乳酸菌降胆固醇体外筛选的培养基研究_王晓君

2010No．4Serial No．217China Brewing血清胆固醇水平的提高是引发冠心病的主要危险因素之一。

益生菌作为来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的微生物活体，其保健功能越来越受到人们的重视。

许多体外或体内实验研究表明，益生菌有一定的降胆固醇作用[1-5]。

同时体外研究也表明，某些乳酸菌可以降低培养基中的胆固醇[6-9]。

GILLILAND S E 等[10-11]报道了嗜酸乳杆菌从实验培养基中吸收胆固醇的现象，条件为厌氧且存在胆酸盐的环境，吸收能力有菌株特异性。

GILLILAND S E 等的实验结果与王俊国等[12]的实验结果一致，表明只有能降低培养基中胆固醇的菌株才能对猪的胆固醇水平有显著作用，因此能否降低培养基中胆固醇的体外研究成为筛选降血脂益生菌的初筛条件。

本研究探讨了乳酸菌在3种不同胆固醇源培养基中的生长状况以及降解胆固醇情况，旨在为乳酸菌降胆固醇体外筛选培养基的选择提供参考。

1材料与方法1.1材料1.1.1菌种植物乳杆菌（L.plantarum ）XZ45304、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus ）NCFM4356、肠球菌（E.faecalis ）wz47-1-1、干酪乳杆菌（L.casei ）AG8-3、瑞士乳杆菌（L.helveticu ）mgh2-3-2由内蒙古农业大学乳品中心实验室提供；瑞士乳杆菌（L.helveticu ）T2从德琪饮乐多活性乳酸菌饮料中分离并保存；嗜热链球菌（S.thermophilus ）SD 从市售得益酸乳中分离并保存；嗜热链球菌（S.thermophilus ）9从市售蒙牛酸乳中分离并保存；保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus ）LB 、干酪乳杆菌（L.casei ）C ：本实验室保存。

1.1.2培养基高胆固醇MRS-broth 培养基I ：MRS-broth 培养基中加入超声乳化的鸡蛋黄（按1%加入）；高胆固醇MRS-broth 培养基II [13]：采用RAZIN 等[14]研究的方法，把配制好的胆固醇胶束溶液快速加入到MRS-broth 培养基中（0.1mg/mL ），边加入边搅拌；高胆固醇MRS-broth 培养基III ：先用无水乙醇配制浓度为10mg/mL 的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到MRS-broth 培养基中使胆固醇最终浓度为100μg/mL 。

1.1.3主要试剂冰乙酸，正己烷，95%vol 乙醇，浓硫酸，50%KOH 溶液均为分析纯；胆固醇（生化试剂，上海三杰生物技术有限公司）；邻苯二甲醛（化学纯，上海同纳环保科技有限公司）；牛胆盐（化学纯，中国惠兴生化试剂有限公司）。

1.2方法1.2.1发酵液的制备供试菌试验前在无菌MRS-broth 中连传3代，调整菌液OD 620值（在波长620nm 处测得菌液的吸光度值）为同一水平，按1%的接种量转接到高胆固醇MRS-broth 培养基I 、II 、III 中，37℃培养24h 。

同时未接菌的含胆固醇MRS-broth 培养基，在5℃保存备用。

1.2.2胆固醇降低率测定乳酸菌降胆固醇体外筛选的培养基研究王晓君1，潘道东2，张佳程1*（1.青岛农业大学食品学院，山东青岛266109；2.南京师范大学食品科学与工程学院，江苏南京210097）摘要：许多体外或体内实验研究表明,益生菌有一定的降胆固醇作用。

探讨了10株不同的益生菌在3种不同胆固醇源的高胆固醇MRS-broth 培养基中的降胆固醇效果以及生长状况，结果发现，这些益生菌在3种高胆固醇培养基中，37℃培养24h 后,均表现出降胆固醇活性，其中胆固醇胶束溶液配制的高胆固醇MRS-broth 具有较好的筛选效果。

关键词：益生菌；培养基；降胆固醇中图分类号：Q93-335文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）04-0026-03Medium for screening cholesterol-lowering lactic acid bacteria by in vitro modelWANG Xiaojun 1,PAN Daodong 2,ZHANG Jiacheng 1*(1.College of Food Science,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China ；2.College of Food Science and Technology,Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China)Abstract:In vitro and in vivo studies showed that probiotics can lower cholesterol levels.Growth and effects of cholesterol-lowering of ten probiotics strains in three kinds of high cholesterol MRS-broth medium made by different sources of cholesterol were evaluated and analyzed.The results indi-cated that all strains showed cholesterol-lowering capacity after incubation for 24h at 37℃in medium with high concentration of cholesterol.And the MRS-broth with cholesterol micellar solution was the best.Key words:probiotics;medium;cholesterol-lowering收稿日期：2010-01-26基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2007AA10Z357）作者简介：王晓君（1983-），女，硕士研究生，研究方向为乳品科学与技术；张佳程*，通讯作者。

Research Report26··中国酿造2010年第4期总第217期发酵液在5000r/min离心10min，取1mL上清液，采用邻苯二甲醛显色法（OPA法）[15]测定胆固醇的含量；同时配制0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL浓度的胆固醇正己烷溶液。

用同样的方法测定，绘制标准曲线。

胆固醇降低率（%）=（OD标准-OD样品）/OD标准×100%式中：OD标准为未接种乳酸菌的胆固醇-MRS培养基在波长554nm处的吸收值；OD样品为接种乳酸菌的胆固醇-MRS发酵液在波长554nm处的吸收值。

1.2.3发酵液pH值的测定用PHS-3C精密pH计进行测定。

1.2.4在培养基中生长情况的测定通过测定4株菌在3种高胆固醇MRS-broth培养基中的OD620值变化，比较其生长状况。

2结果与分析2.1胆固醇浓度标准曲线由图1可以看出，采用OPA法，1mL样品测定体系的曲线拟合后相关性很好（R2＝0.9947），可用于待测菌株的体外降胆固醇能力评价。

2.2配制培养基的胆固醇含量按上述方法配制的3种培养基的胆固醇含量分别为0.055mg/L（培养基I）、0.05mg/L（培养基II）、0.061mg/L （培养基III）。

在实际配制过程中，蛋黄的乳化非常重要，乳化不充分，配制的胆固醇溶液浓度不均匀，影响测定结果。

配制胆固醇胶束溶液时，虽然是按0.1mg/L的含量进行配制，但是由于配制乳化液的器壁上有残留，为了避免杂菌污染，不冲洗器壁，所以配制的浓度偏低；按一定量加入胆固醇乙醇溶液，因为胆固醇会以微小颗粒的形式析出一部分，放置一段时间会发生沉淀现象，所以得到的胆固醇含量也偏低。

2.3乳酸菌在3种高胆固醇培养基中发酵pH值的变化由图2可以看出，在培养基初始pH值相同的情况下，培养基II的pH值变化范围小。

由于乳酸菌发挥益生效果的部位是肠道，肠道pH值接近中性，所以体外筛选时，在保证乳酸菌正常生长的前提下，所选培养基pH值变化越小越理想。

2.4在3种培养基中乳酸菌的生物量变化由图3可以看出，4株乳酸菌在蛋黄-MRS培养基上生长状况稍好，但是在3种培养基上的生长状况差别并不明显，这说明培养基II配制过程中pH值的调整对菌种生长产生的影响很小，培养基III中的乙醇对乳酸菌生长的影响也不明显。

2.5在3种培养基中乳酸菌的胆固醇降低率由图4可以看出，同一株菌在不同培养基中的胆固醇研究报告27··2010No．4Serial No．217China Brewing降低率不同，不同的乳酸菌在3种培养基中的胆固醇降低趋势也不一致。

在培养基的实际配制过程中，培养基II 和培养基III 中的胆固醇是以游离态的形式存在的，但是培养基III 中的胆固醇并不能均匀分散到培养基中，这势必会影响筛选结果。

而在蛋黄中结合态的胆固醇为主要存在形式，不同的胆固醇存在形式也可能会影响筛选结果。

总体试验结果可以看出，试验菌株在培养基II 中的胆固醇降解率较高。

3讨论高胆固醇培养基的选择会影响降胆固醇乳酸菌的筛选效果。

把鸡蛋黄和胆固醇乙醇溶液加入MRS 液体培养基中，虽然配制方法简单，但是前者也要经过充分乳化才能得到胆固醇分布均匀的溶液，从筛选结果看出，蛋黄中胆固醇的存在形式会影响试验结果；后者配制的高胆固醇培养基胆固醇分布不均匀，少量胆固醇会析出甚至沉淀，这样会造成筛选结果变化幅度较大。

相比较而言，先配制胆固醇胶束溶液然后再加入MRS 培养基中得到的高胆固醇培养基具有较好的筛选效果。

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