毕赤酵母表达知识归纳
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
酵母表达体系
酵母表达体系毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的30%以上。
AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。
利用含有α因子序列的分泌型载体即可。
翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体：pPICZ A,B,and C，一：分子克隆1.设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture(各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlddHO up to 50μl2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl）DNA(空载体或目的基因) 30μlBamHⅠ 1.5μlXholⅠ 1.5μl10×Buffer K 4.0μl4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。
毕赤酵母的基因表达及其初步纯化
1、表达效率高，遗传稳定性好 2、结构简单，表达调控机理比较清楚 3、有Pr加工系统 4、培养简单，成本低廉 5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的
分泌却很少，利于下游的纯化 （毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达
系统。）
一、实验材料
• DH5α、pPICZαA 、GS115、TOP10、， pQE4Aβ15
• 离心收集沉淀，取适量沉淀进行12% SDSPAGE 分析。
• 并用Band Scan 软件进行蛋白质纯度分析.
蛋白质的分离纯化方法
——Alade
四种分离纯化方法
• 1、根据分子大小不同进行分离纯化 • 2 、根据溶解度不同进行分离纯化 • 3 、根据电荷不同进行分离纯化 • 4 、利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
• TBST 洗涤 5 次，H来自P-DAB 底物显色试剂 盒显色.
Western Blot 原理 a
• Western Blot与Southern印迹杂交或 Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测 物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。
Western Blot操作步骤
• 1、蛋白样品制备 • 2、蛋白含量的测定 • 3、SDS－PAGE电泳 • 4、转膜 • 5、免疫反应 • 6、化学发光，显影，定影 • 7、凝胶图象分析
6、重组蛋白的鉴定与分析
6.2 质谱分析
• 从考染（考马斯亮蓝R250CBR-250,用于检 测Pr的氨基和羧基）凝胶上切下重组蛋白 带， 进行基质辅助激光解吸附电离飞行时 间质谱分析.
• 挑阳性克隆单菌落接种于BMGY(含酵母粉、 甘油、生物素……）的培养基上摇床培养
毕赤酵母表达手册(详细)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
毕赤酵母表达系统
毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。
毕赤酵母表达知识
很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
毕赤酵母高效表达策略概述
-毕赤酵母高效表达策略概述1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。
由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’-U TR。
尽可能和AOXlmRNA 5’-U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。
A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。
因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%~55% 范围内。
巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。
(赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.)外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。
外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。
2.选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。
PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。
通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体,从中筛选提高表达量的突变体。
(戴秀玉, 王恂, 周坚1毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) :559~5611)3.增加外源基因整合拷贝数(1)Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子(配合电激法转化的效果更好)。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述
毕赤酵母启动子以及诱导物
启动子 诱导表达 AOX1，AOX2(甲醇氧化酶) 以甲醇诱导表达 GAP （3 一磷酸甘油醛脱氢酶） 葡萄糖组成型 表达（甘油或甲醇诱导产量只有2/3，1/3） FLD1（甲醛脱氢酶） 以甲基化胺为氮源 (葡萄 糖为碳源)，甲醇为碳源 (硫酸铵为氮源)表达 PEX8（过氧化物酶体基质蛋白） 以葡萄糖、 甲醇诱导表达 YPT1（GTP酶） 以葡萄糖甲醇、甘露糖醇组 成型表达
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的 表达种类
具有代表性的如下列一些外源蛋白质P.pastoris中已经获得高效产 生： (1)蛋白酶类，如人溶菌酶、人胃促胰酶、葡萄糖苷酶等； （2）激素类，如胰岛素前体、人绒毛膜促性腺激素、鲤鱼生长激 素等； （3）受体、抗体及单链抗体等生物活性蛋白； (4)抗原类，如乙型肝炎表面抗原、破伤风毒素片段C、登革热病 毒E蛋白等； (5)细胞因子类，如肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血管生成抑制 因子等； （6）酶制剂类，如植酸酶等； (7)病毒蛋白类，如乙型脑炎病毒E蛋白、伪狂犬病病毒Ea株gE蛋 白等
毕赤酵母的优点
利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。 外源蛋白基因遗传高稳定性，外源蛋白质具有一定程 度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋 白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备 有功能的蛋白质。
毕赤酵母发酵工艺对产量的影响
甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶 段，即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。 酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，另 一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径，并使 细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。 蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源 和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基 因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因 的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白
2016.03.31毕赤酵母表达问答
2016.03.31毕赤酵母表达问答1.信号肽切割位点和目的基因核苷酸序列5’端的设计酶切位点问题1.1目的蛋白N端不要增加氨基酸：a-信号肽在kex2 和ste13处进行切割，若要目的蛋白不增加额外氨基酸，则需要在kex2对应核苷酸序列前的XhoI 作为酶切位点，并补齐信号肽切割所需的序列（酶切位点下游的信号肽对应的核苷酸序列）1.2目的蛋白N端可增加氨基酸。
则可以选用其他的酶切稳点，保证下游不出现移码突变就行了。
（具体参考具体酶切位点切割点，及其上游核苷酸数有否保证刚好是3的倍数）。
2.目的基因核苷酸序列3’端的设计酶切位点设计、终止密码子设计2.1如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；3.载体构建问题3.1pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选，对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的3.2pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表。
PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），3.3位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；3.4虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；3.5有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；3.6无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；3.7如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；3.8 Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；3.9克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；3.10测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物；3.11如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。
毕赤酵母表达系统简介
巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。
酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。
以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。
作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。
表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。
它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。
含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。
随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。
1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达零碎之相礼和热创作Mut+和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产品，甲醇可紧密调理、诱导AOX1基因的高程度表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上.AOX1基因调控分两步：抑制/往抑制机制加诱导机制.简单来说，在含葡萄糖的培育基中，即便加入诱导物甲醇转录仍受抑制.为此，用甲醇进行优化诱导时，引荐在甘油培育基中培育.留意即便在甘油中生长(往抑制)时，仍缺乏以使AOX1基因达到最低程度的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达程度所必须的.AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达.AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，经过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株.在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培育基中，不管是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的工夫大约为2h.Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的状况下生长速率是一样的，存在甲醇的状况下，Mut+在对数期增殖一倍的工夫大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的工夫大约为18个小时.菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或构成正确的折叠结构.GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有渐变，是组氨酸缺陷型，假如表达载体上携带有组氨酸基因，可抵偿宿主菌的组氨酸缺陷，因而可以在不含组氨酸的培育基上挑选转化子.这些受体菌自发渐变成组氨酸野生型的概率一样平常低于10-8.GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培育基上鉴定表型.SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生渐变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用.其中X-33由于是野生型，因而耐受性比较好，假如担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表示型，也就是说可以在含甲醇的培育基中快速生长，但是听说会对外源基因表达有影响，KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有渐变，在不含精氨酸的培育基中不克不及生长.用野生型ARG4基因(约2kb)拔出到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离发生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析表现野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，以是KM71全部转化子都是Muts表型.AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构经过基因取代方法更换aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味偏重组菌株生长时需精氨酸.但仅添加精氨酸其实不克不及完全缓和arg4渐变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培育基中不克不及很好地生长.因而不引荐在KM71中经过取代aox1::ARG4结构来获得His＋转化子.一样平常来说，假如是胞内表达，应尽量用Muts细胞，这样得到的蛋白产品中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量绝对较多，使卑鄙纯化更易进行.而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Muts)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可运用.基因重组Pichia.pastoris酵母菌体内无自然质粒，以是表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以完成外源基因的表达，包含启动子、外源基因克隆位点、停止序列、挑选标识表记标帜等.细菌内同源重组被以为是重组质粒构建过程的难点，由于未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，以是重组转移载体必须用特定的限定性内切酶进行线性化处理.这种处理的目的是防止随机拔出重组时质粒在功能区断开，形成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生.表达载体次要分为以下几类：(1)胞内表达载体次要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等.该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以防止毕赤酵母的糖基化，次要得当于那些不克不及被糖基化相关基因的表达；(2)分泌型表达载体次要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等.由于毕赤酵母本人的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积存.经常运用的分泌的信号序列次要是由89个氨基酸组成的α交配因子(α-factor)的引导；(3)多拷贝拔出表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K.在某些状况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可添加所需蛋白的表达量.该载体均可用于在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或体外(pAO815)发生并分离多拷贝拔出，同时可检测添加重组基因的拷贝数能否添加蛋白表达量.体内整合可经过高遗传霉素抗性挑选可能的多拷贝拔出，而体外整合可经过连接发生外源基因的串联拔出.在GS115中挑选His+Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质粒转化GS115后，大多在His4位点上发生重组，大多数转化子是Mut+表型；但是由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，毁坏野生型AOX1基因，发生His+Muts转化子，则必要在MD及MM平板上检测可证明His+ Mut+转化子.毕赤酵母表达经常运用培育基10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保管.YPD完全培育基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培育基含1.5%琼脂).转化培育基RDB：每100mL加入山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL.混匀，倒平板(灭菌时只加入80ml水即可).选择培育基MD(最小葡萄糖)：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L).选择培育基MM(最小甲醇)：配100mL，向90mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%).诱导表达培育基BMGY：配1L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL.诱导表达培育基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20 g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃当前在超净台上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL.BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可波动分泌蛋白，制止或减少分泌蛋白的分解.假如目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培育基(MGY、MM)中表达.假如没有证据证明你的分泌蛋白对中性PH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY.假如表达蛋白降解了，测验考试在无缓冲培育基中进行表达.假如以上条件仍不克不及无效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相反，也可用于大规模发酵.用考马斯亮蓝G-250测蛋白含量。
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毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
invitrogen手册上可以灭菌的。
glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。
颜色很深的话，基本不能使用了。
想请教下关于菌种保存的方法。
我现在是采用斜面保存的方法，但感觉每次接菌都要打开斜面，而且每次的接菌量难免会有不少的误差，所以很想问一下大家都是怎么保存菌种的，特别是甘油菌的保存方法。
我一般吸取300ul的菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀．防于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱一般OD是2-6，过夜菌在筛选高表达菌种中，我一般有一下步骤，很很多人做的不太一样，和说明书也有点差异，如下：每次转化前，均用多种酶切，BlgII/salI/sacI同时切，然后转化时，用GS115/KM71/KM71H 同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，这里我要重点说明的是，我直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。
我已用这儿方法做了好几个基因出来。
关于酵母表达时BMMY的PH值我也觉得PH7.0-7.5要比PH6.0好，我表达的两个蛋白都是这样，表达量要高一些。
但也不能一概而论，不同目标蛋白表达最适pH不一样，不过表达的pH值最好要远离目标蛋白的pI。
像目前国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右，也有不同的报道，可能和工艺页有关系。
而我自己正在做的一个蛋白pH4较好，3、5表达时上清电泳目标带大量减少，杂带大量增多。
求助一下很棘手的问题，大家在酵母表达过程中控制目标蛋白降解方面有什么高招，小弟最近为这个有点儿焦头烂额。
我试过用酸消解酪蛋白，可是作用并不是很明显。
不知道兄台是胞内表达还是胞外表达，如果是分泌表达，目标蛋白确实容易被降解。
你可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。
实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。
Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the P.pastoris culture medium.The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one or more problem proteases.The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that portease activity is induced under nitrogen starvation.The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.如何优化密码子来提高蛋白表达量，具体考虑哪些因素（肯定不是单纯的全部置换为使用频率高的密码子吧）看有些文献优化后的密码子有些都是使用频率不高的，实在很困惑.有没有做过这方面的，急切的想得到你的指导，收取一定的费用也可以。
谢谢了，我在上海。
密码子改造对提高表达量只有有限的作用。
影响外源蛋白在Pichia中表达水平的限速步骤（rate-limiting factors)很多。
涉及到转录，翻译，蛋白在ER和Golgi的合成和折叠，以及分泌信号肽定位和切割，蛋白修饰等很多方面（H. Hohenblum, Biotechnology and Bioenginering, 2004, 85:367-374) 。
关键是根据你要表达的蛋白性质以及DNA序列特性来推测（！）哪个步骤是关键的限速步骤。
实际上，很多分泌表达的蛋白，蛋白在ER中合成和折叠以及信号肽的切割是关键步骤。
现象是很多错误折叠的蛋白在胞内聚集和降解。
密码子作为限速步骤很多时候体现在某些蛋白由于高AT含量或者其他因素转录提前终止，这方面文献在NCBI上有一些。
毕赤酵母表达知识归纳2我用Pichia酵母分泌表达两个不同的蛋白，结果Western Blot的结果显示，两个蛋白均比理论分子量少了20k左右。
难道都是被发酵液中的蛋白酶降解了？大家碰到过这样的情况吗？如果是少了20K左右,肯定要考虑酶解的可能了.你的目的蛋白一级序列是否有Pichia酵母的Kex2酶降解位点.我现在做的蛋白就有这种情况,但是是降解产物和目的蛋白共存,有的蛋白幸免遇难用BglII、SalI、SacI酶切的区别是什么？我是想做蛋白表达，用BglII后转化行么？它们三个是不是哪个可以用了？BglII 好像能把质粒切成两段，与其它两种线性化方法比较，较易生成muts型的转化子，当然比例也是少。
SalI、SacI酶切基本只能产生mut+型的转化子，我看文献介绍，后者的转化效率比前者要高。
我用前者线性化的，感受态也是用常规方法，没有DTT LiCl什么的，板子也是长得满满的。
哪位有毕赤酵母上罐的一些无机培养基配方能提供参考！谢谢！毕赤酵母表达知识归纳3毕赤酵母基因组DNA PCR怎么也p不出来，质粒和线性化后的质粒都能P出来，但是电转化进入毕赤酵母GS115后怎么也p不出来，不知怎么了？以前做的都是小菜一碟呀，那位战友有这方面的经验啊？是不菌株有问题啊？恳求指点一下！非常感谢！电转化后涂在MD平板上的么？应该大部分都是阳性克隆，可能是你提基因组的方法有问题，以前有战友介绍过菌落PCR的方法，我刚试过，效果非常非常好。
2.2kb的片段非常清楚。
退火温度我用的56度1min，72度2min，35个循环。
挑取单菌落均匀涂抹于管底，开盖在微波炉中档加热1min，-80℃5min，再加热一次，然后加入20ul水，取1ul作为PCR模板。
他本来说离心取上清为模板，我就直接取的。
非常非常好用，一般的方法提基因组，比如煮冻煮法等，很难P出2.2kb的AOX1 基因而这个方法就能，还非常明显。
你翻一下前两页吧，我还把自己的图贴出来了。
选5‗aox和3‘aox这两个引物，这样还能判断你的转化子是mut+或muts型的。
跑出两条来说明是mut+，其中一条2.2kb的就是aox1基因。
这里不涉及aox2，建议你去invitrogen网站下一本multicopy pichia expression manual，看一遍就很清楚了。
MD平板上的阳性克隆应该比例很大的，我觉得3个就至少有一个是。
万事都没那么觉对的，在整合时，可能仅His4基因整合入了酵母基因组，所以也能生长，但无目的基因。
请教几个问题1. 鉴定重组时候，我煮冻煮方法获取酵母基因组作为模板，用目的基因的引物进行扩增，结果有些产物很强，有些很弱，为什么？2。
是否存在这样情况，线性化载体进入酵母内，没有进入核内进行重组，或者进入核内，仅仅黏附在酵母基因组上，没有发生重组呢？如果有这个情况，该如何区别？3.用烧瓶摇菌的转速对表达有什么影响，听说过高转速使酵母总处于分裂增殖，而表达低？4.大家大规模发酵的步骤是怎么样的，能提供一个方案吗？关于PCR的问题，我觉得你的模板差异大吗？我做很多次PCR鉴定，发觉模板量的差别对PCR的结果会有非常大的影响。
不过我做的PCR鉴定，基本上都是用AOX1引物P的，倒是没用过目的基因引物。
摇瓶的问题我也说不出来，因为我到目前为止都没做出分泌性表达来，汗啊……（都在胞内了）速度我都是按照Protocol上的推荐速度摇的，一般都是250rpm以上。