固定化酶
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
第六章固定化酶
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
3
进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。
固定化酶的三种方法
固定化酶的三种方法固定化酶是把酶结合到一定的表面上，使其失去活性的过程，因此可以用来改变酶的性质、增加酶的稳定性和提高酶的反应效率。
固定化酶的三种方法是物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
一、物理化学固定化物理化学固定化是一种将未固定化酶与支架分子相互作用，使酶与支架分子结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是通过多种物理、化学或生物学方法，将酶与支架分子进行结合，从而形成一个可操作的固定化酶系统。
物理化学固定化可以大大提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，并可以改变酶的特性。
常用的物理化学固定化方法有水解结合、热结合、冷结合、电结合、化学结合、离子结合和生物结合等。
二、生物化学固定化生物化学固定化是指将酶与生物聚合物结合，使酶形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是在酶表面分子和支架分子之间形成一种亲和力，使得酶和支架分子之间形成紧密的结合。
生物化学固定化的优势在于，它可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，而且不必进行大量的实验，可以节省时间和费用。
常用的生物化学固定化方法有抗体结合法、抑制剂结合法和蛋白结合法等。
三、免疫化学固定化免疫化学固定化是一种将酶与抗体结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是将酶和抗体进行结合，从而形成一个稳定的固定化酶系统。
免疫化学固定化具有较强的特异性，可以在具有极强抗性的环境中实现高效固定化；且不仅能实现酶的固定化，还可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作。
常用的免疫化学固定化方法有免疫结合法、单克隆抗体结合法和抗体体外表达法等。
综上所述，固定化酶的三种方法是：物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
它们可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，从而更好地满足人们在实验中的需求。
固定化酶
⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
第三章固定化酶
活
化 载
辅基
体
连接臂
载体的选择
没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。
目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻 璃珠及合成高分子材料等。
4、化学结合法－共价结合法
原理: 酶蛋白分子上的功能基
团（酶的非活性必需侧 链基团）和固相支持物
表面上的反应基团之间 形成共价键，因而将酶 固定在支持物上。
最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚 基、咪唑基
两种固定方式
1. 将载体有关基团 活化，然 后此活泼基团再与酶分子上 某一基团反应形成共价键。
第三章
酶的固定化
第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
交联法常与吸附法结合使用，或者与 包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合 于载体上。
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。
固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离 子强度、温度和反应时间之间的平衡。
例：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊 二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h，可形成固 定化酶。
定向固定化方法
① 酶和抗体的亲和连接 ② 酶通过糖基部分固定化 ③ 酶和金属离子连接 ④ 分子生物学方法 基因融合法
翻译后修饰法 特定位点基因突变法
第二节 辅酶的固定方法
原因
第十章 固定化酶2010
究，并第一次实现了酶的固定化。
1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化 研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 氨基酸的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这 是世界上固定化酶用于工业的开端。
1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-
1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆
2、微囊化包埋法（微囊型） 微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体中。 微囊型固定化酶通常是直径为几微米到几百微米的球 状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和 产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。 胶囊和脂质体主要用于医学治疗。 作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲 基丙烯酸甲酯等。
三、包埋法
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）（网格型） 将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液 中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合， 结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的 机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的 同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶可与二、三价金属 离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固 定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 海藻酸钠、胶原和明胶也是常用的包埋载体。
（二）固定化酶性质的改变 1.活力变化 固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专 一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因： 酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变 化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。 固定化后的空间障碍效应的影响。 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近 受阻。
（2）界面聚合法：是利用亲水性单体和疏水性单体在 界面发生聚合的原理包埋酶。 它所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包 埋过程中发生化学反应而失活。
固定化酶定义
固定化酶定义固定化酶固定化酶是指将天然酶或人工合成的酶固定在载体上，形成固定化酶催化剂的一种技术。
定义1.固定化酶：固定化酶是将酶与固体载体相结合形成的催化剂。
固定化酶具有较高的催化活性、稳定性和重复使用能力，可应用于多个领域。
2.载体：载体是指将酶固定在其上的固体材料。
常用的载体材料包括炭、纤维素、凝胶、金属氧化物等。
3.固定化技术：固定化技术是将酶与载体结合的过程，常见的固定化技术包括吸附、交联和共价结合等。
理由固定化酶相比于游离酶具有以下优势，使其在许多领域得到广泛应用：1.增强催化活性：固定化酶在催化反应中通常具有较高的催化活性，能够在相对温和的条件下实现高效催化。
2.提高稳定性：固定化酶能够耐受极端条件（如高温、酸碱环境等），具有更长的寿命和持久的催化效果。
3.可重复使用：固定化酶在催化反应后可以通过简单的分离和再生步骤进行回收和重复使用，降低了生产成本。
4.易于分离产物：固定化酶的载体通常具有良好的物理化学特性，可以实现催化产物的高效分离和纯化。
书籍简介《固定化酶：原理与应用》该书通过系统的介绍固定化酶的原理、固定化技术以及应用案例，深入探讨了固定化酶在各个领域的潜在应用价值。
内容包括：1.固定化酶的原理和分类；2.常见的固定化技术及其优缺点；3.固定化酶在生物医药、生物能源、环境保护等领域的应用；4.商业化生产中的固定化酶案例分析；5.未来固定化酶研究的发展趋势和挑战等。
本书内容深入浅出，既适合科研人员了解固定化酶的基本知识，也适合工程技术人员应用固定化酶技术解决实际问题。
无论是酶学研究新手还是经验丰富的专业人士，都能从中获得宝贵的参考和指导。
总结固定化酶是一种具有高催化活性、稳定性和重复使用能力的酶催化剂。
通过固定化技术，酶能够与载体结合从而实现其优势的应用。
固定化酶在各个领域具有广泛的应用前景，并且已经在医药、能源等领域取得了重要的成果。
《固定化酶：原理与应用》一书对固定化酶的原理、技术与应用进行了深入分析和讨论，是该领域学术研究者和工程技术人员的重要参考资料。
高三生物固定化酶知识点
高三生物固定化酶知识点生物固定化酶是一种将酶固定在载体上的技术，被广泛应用于生物工程和工业生产中。
通过固定化酶，可以提高酶的稳定性、重复使用和操作性，以达到更高的产量和效率。
本文将从固定化酶的原理、方法和应用领域等方面进行探讨。
一、固定化酶的原理固定化酶的原理是将酶通过化学交联、吸附或共价键结合等方法与载体材料结合，形成酶固定化的复合物。
这种复合物在特定条件下可以实现酶的固定化，成为一种高效的酶催化系统。
固定化酶的原理主要基于两个方面：一是通过酶与载体的物理或化学结合，增强酶的稳定性，延长其半衰期；二是通过载体的特性改变酶的反应环境，提高酶的催化效率。
二、固定化酶的方法固定化酶的方法主要分为三类：物理吸附法、化学固定法和共价固定法。
物理吸附法是将酶与载体通过静电相互吸引力、疏水效应或表面张力等物理力作用结合在一起。
这种方法简单易行，但不稳定，酶容易从载体上脱落。
化学固定法是利用肽键或二硫键等化学键的形成，使酶与载体牢固地结合在一起。
这种方法稳定性较高，但需要进行特定的化学修饰和反应条件控制。
共价固定法是通过酶分子上的特定官能团与粘接剂反应，形成共价键结合。
这种方法稳定性最高，但操作较为繁琐。
三、固定化酶的应用领域固定化酶广泛应用于医药、食品、环境工程等领域。
在医药领域，固定化酶可以用于酶替代治疗，例如胰岛素固定化酶用于糖尿病治疗。
此外，固定化酶还可以用于制备药物中间体和药物合成等过程中，提高反应效率和纯度。
在食品领域，固定化酶可以用于食品加工和酿造过程中的酶催化反应。
例如，酶固定化技术可以用于啤酒生产中的淀粉糖化、果汁酶解和乳酸酶发酵等工艺。
固定化酶可以提高生产效率和产品质量。
在环境工程领域，固定化酶可以用于废水处理、大气污染物降解和土壤修复等方面。
通过固定化酶技术，可以降低酶的使用成本和环境污染，同时提高反应效率和降解效果。
结语生物固定化酶是一项重要的生物工程技术，通过固定化酶可以提高酶的稳定性、重复使用和操作性。
食品酶学课件本第四章固定化酶
第四章 固定化酶
一、固定化酶的概念 二、固定化技术的兴起与发展 三、酶和菌体的固定化方法 四、固定化酶的特性 复习题
距您钩匪这狈唆玲斗删换禹攒家霸釉勿佰疡穴溃处汞眩咋边架些镶壁愚疗食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。示意图 酶的固定化是指通过某种方式将酶和水不溶性载体相结合，使酶被集中和限制，从而在使用时不再扩散。固定化酶具有稳定性增加、可反复使用并易于和产物分开等优点，克服了游离酶的不足之处。 固定化所用的酶可以是经提取分离后得到的一定纯度的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。相应地，前者称为固定化酶，后者称为固定化菌体或固定化死细胞。可见，固定化菌体是固定化酶的一种形式，它不像固定化活细胞（或称固定化增殖细胞）那样，固定化菌体的细胞为死细胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。
碉标磋冗效螺蔡鸣草菏污胳犹躁拎帽脊面奠验惟掣祸七咯颤殊谎榷愚杨弓食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
三、酶和菌体的固定化方法
（一）吸附法 （二）包埋法 （三）结合法 （四）交联法 （五）热处理法 各固定方法的特点与比较 酶固定化方法示意图
苹届租懈邢蔬披凝愿懒纫馁蛀歹圆狰寅恕畦塑弘侗败综迢唾栗磨湘眩撒桔食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
（一）固定化酶的形状
固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数。 颗粒和线条主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应； 薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学； 酶管机械强度怯株躺昌休工授格蹈弄君嗓洲赠滤拘齐粥哩琅骚婴葵烯羹业食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
固定化酶的优点及应用实例
固定化酶的优点及应用实例固定化酶是指通过物理或化学的手段将酶固定在固体支持材料上，并保持其活性的一种酶工程技术。
相比于游离酶，固定化酶具有许多优点，主要包括增强酶的稳定性、可重复使用、容易分离和纯化、提高酶的催化活性等。
首先，固定化酶可以增强酶的稳定性。
固定化酶能够降低酶分子的运动速度，减少酶与环境中有害物质之间的接触，从而提高酶分子对温度、pH值、有机溶剂等外界环境变化的耐受能力，增强了酶的稳定性。
此外，固定化酶能够降低酶分子的脱活速率，延长酶的使用寿命。
其次，固定化酶具有可重复使用的优势。
在固定化酶的底物转化过程中，底物可以通过固定载体穿透到固定酶的反应位点，并在该位点上发生反应。
这样，在反应结束后，固定载体上的酶仍然附着在固定载体上，可以被很容易地分离和回收。
由于固定酶是可重复使用的，可以降低生产成本，并实现高效率的生产。
对于一些昂贵的酶，这种节约是非常重要的。
此外，固定化酶比游离酶更容易分离和纯化。
由于固定酶附着在固体支持材料上，可以直接通过过滤、离心等简单方法将酶与底物分离。
相比之下，游离酶的分离和纯化需要复杂的步骤，如沉淀、色谱等。
最后，固定化酶还可以提高酶的催化活性。
固定酶附着在固体支持材料上后，可以形成固定化酶系统。
该系统中，固定酶可在相对较高的浓度下存在，并且在固定载体中有更多的酶底物分子与酶分子接触，从而提高反应速率，提高酶的催化活性。
固定化酶在许多领域中有广泛的应用，以下为几个实例：第一个应用实例是固定化酶在食品工业中的应用。
例如，固定化葡萄糖氧化酶用于葡萄糖测定，固定化氨基酸酶用于酿造中的氨基酸测定。
固定化酶在生产中具有可重复使用、稳定性和应用便利等优点，可以实现高效和规模化的生产。
第二个应用实例是固定化酶在生物制药中的应用。
例如，固定化饲料酶用于动物饲料中的消化酶替代，固定化抗体酶用于生物制药中的抗体药物生产。
固定化酶不仅可以提高药品的生产效率，还可以降低生产成本，提高产量和质量。
第四章 固定化酶
第四章固定化酶固定化酶的是指是具有催化活性蛋白质的固定化，因此固定化酶一般为具有各种性状的颗粒，其反应过程必须在颗粒水平上进行描述和表达。
它的显著特征是：在描述其反应过程动力学时，必须包含有反应物系从液相主体扩散到颗粒内、外表面的传递速率的影响。
第一节固定化酶概论酶的催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点，但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不能重复使用。
为了克服这些问题，20世纪60年代酶固定化技术应运而生。
它是模拟体内酶的作用方式（体内酶多与膜类物质相结合并进行特有的催化反应），通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交叉学科技术。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971年酶工程会议上被推荐使用的。
Trevan在1980年给出了固定化酶的定义：酶的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后使其不溶于含有底物的相中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应。
其实，固定化酶并不是新的物质，例如，胞内酶是在细胞内起作用的，类似于用包埋方法制成的固定化酶。
因此，固定化酶研究一定程度上可以认为是为了使酶在更接近其原始状态下进行的反应。
对各种酶的固定化技术进行积极的研究与开发始于20世纪50年代，通过重氮化共价结合法将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶等固定在聚氨基苯乙烯树脂上；1963年，利用聚丙烯酰胺包埋法固定了多种酶；1969年，日本的一家制药公司首次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。
通常的生物催化剂，如酶或细胞同其它溶质一样，分散在溶剂或溶液中，可以自由移动，称为游离酶或游离细胞。
若通过固定化技术将酶固定于载体表面或其内部，则与液相主体相分离，形成了固定化生物催化剂，即固定化酶。
固定化酶名词解释
固定化酶名词解释
固定化酶是指将酶固定在载体上的一种酶制剂。
固定化酶制剂是将游离的酶通过各种方法与载体连接，形成固定化酶。
固定化酶制剂具有很高的稳定性、重复使用性和较长的使用寿命，因此在许多应用领域中得到了广泛应用。
固定化酶的优点主要体现在以下几个方面：
1. 高稳定性：固定化酶可以抵抗环境中的温度、pH值和有机
溶剂的变化，使酶在较宽的操作条件下保持其活性。
2. 重复使用性：固定化酶可以多次使用，相比于游离酶制剂能够节省酶的用量，降低生产成本。
3. 酶的保护作用：固定化酶可以保护酶不受外部环境的影响，增加其使用寿命，从而减少酶损失。
4. 工艺上的简化：固定化酶可以经过固定化处理后，与反应物质相较而言更易分离，从而简化了工艺流程。
固定化酶的制备方法主要有物理固定法、化学固定法和生物固定法等。
物理固定法：通过物理性质的改变来固定酶，比如吸附、沉淀、过滤等。
化学固定法：通过酶与载体之间的化学反应来固定酶，比如酯
化反应、亲和吸附等。
生物固定法：通过生物学现象进行固定化，比如酶与载体之间的特异相互作用或化学修饰等。
目前，固定化酶已经广泛应用于食品加工、医药制造、环境保护等领域。
例如，在食品加工中，固定化酶可以用于发酵过程中的催化反应，提高产品纯度和产品质量；在医药制造中，固定化酶可以用于药物合成的控制单元，提高合成效率和减少副反应；在环境保护中，固定化酶可以用于废水处理和废物降解等。
总之，固定化酶是一种将酶固定在载体上的酶制剂，具有高稳定性、重复使用性和简化工艺的特点。
固定化酶在各个领域中的应用有着广阔的前景。
第五章固定化酶
一、固定化细胞的概念和目的
概念
细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约 束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留 其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力
目的
生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶 的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续 发酵等优点
➢ 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成 固定化细胞
6、相 对 活 力 ＝ 加 入 酶 的 总 活 固 力 定 - 化 上 酶 清 总 液 活 中 力 未 结 合 酶 活 力 1 0 0 ％
第二节结束 优点 固定化酶的优缺点
性固 质定 及化 其酶 评的 价特 指点 标、
缺点
固定化酶的性质变化
酶活力的变化 酶稳定性的变化 最适温度的变化 最适pH的变化 米氏常数(Km)的变化
4、最适pH的变化
➢ 最适pH、酶活力－pH曲线发生偏移
➢ 带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高， 向碱性偏移
- --
-
--
-
---
--------------------------------
+ H+ +
+++ +
H+
H+
+
+
+
+ H+
+
-
OH-
-
-
OH-
-
OH- -
-OH-
-
-
-
-
5、米氏常数(Km)的变化
（2） 考察固定化酶稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件
第三节提要
固定化酶的制备原则
尽可能地保持自然酶的催化活性 载体与酶结合牢固 空间位阻较小 成本尽可能低
文档：固定化酶的优缺点及应用
固定化酶的优缺点及应用1.固定化酶的优缺点固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：①极易将固定化酶与底物、产物分开；②可以再较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；④酶反应过程能够加以严格控制⑤产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；⑥较游离酶更适合于多酶反应；⑦可以增加产物的收率；⑧酶的使用效率提高，成本降低。
与此同时，固定化酶也存在一些缺点：①固定化时，酶活力有损失；②增加了生产的成本，工厂初始投资大；③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；④与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；⑤胞内酶必须经过酶的分离程序。
迄今为止已发现的酶有效千种之多，但由于应用的性质与范围、保存稳定性和操作稳定性、成本的不同以及制备的物理、化学手段、材料等不同，可以采用不同的方法进行酶的固定化。
一般要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的固定化方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原则：①必须注意维持酶的催化活性及专一性，保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点。
②固定化反应有利于生产自动化、连续化，为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。
③固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍与底物的接近，应不会引起酶的失活，以提高产品的产量。
制备固定化酶时所选载体应尽可能地不阻碍酶和底物的接近。
④酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用，因此，在制备固定化酶时，应使酶和载体尽可能的结合牢固。
⑤固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。
⑥固定化酶应易于产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用。
⑦固定化酶成本要低，需综合考虑固定化酶在总成本中的比例，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用。
酶的固定化
3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
●
外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
●
内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
● ● ●
固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
●
助因子的反应；
●
三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
●
●
●
1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应
第九章固定化酶
（游离α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg胍基，-COOH, Asp—γ--羧基Glu--羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团是不能直
接反应，功能基团要活化，
第九章 固定化酶
1)重氮化
芳香氨基载体
方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物， 在温和条件和酶分子上相应基团直接偶联。
现有多孔物质包络法，超过滤法 等。实际上用包埋法最多
第九章 固定化酶
各种固定化方法的优、缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失 高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
第九章 固定化酶
2)微囊型包埋 常用微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、
醋酸纤维素等。
用半透膜将酶包埋在里面， 半透膜容许底物和产物自由出入膜囊，
囊的表面积相对体积的比值大， 底物和产物的交换进行迅速。
第九章 固定化酶
例子：尼龙膜界面聚合包埋
(酶+己二胺水溶液)+庚二酰氯有机溶剂(氯仿)
混合
乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入分子 中Tyr等集中的疏水区偶联而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向 性越大。
b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区 的特性就大大减小了。
简述固定化酶的优点和不足
固定化酶的优点：
1.稳定性增强：固定化酶可以降低酶的降解，提高酶的稳定性，使
酶能够更长时间地保持活性。
2.反复使用：固定化酶可以在反应后分离出来，进行重复使用，从
而降低了生产成本。
3.方便操作：固定化酶可以方便地进行分离和纯化，减少了后续处
理的复杂性。
4.可控性高：通过控制固定化酶的条件，可以更好地控制反应条件，
提高反应的效率和产物的纯度。
5.适用范围广：固定化酶可以适用于不同类型的酶和不同的反应系
统，扩大了酶的应用范围。
固定化酶的不足之处：
6.酶活性的损失：在固定化过程中，酶的活性可能会受到一定的损
失。
7.物质传递限制：由于固定化载体和酶之间的传递阻力，可能会影
响反应速率。
8.载体材料的稳定性：一些载体材料在反应条件下可能会发生分解
或破坏，影响酶的稳定性和固定化效果。
9.成本较高：与游离酶相比，固定化酶的生产成本通常较高。
固定化酶的评价指标
固定化酶的评价指标固定化酶是一种将酶固定在载体上，以提高其稳定性和重复使用性的技术。
评价固定化酶的指标有很多，下面我将分别介绍几个常见的评价指标。
1. 固定效率：固定效率是评价固定化酶的一个重要指标。
它反映了酶在固定化过程中的损失情况，即固定化酶的活性与未固定酶的活性之比。
固定效率越高，说明固定化酶的损失越小，固定化效果越好。
2. 活性保留率：活性保留率是评价固定化酶的另一个重要指标。
它反映了固定化酶在固定化后仍能保持的活性水平。
活性保留率越高，说明固定化酶的活性损失越小，固定化酶的稳定性越好。
3. 反应速率：反应速率是评价固定化酶的指标之一。
它反映了固定化酶在催化反应中的催化效率。
反应速率越高，说明固定化酶的催化效率越高，固定化酶的催化活性越强。
4. 抗脱落性：抗脱落性是评价固定化酶的另一个重要指标。
它反映了固定化酶在使用过程中的稳定性和耐久性。
抗脱落性越好，说明固定化酶在使用过程中不易脱落，固定化酶的重复使用性越好。
5. 热稳定性：热稳定性是评价固定化酶的指标之一。
它反映了固定化酶在高温条件下的稳定性。
热稳定性越好，说明固定化酶在高温条件下仍能保持较高的活性，固定化酶的稳定性越好。
6. pH稳定性：pH稳定性是评价固定化酶的另一个重要指标。
它反映了固定化酶在不同pH条件下的稳定性。
pH稳定性越好，说明固定化酶在不同pH条件下仍能保持较高的活性，固定化酶的适应性越广。
7. 反应循环次数：反应循环次数是评价固定化酶的指标之一。
它反映了固定化酶的重复使用性。
反应循环次数越多，说明固定化酶的稳定性和耐久性越好，固定化酶的经济性越高。
8. 成本效益：成本效益是评价固定化酶的另一个重要指标。
它反映了固定化酶与未固定酶相比，在经济上的优势。
成本效益越高，说明固定化酶相比未固定酶具有更低的成本和更高的效益，固定化酶的应用前景越广阔。
固定化酶的评价指标包括固定效率、活性保留率、反应速率、抗脱落性、热稳定性、pH稳定性、反应循环次数和成本效益等。
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低
不可能 高 可变 较广
高
可能 低 不变 广泛
中等
不可能 中等 可变 较广
高
不可能 低 不变 小分子底物、 药用酶
2． 选择方法依据：
（1） 酶的性质
（2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
3． 固定化后酶的考察项目：
（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化 过 程的活力回收率。
（2） 考察固定化酶稳定性 （ 2） 考察固定化酶最适反应条件
定其中产物的生成量或底物的消耗量
四 固定化酶的活力测定方法介绍
3. 连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶 反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活 力。
固定化酶的制备方法
——酶的固 定化方法很 多，但对任 何酶都适用 的方法是没 有的。
28
固定化酶的制备原则
制备固定化酶要根据不同情况（不同酶、
二． 酶的固定化方法
（一） 吸附法
（二）结合法
（三）交联法
（四） 包埋法（entrapping method）
酶和细胞固定化示意图
（一） 吸附法
1． 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体
吸附在其表面上。
（一） 吸附法
常用载体： 无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化 物、硅胶。一般吸附量<1mg蛋白/克吸附剂 有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/ 克吸附剂 研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷
5
固定化酶的定义
所谓固定化酶，是指在一定空间内呈
闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，
反应后的酶可以回收重复使用。
6
“水不溶酶”（water insoluble enzyme） “固相酶”（solid phase enzyme）
7
固定化酶正式定名
在1971年第一届国际酶工程会议上，正 式建议采用“固定化酶”（immobilized enzyme）的名称。
一． 影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3.
固定化方法的影响
二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降
DEAE：二乙氨乙基(Dicthylaminoethyl ） TEAE：三乙氨乙基 (Tricthylaminoethyl ）
离子结合法的优点
——操作简单，
——处理条件温和，
——酶的高级结构和活性中心的氨基酸
残基不易被破坏， ——能得到酶活回收率较高的固定化酶。
50
缺 点
——载体和酶的结合力比较弱，容易受 缓冲液种类或pH的影响，在离子强 度高的条件下进行反应时，酶往往
活力单位。
或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示 （酶膜、酶管、酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
三． 评价固定化酶的指标：
3.
4.
或称偶联效率，活力保留百分数。
5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始 1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。 20世纪从60年代起，固定化酶的研究迅速发展 1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应 用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸， 实现了酶应用史上的一大变革。
b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
3． pH的变化
PH对酶活性的影响：
（1） 改变酶的空间构象
（2）影响酶的催化基团的解离
（3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后 不能生成产物。
固定化酶pH的变化
1） 载体带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向 碱性方向移动）。 2）载体带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向 酸性方向移动）。 3）载体不带电荷，最适Ph一般不改变（有时也会有所 改变，但不是由于载体的带电性质所引起的。） 载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化 Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10 以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高 ℃ 5—15 同一种酶，用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其 最适温度也有可能提高。 ℃ Eg：氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法 固定化后，其最适温度（72）比游离酶的最适温度（60） 提高12度；用DEAE-纤维素固定化的，其最适温度（67） 比游离酶提高7度；而用烷基化法固定化的氨基酰化酶， 其最适温度却比游离酶有所降低。 固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
三． 评价固定化酶的指标：
1． 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个 微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 ——计量单位 2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA) 所具有的酶活力单位 ——品质的体现
三． 评价固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶
8
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点:
（l）极易将固定化酶与底物、产物分开； （2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应； （3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； （4）酶反应过程能够加以严格控制； （5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； （6）较游离酶更适合于多酶反应； （7）可以增加产物的收率，提高产物的质量； （8）酶的使用效率提高，成本降低。
3．固定化酶pH的变化
（2）产物性质对pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值比游离 酶的pH值高；
催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH值比游离 酶的pH值低； 催化反应的产物为中性时，固定化酶的最适pH值一般不 变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应 产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当 反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积 累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物 为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
Enzyme Engineering 酶工程
第三章 固定化酶
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 的应用
概述 固定化酶的性质及其影响因素 固定化酶的制备 固定化细胞 固定化辅酶和原生质体 酶反应器和固定化酶（细胞）
酶催化的缺陷
（1）酶的稳定性较差
（2）酶的一次性使用
吸附法（包括电吸附法） 结合法（无机多孔材料）
交联法（双功能试剂）
包埋法（微胶囊法）
各类固定化方法的特点比较:
比较项目 吸附法
物理吸附
结合法
.共价键结合 离子键结合
交联法
包埋法
制备难易
固定化程度
易
弱
难
强
易
中等
较难
强
较难
强
活力回收率
载体再生 费用 底物专一性 适用性
较高
可能 低 不变 酶源多
9
缺 点：
（l）固定化时，酶活力有损失；
（2）增加了生产的成本，工厂初始投资大；
（3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子 底物，对大分子不适宜； （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应； （5）胞内酶必须经过酶的分离程序。
10
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
一． 影响固定化酶性质的因素
二． 固定化后酶性质的变化 载体的影响
固定化对酶活性的影响 固定化对酶稳定性的影响 最适pH的变化 最适温度变化 底物特异性与游离酶不同 评价指标 活力测定方法
评价固定化酶的指标
第三节 固定化酶的制备
一． 一般方法及特点
二． 酶的固定化方法
一． 一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性 研究、改进。 1． 四大类方法：
会从载体上脱落。
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迄今已有许多酶用离子结合法固定化， 例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基 酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡 聚糖凝胶固定化的。
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DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH 和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液( 水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1· h)充分混合(1g 湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸 去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗 涤固定化酶，置4℃备用。