｅ ） ｓｒｅ ｅ ｌ ｅ ｂ ｅ ２ ｕ． ｈ ｒ ｈ ｎ ｏａ ｒ ｏ ｎ ｉ ｏ —
ｐ Ｔ２ ａ载体 ， Ｅ ．８ 转化 Ｅ ｃｌＢ２１ Ｄ ３ ，ｅ． ９培养基筛选 阳性克 隆， Ｄ Ａ测序分析 ， ．ｏ Ｉ （ Ｅ ） ｃ １ ｉ Ｍ 经 Ｎ 成功构建 ｐ Ｔ ８ ・ｇ Ｅ ２ ａＢ ｌ 达载体 。Ｓ Ｓ ２表 Ｄ— ＰＧ Ａ Ｅ显示 ， 重组菌经 ＩＴ Ｐ Ｇ诱导后表达 了 目的蛋 白 ， 其相对 分子质量 与预期 结果相符 。结果 Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ ．Ａ Ｅ显示蛋 白以包涵体形式表达 ， 克隆可用 ｅ ｌ ９培养基筛选 。结论 ｅＭ －
黑曲霉β-葡萄糖苷酶菌株的筛选
黑曲霉β-葡萄糖苷酶菌株的筛选胡宜亮;杜迅;刘德海;宁萌;董磊【摘要】From 17 strains of Aspergillus niger,vfe obtained five strains of A.niger by using the plate transparent circle method with oxford cup.A.niger niger-2 was selected according solid fermention experiments for enzyme production, the results showed it produced high β-glucosidase activity, higher cellulase activity (CMC) and the filter paper activity (FBA) of the strain during the same fermentation. Β-glucosidase activity reached to 78.75 U/g, cellulase activity reached to 312.15 U/g, and the filter paper activity reached to 782.6 U/g.%采用牛津杯平板透明圈法对研究室保藏的17株黑曲霉菌株进行了β-葡萄糖苷酶产生菌初筛,得到5株透明圈相对明显的菌株,经固态发酵产酶复筛及相关纤维素酶活力的检测,选出一株β-葡萄糖苷酶酶活力高、且纤维素酶活力也较高的菌株niger-2,其β-葡萄糖苷酶酶活力为78.75 U/g、纤维素酶(CMC)活力为312.15 U/g、滤纸酶活力(FBA)为782.6 U/g.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2011(029)012【总页数】4页(P1451-1454)【关键词】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;纤维素酶;筛选【作者】胡宜亮;杜迅;刘德海;宁萌;董磊【作者单位】河南省科学院生物研究所,郑州 450008;河南省科学院生物研究所,郑州 450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州 450008;河南省科学院生物研究所,郑州 450008;河南省工业酶工程技术研究中心,郑州 450008;河南省科学院生物研究所,郑州 450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州 450008;河南农业大学生命科学学院,郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】Q556+.2β－葡萄糖苷酶分布较为广泛，存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内．但植物来源酶的活性远比微生物来源的β－葡萄糖苷酶低．β－葡萄糖苷酶又称β－D－葡萄糖苷葡萄糖水解酶，属纤维素酶，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶，能够水解结合于末端非还原性的β－D－葡萄糖苷键，同时释放出β－D－葡萄糖和相应的配基[1]．β－葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用．β－葡萄糖苷酶的主要作用是用于降解纤维素，在酶解纤维素时起着至关重要的作用，能协助纤维素酶降解纤维素，把纤维素酶降解生成的纤维二糖和三糖转化为可发酵的葡萄糖 [2-3]．β－葡萄糖苷酶的生物学功能使它在生产中有着广泛的应用．低活力的β－葡萄糖苷酶活性是造成纤维素酶水解纤维素资源得率低、酶用量大、成本高的关键因素之一，制约了纤维素酶的有效应用及发展．本研究针对上述生产中存在的问题，应用生物技术手段，筛选选育出高活力的产β－葡萄糖苷酶生产菌株，应用于纤维素酶的生产及应用．黑曲霉（Aspergillus niger）是公认的安全菌株，而且该菌产β－葡萄糖苷酶活力较高[4]．通过对研究室保藏的十余株黑曲霉菌株进行筛选，得出一株β－葡萄糖苷酶高产菌，经所产酶酶系分析，该菌株同时具有高活力的纤维素酶（CMC）活力和滤纸酶（FBA）活力，并对其性质做了进一步研究，以待为下一步工作打下基础，为工业化生产提供依据．1．1 材料1．1．1 出发菌株从本研究室保藏菌株中选出17株黑曲霉菌株作为出发菌株．1．1．2 培养基 1）保藏培养基：①Czapek’s 琼脂培养基：蔗糖 30．0 g，NaNO3 3．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，KC l 0．5 g，FeSO4·7H2O 0．01 g，K2HPO4 1．0 g，琼脂 15．0 g，蒸馏水 1 000 m L，p H 6．0～6．5．②马铃薯（土豆）培养基：取洗净去皮、挖去芽眼的马铃薯200 g，切成片状或丝状，加水1 000 m L，煮沸15 min，用纱布过滤，加20 g琼脂、20 g葡萄糖，再加热使其溶化，补水至体积为1 000 m L，即成马铃薯培养基．2）筛选培养基：①纤维二糖15．0 g，NaNO3 3．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，KCl 0．5 g，FeSO4·7H2O 0．01 g，K2HPO4 1．0 g，刚果红0．2 g，琼脂15．0 g，蒸馏水 1 000 m L，p H 6．0～6．5．②CMC－Na 15．0 g，NaNO3 3．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，KCl 0．5 g，FeSO4·7H2O 0．01 g，K2HPO4 1．0 g，刚果红 0．2 g，琼脂 15．0 g，蒸馏水 1 000 m L，p H6．0～6．5．3）发酵培养基：麸皮 100 g，水100 m L，pH自然．以上培养基均需 0．1 MP a，灭菌 0．5 h．1．1．3 主要仪器 T6新世纪（北京普析）；HH恒温水浴锅（江苏金坛）；HZF－A200电子天平（福州华志）；LS－B75L－Z立式蒸汽灭菌器（江阴滨江）；p H－2型酸度计；秒表．1．1．4 主要试剂乙酸（AR）；乙酸钠（AR）；水杨素（生化试剂，中国医药总公司）；3，5—二硝基水杨酸（AR）；氢氧化钠（AR）；酒石酸钾钠（AR）；亚硫酸钠（AR）；苯酚（AR）；磷酸氢二钠（AR）；柠檬酸（AR）；羧甲基纤维素钠（AR）；无水葡萄糖（AR）．1．2 方法1．2．1 筛选方法1）初筛：为防止黑曲霉随着菌丝孢子蔓延影响到透明圈观察，采用牛津杯平板透明圈法．具体做法是预先制备纤维二糖的筛选培养基琼脂平板，每个平板内相距一定间隔制成同等大小的孔穴放置牛津杯，试管斜面菌株用无菌水制成菌悬液，吸取1~2滴分别涂布于初筛培养基平板上牛津杯内，28～30℃培养3~4 d．观察生长的单菌落周围产生的透明圈大小，依此初步判断菌株产β－葡聚糖苷酶活力的能力，根据酶水解底物所产生的扩散圈大小比较菌株产酶能力．2）复筛：从初筛平板中选取菌株周围透明圈较大的单菌落转接到试管保藏培养基中培养，然后再接入固体发酵培养基进行复筛．将初筛菌株孢子挑取2～3环，接入固体培养基中，每500 m L三角瓶装入50 g固体培养基（湿基），28～30℃培养36 h，进行酶活力检测，以筛选出酶活力最高的菌株．同样操作方法，筛选纤维素酶产生菌株．1．2．2 β－葡萄糖苷酶的检测方法[5]1）标准曲线的绘制：分别吸取 0．1%标准葡萄糖溶液0．0，0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2，1．5 m L 分别于1，2，3，4，5，6，7，8 号比色管中，加蒸馏水将每支试管至 2 m L．再加入3．0 m L3，5－二硝基水杨酸显色液，煮沸5 min．冷却后，加蒸馏水至25 m L，摇匀后用分光光度计，在530 nm波长下比色，以1号管为对照，记录各管的光密度值．以光密度值作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含量的毫克数为横坐标，绘制标准曲线．2）测定方法：①样品测定：取一只小试管（15 mm×150 mm），加1%水杨素溶液1．0 m L，于50°C水浴中预热 2～3 min，加适当稀释酶液 1．0 m L，50 °C 保温 30 min，取出立即加入 3，5－二硝基水杨酸 3．0 m L，沸水浴煮沸5 min，冷却后定容至25 m L，用分光光度计530 nm处比色测定OD 值．②空白测定：另取小试管加水杨素溶液 1．0 m L，先加入 3．0 m L3，5－二硝基水杨酸，再加适当稀释酶液 1．0 m L，50 °C 保温 30 min，沸水浴煮沸5 min，冷却后定容至25 m L，用分光光度计530 nm处比色测定OD值．由光密度值在标准曲线上查出葡萄糖质量（mg），并计算出酶活力．3）β－葡萄糖苷酶酶活力定义：50°C及p H4．8条件下水解1 h催化底物水解生成1 mg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（μ）．1．2．3 CMC酶活力的测定（3，5－二硝基水杨酸比色法）[6]1）标准曲线的绘制：精确称取分析纯的无水葡萄糖 250．00 mg，溶于蒸馏水中，定容至 250 mL 容量瓶中，即葡萄糖含量为 1 mg/m L．吸取此液 0．0，2．0，4．0，6．0，8．0，10．0 m L，分别定容至 50 m L．分别吸取 2．5 m L 上述溶液分别于 1，2，3，4，5，6 号试管中，再各加 2．5 m L 3，5－二硝基水杨酸，煮沸5 min．冷却后，用分光光度计，以1号管作对照在530 nm波长下比色，记录各管的光密度值．以光密度值做纵坐标，2．5 m L糖溶液中含糖毫克数做横坐标，绘制标准曲线（糖液分别含糖 0．0，0．1，0．2，0．3，0．4，0．5 mg）．2）测定方法：①样品测定：取一只小试管（15 mm×150 mm），加羧甲基纤维素钠 2．0 m L，于50 °C 水浴中预热 2～3 min，加适当稀释酶液 0．5 m L，50 °C 保温 30 min，取出立即加入3，5－二硝基水杨酸2．5 m L，沸水浴煮沸5 min，用分光光度计530处比色测定OD值．②空白测定：另取小试管加羧甲基纤维素钠2．0 m L，先加入2．5 m L 3，5－二硝基水杨酸，再加适当稀释酶液0．5 m L，50°C保温30 min，沸水浴煮沸5 min，用分光光度计530处比色测定OD值．由光密度值在标准曲线上查出葡萄糖量（mg），并计算出酶活力．3）CMC酶活力定义：1 g固体酶粉（或1 m L酶液），在 p H 为 5．0，50°C条件下，30 min内水解羧甲基纤维素钠生成1 mg葡萄糖的酶量，称为1个纤维素酶（CMC酶）活力单位．1．2．4 滤纸酶活力的测定（3，5－二硝基水杨酸比色法）[6] 取4．0 m L酶液和醋酸－醋酸钠缓冲液1．0 m L于小试管中，加入1 cm×3 cm新华滤纸1条，滴入甲苯2～3滴防腐，保温40°C静止反应24 h，取出观察滤纸崩溃现象．同时做一个不加酶液的空白对照．其滤纸酶酶活力的标准曲线的绘制及测定同CMC酶活力的测定．滤纸酶酶活力表示方法：1 g酶粉或1 m L酶液，在p H4．6，温度40°C条件下，24 h能水解新华滤纸生成1 mg葡萄糖的酶量，称为1个滤纸酶（FB A酶）活力单位．2．1 初筛结果以17株黑曲霉菌株作为出发菌株，通过筛选培养基，由发酵环透明圈法初筛出具有明显透明圈的菌株5 株，分别为niger－2、niger－5、niger－6、niger－12、niger－16，其中niger－2 透明圈图像见图1（平板反面）、图2（平板正面）．2．2 β－葡萄糖苷酶酶活力测定吸光度标准曲线按照β－葡萄糖苷酶酶活力测定方法对葡萄糖吸光度（OD）做标准曲线，如图3所示．2．3 纤维素酶（CMC）酶活力测定吸光度标准曲线按照纤维素酶（CMC）酶活力测定方法制作葡萄糖吸光度（OD）标准曲线，如图4所示．2．4 滤纸酶活力测定吸光度标准曲线按照滤纸酶活力测定方法制作葡萄糖吸光度标准曲线．葡萄糖吸光度标准曲线制作同CMC酶活力（图4）．2．5 五株黑曲霉菌株发酵产酶检测结果将初筛出的 5 株菌株 niger－2、niger－5、niger－6、niger－12、niger－16，分别编号菌株 1 号、2 号、3 号、4 号、5号进行固态发酵产β－葡萄糖苷酶的复筛试验，同时并对发酵产品进行纤维素（CMC）酶活力、滤纸酶活力检测，以便对3种酶活力进行比较，选育出适宜的菌株．从表1可以看出，β－葡萄糖苷酶酶活力1号＞3号＞2号＞4号＞5号．从表2可以看出，CMC酶活力2号＞3号＞1号＞5号＞4号．从表3可以看出，滤纸酶活力4号＞1号＞2号＞3号＞5号．从表4可以看出，滤纸被酶分解崩溃的程度4号＞1号＞2号＞3号＞5号．这与滤纸酶活力的高低呈正相关．从表1～表4检测观察结果可以得出，1号β－葡萄糖苷酶酶活力最大；滤纸酶活力仅次于4号，且相差不大；CMC酶活力略小于2号、3号酶活力．从研究目标筛选β－葡萄糖苷酶高产菌株出发，故选择1号菌株即niger－2进行进一步选育研究．经过牛津杯平板透明圈法初筛、固态发酵复筛试验并对相关酶酶活力进行了分析，初步筛选选育出一株β－葡萄糖苷酶酶活力高、且其它纤维素酶活力也较高的菌株niger－2，其β－葡萄糖苷酶酶活力为 78．75 U/g，CMC 酶活力为 312．15U/g，滤纸酶活力为782．6 U/g，作为备选菌株，为下一步选育出更高β－葡萄糖苷酶菌株打下基础．【相关文献】［1］王华夫，游小青．茶叶中β－葡萄糖苷酶活性的测定［J］．中国茶叶，1996（3）：16－17．［2］周晓云．酶技术［M］．北京：石油工业出版社，1995．［3］陈驹声．酶制剂生产技术［M］．北京：化学工业出版社，1994．［4］刘小杰，何国庆，陈启和，等．黑曲霉β－葡萄糖苷酶发酵培养基的优化［J］．中国食品学报，2006，6（2）：6－10．［5］ Karaffa L，Fekete E，Gamaufc，et al．D－g alactose i nduces c ellulase g ene e xpression in h ypocrea jecorina at l ow g rowth r ates［J］．Microbiology，2006，152（6）：1507－1514．［6］刘德海，杨玉华，李新杰，等．纤维素酶酶活力的测定方法［J］．中国饲料，2002（17）：27-28．。
黑曲霉中国株(3.758)葡萄糖氧化酶(GOD)基因的克隆与结构分析
摘要 ［ 目的 ］ 充分 开发 黑 曲霉 在轻 工 业 中的 用途 。方 法 ］ 为 ［ 以黑 曲霉 中 国株 （． ８基 因组 Ｄ Ａ为模 板 ， Ｌ ａ Ｎ ３５） ７ Ｎ 用 ＡＴｑＤ Ａ聚 合酶 对 葡 萄糖 氧化 酶 （ Ｏ 基 因进 行 Ｐ Ｒ扩 增 ， 增 片段 纯化 后 与 ｐ Ｃ Ｔ载 体 连接 后 ， 化 到 大肠 杆 菌 Ｄ ５ｔ 受 态 细胞 ， 琼脂 糖 凝胶 Ｇ Ｄ） Ｃ 扩 Ｕ ｍ－ 转 Ｈ ｃ感 经 电泳 法、 酶切 和 Ｐ Ｒ鉴 定获 得 阳性 克 隆。 获得 含 Ｇ Ｄ基 因的 克隆进 行 测序 ， Ｃ 对 Ｏ 分析 其 蛋 白质氨 基 酸序 列及 限制 性 内切 酶 的 图谱 。 结 ［ 果 ］ Ｐ Ｒ扩增 获得 约 １ ｂ的 片段 。 得 的 Ｇ Ｄ基 因编 码 序 列 共 １ １ ｐ与 报 道 的 黑 曲霉 （ Ｔ Ｃ ０ ９Ｇ Ｄ基 因序 列仅 有 ３个 经 Ｃ ．ｋ ８ 获 Ｏ ８ ， ８ ｂ Ａ Ｃ ９ ２ ）Ｏ 碱基 之 差 。 该基 因序 列具 有 多 个限制 性 内切 酶 位点 。 曲霉 不 同菌株 与 中国株 （． ８ Ｇ Ｄ基 因 的 同源性 比较 表 明 ， 同黑 曲霉 菌株 黑 ３ ５ ）Ｏ ７ 不 中 Ｇ Ｄ基 因 不同 ， 菌株 Ａ Ｃ ９ ２ 菌株 Ｎ Ｒ － 同一 菌株 。结论 ］ 研 究获 得 了 Ｇ Ｄ基 因的全 长 序 列 ， Ｇ Ｄ的 生物 工程 Ｏ 而 Ｔ Ｃ ０９与 Ｒ Ｌ３是 ［ 该 Ｏ 为 Ｏ
Ｅ ｃ ｅ ｗｈｉ ｏｉ Ｔ ｂａｎｅ ｏ ｉｉｅｃｏ ｅｗａ ｄ ｎｔ ｅ ｙａ ａｏ ｅｇ ｌｅｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓ ｅ ｚ ｍｅｄｉｅ ｔ ｎ ａ ｄ ＰＣＲ． ｅｏ ｔｉ ｄ ｃｏ ｅｗｉ ｓ ｈ ｒ ａｃ ｌ． ｈｅｏ ｔｉ ｄ ｐ ｓｔ ｌｎ ｓｉ ｅ ｉ ｄ ｂ ｇ ｒ ｓ ｅ ｌｃｒ ｐ ｏ ｅ ｉ． ｎ ｙ ｇ ｓｉ ｎ ｖ ｉ ｆ ｏ Ｔｈ ｂａｎｅ ｌｎ ｔ ｈ
菌种报告-黑曲霉
菌种报告—黑曲霉一、黑曲霉简介①、黑曲霉（Aspergillus niger）属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等，是重要的发酵工业菌种。
②、培养温度23～28℃，好氧二、使用注意事项①、是四类病原微生物，即在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。
但由于生长快速，极易通过空气扩散污染环境，对产品的生产检验人员与环境构成威胁。
故操作过程要在阳性室生物安全柜中进行。
②、所有的培养物、储存物及其它的废物在释放前，均应121℃，30min湿热蒸汽灭菌。
实验结束后，用0.1%的新洁尔灭擦拭台面，照紫外消毒。
菌种保存方案—黑曲霉（Aspergillus niger）1、实验材料：器具：-80℃冰箱，2～8℃冰箱，试管，电动助吸器，锥形瓶，恒温培养摇床，1ml移液管，10ml移液管，冷冻管，振荡器，棉塞，接种环，250ml盐水瓶，500ml 盐水瓶试剂：冻干菌种，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，TSA平板，SDA平板，20%甘油，含0.05%（v/v）聚山梨酯80的生理盐水2、实验步骤：2.1 菌种复苏和复壮（改良马丁培养基）2.1.1 将干菌种（0代）按上述步骤转移到装有100ml改良马丁液体培养基的锥形瓶中复苏（第1代），23～28℃摇床震荡培养5天。
2.1.2 用接种环挑起活化后的孢子悬液，划线到改良马丁琼脂斜面复壮，接种10支试管（第2代），23～28℃静置培养5～7天。
2.1.3 向每支试管中加入5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的生理盐水，反复吹打洗脱孢子。
将孢子悬液全部转移至250ml盐水瓶中，2～8℃冻存备用。
2.2 稀释倍数探索2.2.1 取1ml孢子悬液加入9ml生理盐水中，混匀得10-1管，同法依次稀释至10-6。
2.2.2 取10-3～10-6梯度稀释孢子悬液，1ml涂布SDA平板，各做3个平行。
黑曲霉果胶裂解酶基因的克隆与原核表达
Ｃｌ ｏ ｎｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ Ｐｒ ｏ ｋａ ｒ ｙ ｏｔ ｉ ｃ Ｅｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐｅ ｃ ｔ ｉ ｎ Ｌｙ ａ ｓ ｅ Ｇｅ ｎ ｅ ｆ ｒ ｏ ｍ Ａｓ ｐｅ ｒ ｇｉ ｌ ｌ ｕｓ ｎｉ ｇｅ ｒ
ｆ ｒ ａ ｇｍ ｅ ｎ ｔ ｗａ ｓ １ ４ ３ １ ｂｐ ｉ ｎ ｌ ｅ ｎ ｇｔ ｈ， ｗ ｈｉ ｃ ｈ ｓ ｈａ ｒ ｅ ｄ ９ ９ ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｔ ｙ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｋ ｎｏ ｗｎ ＰＬ ｇ ｅ ｎｅ （ ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ
ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｐ ａ ｉ ｒ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎｅ ｄ ｔ ａ ｒ ｇｅ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈｅ ｃ ｏ ｎｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ｒ ｅ ｇｉ ｏ ｎｓ ， ａ ｎｄ ｔ ｈｅ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕｒ ｅ ｇｅ ｎｅ ｅ ｎｃ ｏ ｄｉ ｎ ｇ
一
９ ９ 。表 达产 物经 １ ２ Ｓ Ｄ Ｓ—Ｐ ＡＧ Ｅ 电泳 ， 得 到 了一 条 大 小约 为 ５ ０ ｋ Ｄ 的条 带 ， 与 预期 分 子 量相 符， 证 明真 菌 Ｐ Ｌ基 因在 Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｂ Ｌ ２ １中可 以有效表 达 。 关键 词 ：黑曲霉 ；果胶 裂 解酶 ；重 组 Ｐ Ｃ Ｒ；原核 表达
谢 茂 芳 ， 薛保 国 ， 吴 坤。
（ １ ． 河南省农业科学 院， 河 南 郑州 ４ ５ ０ ０ ０ ２ ；２ ． 河 南农 业 大 学 ， 河南 郑州 ４ ５ ０ ０ ０ ２ ）
摘要 ： 根 据 ＮＣ Ｂ Ｉ 上果胶 裂 解酶 （ Ｐ Ｌ ） 基 因在 黑 曲霉基 因组 上 的 分布 特 点设 计 特 异 引物 ， 通 过 重 组
黑曲霉木聚糖酶XynB生 物信息学初步分析
2、方法
2.1 同源性与进化分析 AY126481.1序列在mega中与 gb|AY126481.1| 、 ref|XM_001258637.1|、 ref|XM_001221294.1|、 gb|EU532196.1|、ref|XM_959052.2|、 emb|AJ292317.1| 、gb|HQ286639.1| 进行序列对比与进化树的构建
黑曲霉木聚糖酶XynB生 物信息学初步分析
背景
国内外研究现状 存在的问题
实验目的
材料与方法 结果与分析
背 景
木聚糖酶因可以水解植物细胞壁的主要成 分木聚糖而在饲料、造纸、食品、医药、纺织 以及能源等领域具有很大的应用价值与潜力。 已有不少研究者对真菌木聚糖酶基因进行 了克隆表达。表达过程中，选择构建一个合适 原核表达体系需要综合考虑表达载体、宿主、 表达诱导条件三大因素。而目前已有的研究主 要集中在木聚糖酶基因的克隆及其大肠杆菌重 组菌诱导条件的优化上，还未见不同表达载体 和宿主菌株对木聚糖酶表达水平影响的详细研 究报道。
3、在木聚糖酶的应用技术方面，应该深入研究底
物种类、底物浓度与木聚糖酶使用量的关系，探讨 不同酶制剂间的配伍效果及合适的复合酶载体。
实验意义与目的
黑曲霉是公认的自然界中高产木聚糖酶的菌 株之一，但其酶系复杂，酶活力与性质仍不能满 足所有工业领域，而且工业应用中分离纯化的难 度与成本较大。通过基因工程的手段获得单一酶， 提高酶活性与改善其酶学性质是降低工业生产成 本、满足工业应用的有效手段。 本文对木聚糖酶XynB进行生物信息学初步 分析，希望有助于木聚糖酶的结构与功能研究取 得突破性进展，使其在工业上成本有所降低。
pPIC9k
pPIC9k是穿梭质粒，即指一类人工构 建的具有两种不同复制起点和选择标记， 因而可以在两种不同类群宿主中存活和复 制的质粒载体。穿梭质粒不仅可以在大肠 杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草芽 孢杆菌、酵母、动物或植物细胞中扩增和 表达。这样利于对质粒的分子生物学操作 和大量制备。
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究李晓东;周明;杨丽娜;夏伟;王俊;钱利纯【摘要】研究黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性,采用酶学研究方法,通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100纯化了β-葡萄糖苷酶,并进行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及米氏常数等特性研究,采用SDS-PAGE凝胶电泳测定了分子量.研究表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃、最适反应pH为4.5;在40、50和60℃下较稳定,80℃以上稳定性差;β-葡萄糖苷酶在pH为3、7、8、9的缓冲液中的稳定性很差,在pH为4、5、6的缓冲液中稳定性较好,其中在pH为5时,稳定性最好;酶的Km=41.67 mmol/L,Vmax=23.81 U/L;其分子量为65.2 ku.β-葡萄糖苷酶在饲料工业具有良好的应用前景.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2014(034)003【总页数】5页(P14-18)【关键词】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;酶学特性【作者】李晓东;周明;杨丽娜;夏伟;王俊;钱利纯【作者单位】安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058【正文语种】中文【中图分类】Q93;Q814β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.2;beta-glucosidase)属于水解酶类，是纤维素酶系中的一种，能水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖。
Liebig等(1837)首次在苦杏仁中发现了β-葡萄糖苷酶，其后发现β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界许多植物中。
Bongon［1］、Masaru 等［2］、Elias等［3］、汪大受［4］分别从苦杏仁、葡萄、大豆、玉米、黑樱桃、水稻和大豆中分离纯化了β-葡萄糖苷酶。
黑曲霉中单宁酶基因的克隆表达及酶学特性分析
黑曲霉中单宁酶基因的克隆表达及酶学特性分析李海花;张蕾;陈龙宾;朱琪;乔家运;王文杰【摘要】本试验旨在从一株黑曲霉中克隆单宁酶基因，并研究其酶学性质。
利用前期分离的一株黑曲霉菌株SL-5，克隆出单宁酶基因，基因全长1533 bp，编码510个氨基酸；使用大肠杆菌BL21作为宿主，并使用pET32a（+）作为表达载体，实现了单宁酶基因在大肠杆菌中的表达。
纯化的单宁酶能够降解单宁，酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为6.0。
%This study was conducted to clone tannase gene from Aspergillus niger and investigate its tannin-degrad-ing characterization.We cloned the tannase gene from Aspergillus niger (SL-5),and the open reading frame of the gene contained 1533 bp coding for a 510 amino-acid matured protein,and expressed the tannase protein (rTannase)in Es-cherichia coli by using pET32a (+)vector.We found that the purified tannase was able to degrade hydrolysable tannin,ex-hibiting optimal enzyme activity at 40℃and pH 6.0.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2016(000)011【总页数】4页(P25-28)【关键词】单宁;单宁酶;大肠杆菌;克隆;表达【作者】李海花;张蕾;陈龙宾;朱琪;乔家运;王文杰【作者单位】天津市畜牧兽医研究所，天津 300381; 天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381;天津市畜牧兽医研究所，天津 300381; 天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381;天津市畜牧兽医研究所，天津 300381; 天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381;天津市畜牧兽医研究所，天津 300381; 天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381;天津市畜牧兽医研究所，天津300381; 天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381;天津市畜牧兽医研究所，天津 300381; 天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381【正文语种】中文【中图分类】S816.3［Abstract］This study was conducted to clone tannase gene from Aspergillus niger and investigate its tannin-degrading characterization.We cloned the tannase gene from Aspergillus niger（SL-5），and the open reading frame of the gene contained 1533 bp coding for a 510 amino-acid matured protein，and expressed the tannase protein（rTannase）in Escherichia coli by using pET32a（+）vector.We found that the purified tannase was able to degrade hydrolysable tannin，exhibiting optimal enzyme activity at 40℃and pH 6.0.［Key words］tannins；tannase；Escherichia coli；cloning；expression单宁广泛分布于植物的各部位，如树叶、树皮、树干和种子。
药用酶的生产技术
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter） 菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维C中间体）
(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生。 枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。
mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。
1
以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过程(翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。
2
蛋白质合成的几个要素(2)-遗传密码
1
2
3
4
5
蛋白质合成的几个要素(3)- 转运RNA tRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。 tRNA有特异性，至少有20种以上。每种tRNA的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应的密码互补结合。
1
某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为
2
该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成
3
的诱导。能诱导酶合成的物质叫诱导物。被诱导合成的
4
酶叫诱导酶。
细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏)
调节基因
启动子
lacZ
lacA
CAP
cAMP
CAP-cAMP 复合物
mRNA
当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则cAMP的浓度降低，CAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。
黑曲霉固态发酵产糖化酶的研究
研究报告
中国酿造
2009 年 第 1 期
总第 202 期 ·27·
糖 化 酶（Glucoamylase，EC.3.2.1.3）又 名 葡 萄 糖 淀 粉 酶，是一种酸性糖苷水解酶，从淀粉或淀粉类似物的非还 原端按顺序切开 α-1，4 糖苷键，也能水解 α-1，6 糖苷键和 α-1，3 糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶广泛地应用于酒精 、白 酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、淀粉糖等工业中，是我 国用量最大的酶制剂产品[1]。
2009 No．1
·26· Serial No．202
China Brewing
Research Report
黑曲霉固态发酵产糖化酶的研究
钟 浩 1，谭兴和 1，熊兴耀 2，苏小军 2，杨 泱 1
（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128 )
11000 9800 13790 15670 14350 19000 11200 12350 12450
由表 2 极差分析可知，各因素对于酶活的影响依次为 A＞B＞C。最佳的摇瓶发酵产酶培养基配比为 A2B3C1，即 麦麸:豆饼粉=3:1，（NH4）2SO4 含量 3%，K2HPO40.1%。 2.2 原料粉碎度对糖化酶活力的影响（见图 1）
黑曲霉变异株：经紫外线和硫酸二乙酯复合诱变而成。 1.2 培养基
孢子培养基：察氏培养基。 产酶培养基：麸皮、豆饼粉、（NH4）2SO4、K2HPO4 等按 一定比例混合。 1.3 仪器 电子天平（ALC-2100.2 型）：北京赛多利斯仪器系统 有限公司；pH 计（PHS-3C 型）：上海雷磁仪器厂；数显式电 热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械总厂；立式蒸气压力灭 菌 器（LDTX-30FB）：上 海 申 安 医 疗 器 械 厂 ；霉 菌 培 养 箱 （MJ-25085-Ⅱ）：上海新苗医疗器械有限公司；电热鼓风干 燥器（101A-3ET）：上海实验仪器有限公司；单人单面净化 工作台（SW-CJ-1FD 型）：苏州净化仪器设备有限公司。 1.4 孢子悬浮液的制备 将保存于冷藏柜中的菌株取出，连续活化 2 次。再将 长满成熟孢子的斜面培养基用无菌生理盐水洗涤，倒入 装有玻璃珠的无菌三角瓶中，再在 200r/min 的摇床中充分 振荡 30min，用灭菌后的脱脂棉滤去菌丝片段，制得单孢 子悬浮液。用血球计数板计数，将孢子数调整为 108 个/mL。
西安大学生物工程学院2020级《生物化学》考试试卷(16)
西安大学生物工程学院2020级《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 在原核细胞和真核细胞中染色体DNA都与组蛋白形成复合体。
（）答案：错误解析：2. 质膜中与膜蛋白和膜脂共价结合的糖都朝向细胞外侧定位。
（）答案：正确解析：3. 寡聚酶一般是指由多个相同亚基组成的酶分子。
（）答案：错误解析：4. 蛋白质变性后，其空间结构由高度紧密状态变成松散状态。
（）答案：正确解析：5. 在多肽分子中只存在一种共价键即肽键。
（）答案：错误解析：在多肽分子中除肽键外，还有二硫键等其他共价键。
6. B族维生素具有相似的结构和生理功能。
（）答案：错误解析：7. 天然存在的不饱和游离脂肪酸大多具有反式结构。
（）[山东大学2017研]答案：错误解析：天然存在的不饱和游离脂肪酸大多具有顺式结构，少部分具有反式结构。
8. 酶活性中心一般由在一级结构中相邻的若干氨基酸残基组成。
（）答案：错误解析：构成酶活性中心的氨基酸残基可以由在一级结构的相邻中若干氨基酸残基组成，也可以由在一级结构中相距较远的、或位于不同肽链上才的若干氨基酸氨基酸残基组成，上向但在空间结构上为它们彼此靠近。
9. 所有的酶都含有辅基或辅酶。
（）[中山大学2018研]答案：错误解析：不是所有的酶都含有辅基或辅酶，不单纯酶只有蛋白而不含有辅因子，如脲酶、黑曲霉和一些消化酶等。
10. 维生素是维持机体正常生命活动不可缺少的一类高分子有机物。
（）答案：错误解析：2、名词解释题（25分，每题5分）1. 限制酶图谱答案：限制酶伊藤清是指同一DNA用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶的切割位点，由此建立的底物图谱，有助于对DNA的结构进行分析。
解析：空2. 基本氨基酸答案：组成酵素的常用常见氨基酸有20种，又称结成蛋白质的基本氨基酸，除R为氢原子（即甘氨酸）外都是L氨基酸。
发酵工程知识点总结
➢名词解释（每个3分）➢填空题➢单项选择题➢计算题（2题）➢简答题（4-5题）➢分析题（1-2题）➢论述或问答题(1题）第一章1发酵和发酵工程的概念发酵狭义：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物菌体或其代谢产物的过程。
广义：凡是培养细胞（动、植物和微生物细胞）来制得产品的过程。
发酵工程研究发酵工业生产过程中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学2、发酵工程研究的内容※发酵工业用生产菌种的选育：◆自然选育◆诱变育种◆基因工程育种※发酵条件的优化与控制※生物反应器的设计※发酵产物的分离、提取和精制3、发酵类型1 按发酵产品的类型划分2 按发酵工艺是否需氧划分※厌氧发酵：如酒类发酵、酒精发酵、丙酮丁醇发酵、乳酸发酵和甲烷发酵※通风发酵：如酵母菌生产、抗生素发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵和酶制剂生产等3 按发酵工艺培养基的状态划分※固态发酵：主要应用于传统酿造业。
※液态发酵：，是目前发酵工业所采用的主要工艺。
4、发酵工艺培养方法发酵工艺培养方法有：固态发酵工艺和液态发酵工艺1固态发酵工艺※固态薄层发酵※固态厚层（通风）发酵2 液态发酵工艺※液态表面发酵（浅盘发酵）工艺※液态深层通风发酵(Submerged fermentation)液态深层通风发酵是指在无菌条件下，在液体培养基内部进行微生物培养，获得产品的过程。
它包括向发酵罐中通入大量无菌空气、搅拌使空气均匀、培养基灭菌和无菌接种。
液态深层通风发酵是发酵工业使用的主要工艺。
5、分批发酵，分批补料发酵分批发酵(batch-process)：在生物反应器内投入限量培养基后，接入微生物菌种进行培养，完成一个生长周期，获得产品的微生物培养方法。
是目前传统发酵工业所采用的主要发酵形式。
在分批补料发酵：发酵的开始投入一定量的培养基，在发酵过程的适当时期，开始连续补加碳或（和）氮源或（和）其他必需基质，直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液一次放出，这种操作方式称为补料分批发酵。
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收稿日期:2008-12-25基金项目:内蒙古自治区优秀学科带头人计划项目(20050802)作者简介:安玉麟(1954-),男,内蒙古土默特右旗人,研究员,硕士生导师,主要从事作物栽培、育种研究工作。
黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western 2blot 分析安玉麟1,孙瑞芬1,张鹤龄2,郭树春1,闫素丽3(1.内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古呼和浩特 010031;2.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010021;3.内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特 010019) 摘要:为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(G OD )在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(G OD )基因定向克隆于原核表达载体pET 211a 上,构建了融合表达的重组质粒pET/G O ,转化E.coli BL21(DE3)plysS ,用IPTG 诱导,超声波粉碎细菌细胞,S DS 2PAGE 电泳检测,G OD 基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5kDa 。
用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(E LIS A )测定其效价为106,West 2ern 2blot 分析证明表达的融合蛋白与兔抗G OD 血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(G OD )抗体的制备奠定了基础。
关键词:黑曲霉3.758;葡萄糖氧化酶基因;融合表达;抗血清;E LIS A ;Western 2blot 中图分类号:T Q920.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)04-0084-04Prokaryotic Expression and Western 2blot Analysis of G lucose OxidaseG ene from Aspergillus nigerAN Y u 2lin 1,S UN Rui 2fen 1,ZHANG He 2ling 2,G UO Shu 2chun 1,Y AN Su 2li 3(1.Biotechnology Research Center ,Inner M ong olia Academy of Agriculture and Husbundary Sciences ,Huhhot 010031,China ;2.C ollege of Life Science ,Inner M ong olia University ,Huhhot 010021,China ;3.Agricultural C ollege of Inner M ong olia Agricultural University ,Huhhot 010019,China )Abstract :In order to further study expressed level and condition of G lucose oxidase (G OD )from Aspergillus niger 31758in E.coli ,the coding region of G OD from A.niger 3.758was inserted into the prokary otic expression vector pET 211a ,and the recombinant plasmid was trans formed into E.coli BL21(DE3)plysS.The result of S DS 2PAGE showed that the G OD gene was expressed by IPTG induction ,and the m olecular weight of the fusion protein was about 66.5kDa.An 2tiserum was produced in rabbit immunized with commercial G OD ,and E LIS A analysis proved that the titer of this antibody was 106.The Western 2blotting result confirmed that the antibody reacted specifically to the expressed fusion protein.The study established basis for preparation of G OD antibody from Aspergillus niger 3.758.K ey w ords :Aspergillus niger 3.758;G lucose oxidase gene ;Fusion expression ;Antiserum ;E LIS A ;Western 2blot 葡萄糖氧化酶(β2D 2glucose :oxygen 12oxidoreduc 2tase EC1.1.3.4,简称G OD ),催化β2D 葡萄糖氧化生成δ2葡萄糖酸酯和O 2,O 2被还原生成H 2O 2(β2D 2glu 2cose +O 2→glucose 2δ2lactone +H 2O 2)[1]。
G OD 的活性最早是1928年由Muller 在黑曲霉的抽提物中发现的,后来在黑曲霉[2,3]和青霉[4]中都纯化到了G OD 。
现已从几种微生物中得到了G OD ,但从黑曲霉中得到的G OD 活性最强。
目前G OD 已在临床检测、食品工业、生物传感器、有机酸生产及抗真菌病转基因研究等方面得到广泛应用[5],而且编码G OD 的基因已从不同的真菌菌株中分离、克隆。
Frederick 等[1]和Whittington 等[6]将来自黑曲霉的G OD 基因成功地重组到酵母中,获得了具有生物活性的酿酒酵母G OD 。
Witt 等[7]等在大肠杆菌中表达了青霉G OD 。
国内周亚凤等[8]也在酵母中高效表达了黑曲霉G OD 。
母敬郁等[9]利用高表达分泌纤维素酶的真菌华北农学报・2009,24(4):84287瑞氏木酶表达了重组的黑曲霉G OD。
本试验将押辉远[10]从黑曲酶中国株3.758中克隆的G OD基因连接到原核表达载体中并实现了在大肠杆菌中的表达,为进一步研究黑曲酶中国株31758G OD在大肠杆菌中的表达水平和条件及抗血清的制备奠定了基础。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒 表达载体pET211a购自德国N ovagen公司,E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞购自清华大学北京天为时代科技有限公司,克隆有G OD基因的重组质粒pMD/G O由内蒙古大学张鹤龄教授惠赠。
1.1.2 酶及主要试剂 限制性内切酶Hin dⅢ(Promega产品)、Bam H I(Fermentas产品);T4DNA Ligase、Mini plasmid DNA kit、DNA MakerⅢ(清华大学北京天为时代科技有限公司产品);E.Z.N.A(R)G el Extraction K it(美国Omega Bio2tek产品);Am p、IPTG X2gal、LA Taq DNA Ploymerase、λDNA/Hin dⅢMaker、低分子量蛋白Maker(T aK aRa公司产品);超速高灵敏度蛋白质电泳快速染液(南京博尔迪生物科技有限公司产品);BAS、T ween20(购自上海生物工程技术服务有限公司);葡萄糖氧化酶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品);山羊抗兔IgG2AP、NBT/BCIP染色kit、pNpp(华美公司),其他试剂均为进口或国内分析纯。
1.2 方法1.2.1 引物 引物1,2按文献[11],由北京华大中生科技发展有限公司合成。
1.2.2 G OD基因与表达载体的连接 用Bam H I/ Hin dⅢ双酶切重组质粒pMD/G O和表达载体pET2 11a,得到目的基因小片段和载体大片段,分别回收纯化,回收试剂盒为E.Z.N.A(R)G el Extraction K it,方法按产品使用说明进行。
用T4DNA Ligase将目的片段与载体片段连接。
1.2.3 E.coli感受态细胞的转化 用连接产物转化 E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞,转化方法按产品说明书进行。
筛选培养基中添加Am p、IPTG、X2 gal,同时分别用pET211a空载体和水作对照,在Am p 的平板上筛选阳性重组子。
1.2.4 重组子的鉴定与序列测定 将转化所得白色单菌落,用K ieser法[12]筛选重组质粒,琼脂糖凝胶电泳检测,选取落后于空质粒的单菌落,用快速PCR的方法扩增目的片段。
PCR扩增反应条件为94℃预变性5min,94℃变性30s,63℃退火30s, 72℃延伸3min,30次循环,72℃保温10min;碱裂解法小量提取质粒,用Bam H I/Hin dⅢ双酶切鉴定重组质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
随机选取一个重组质粒送到大连宝生物公司测序,鉴定所插入的序列及其读码是否正确。
1.2.5 G OD基因的诱导与表达 挑取测序正确的阳性克隆,接种于10m L含Am p100mg/L的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
用含Am p100 mg/L的LB液体培养基,以1∶50稀释进行扩大培养,培养至OD600分别为0.6和1.0时,加入诱导剂IPTG使其终浓度分别为0.5mm ol/L和1mm ol/L, 37℃诱导培养2,4,6h,同时以未诱导的重组菌pET/G O培养物及诱导4h的pET211a空载体的诱导培养物作为阴性对照。
1.2.6 细胞内总蛋白质的制备及S DS2PAGE电泳检测表达蛋白 分别取以上未诱导、诱导及只含pET211a空载体的细菌培养物进行细胞内总蛋白质的制备。
制备过程为:将1m L细菌培养物12000 r/min离心2min,弃上清,用灭菌的滤纸条吸干管壁液体。
加100μL冰预冷的50mm ol/L T ris2HCl振荡悬浮菌体,0℃,12000r/min离心1min,弃上清,用灭菌的滤纸条吸干管壁液体。
加50μL ddH2O,菌体分散后,立即加入50μL2×S DS上样缓冲液悬浮沉淀,振荡20s,沸水浴中煮5min,快速冰浴2min以上,超声波粉碎5min,12000r/min离心10min,取上清液5μL进行分离胶7.5%,浓缩胶5%的S DS2 PAGE电泳[13],电泳条件:浓缩胶18mA,分离胶25 mA,同时以黑曲霉葡萄糖氧化酶(G OD)为阳性对照(CK+)。