毕赤酵母表达步骤

毕赤酵母表达系统的构建

1•确定转入的目的基因，并设计相应引物，进行 保真酶，引物，dntp,胶回收试剂盒。）

PCR 反应，获取目的基因片段。（所需药品 -高

2.

对目的基因及载体

Ppic9k 进行酶切产生粘性接头并纯化回收。（所需药品

-Sall 、Stul 、Sacl

【用于于 GS115产生His+Mut+】；Bglll 【用于于 GS115产生His+Muts 】）

酶切体系

酶切体系

50

-L

目的 DNA

10

"L

酶切缓冲液 5

"L

限制性内切酶

1 JL

超纯水

3

4九

37 C 酶切1〜4小时。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

3. 将酶切正确的目的片度与质粒相连（所需药品

载体DNA 目的片段DNA

连接试剂盒Solution I

充分混匀，置于16 C 连接4 h 或4 C 连接过夜。

4. 转入DH5 □扩繁质粒（所需药品 -A mp ； DH5a ; CaCl2）

将DNA 目的片段和载体的连接产物与

200 L 感受态细胞混匀，冰浴

30min 。45 C 热击45-60S ，

冰浴3min 后加入800九LB 液体培养基37C 震荡培养1h 。

-连接试剂盒 Solution I ［宝生物］)

0.5 k 4.5 L

（1 ）转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul A mp的LB平板上，选择 A mp抗性克隆

（2）挑取10个A mp抗性转化子，接种含 150ug/ul A mp的培养基，37度振荡培养过夜

(3 )提取质粒进行 PCR及酶切检测并送交测序。( pPIC9k测序时，用a-factor弓|物及3'

AOX1 测序引物。将引物重悬于 20ul 灭菌水中，制成 0.1ug/ul 溶液)

4在0.85ml过夜培养菌液中加入 0.15ml灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入

标记好的储存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入 -70 度保存。

5测序证实结构正确后，可准备转化DNA

5.毕赤酵母电转化：

细胞准备：

毕赤酵母感受态制备：

(1)取1 mL GS115过夜培养物(0D6006 . 0〜10. 0)转接于100 mL YPD液体培养基中

28C -3O C、250 — 300 r/ min培养至酵母菌的对数生长期 (OD600 1 . 0〜1 . 3)

(2)取此菌1 mL分装到1. 5 mL EP管中，4C、10 000 g离心1 min，弃上清

液，沉淀用无菌水(4C预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。

( 3)加入 1 mL 处理液【 10 mM LiAc 、 10 mMDTI 、 0. 6 M sorbitol 、 10 mM TrisHC1(pH

7. 5)】，室温下放置 20 min 。离心，弃上清液。

( 4)加入 1 mL 1 M sorbitol ，离心，弃上清液，用 1 M sorbitol 洗涤二次，到最终体积约为80微升，冰浴中保存或一 70~C保存待用。

转化：

1取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA (溶于5-10ulTE )混合，转入预冷的 0.2cm电

转杯中。

2在冰上放置 5min

3根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击

4立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中

5分成200-600ul等份，涂于 MD或RDB平板上

6在30 度孵育平板至克隆产生，筛选 Mut+/Muts 表型

6.遗传霉素抗性转化子

开始前：准备 10 个 YPD 平板，每个的遗传霉素浓度为0，0.25 ，0.5，0.75，1.0，1.5，

1.75 ，

2.0 ，

3.0 及

4.0mg/ml 。

1吸取1-2ml灭菌水于所有HIS+转化子平板上

2用灭菌刮子重悬 H I S +转化子，不要划破琼脂

3将细胞悬液集中转移至灭菌的 50ml 离心管中，稍涡旋 (5-10S)

4用分光光度计测定浓度 (1OD600= 5X 107细胞/ml)

注意：混有琼脂会干扰读数

5 在每块含有遗传霉素的 YPD 平板上涂 105细胞。

(需要证实在没有遗传霉素的YPD 板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗

传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转

化子稀释到 10-5，10-6， 10-7浓度，每板加 100-200ul)

6 在 30 度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需 2-5 天出现，不含遗传霉素的 YPD 平板上克隆需 2-3天出现。接下来做结果分析。P39

注意：如果在以上方法里你将所有细胞都悬浮，加15%灭菌甘油，存于 -80度，可在以

后时间里做遗传霉素抗性筛选。

7.筛选 Mut+ 及 Muts 转化子

(1)将上一步获得的转化子用灭菌牙签挑取单克隆，在MM 及 MD 平板上以一定的方式划线或

点 HIS+ 转化子，确保先在 MM 平板上点

(2 )每个克隆换一次牙签，点 100 个转化子后再继续向下做 (约2-3 板)

(3)为分离 Mut+及Muts表型，在MD及MM平板上各点上对照 (GS115/HIS+ Muts Ablumin 及 GS115/ HIS+ Mut+ B-gal)

(4)30 度孵育 2 天

( 5 )两天后，计数平板，寻找在 MD 平板正常生长而在 MM 平板上生长很小或不长的菌株。