传统乳制品中降胆固醇作用乳酸菌的分离研究

１材 料 方 法
表 １ＰＲ ｅ 反应 体系
１ １材 料 ． 试剂 初始浓度 终浓度 用 量 （ ） ｕ１ １ １ １ 品 采集 本 研 究 的乳 制 品样 品均 采集 于 内蒙古 海 拉尔 地 区 ．．样 Ｂ ｆ ｅ ｕｆｒ １ ０× １ × ４ 的牧 民家庭 中 。将 采集 到 的 传统 乳 制 品保 存 与 灭菌 管 中 ，低 温 运 ｄＴ ＮＰ ｌｍ ＯＭ ０３Ｍ ．ｍ １２ ． 回实验 室 ，置 ４ ℃冰箱 备用 。 ＦＰｉｅ ｒｍｒ ｌ ｌｌ Ｏａ ｂ ０３ ．州 ｌ２ ＿ １ １ ２ 仪 器 Ｏ ｙ ｐ ｓ 学显 微 镜 ，超 净 工 作 台 、厌 氧 培 养箱 、 ．． ｌｍｕ 光 ＲＰｉｅ ｒｎｒ ｌ ＯＭ ０３ ．州 １２ ． Ｅ ｐ ｎｏ ｆ 自动高 压灭 菌锅 、梅 特 勒 电子 天平 、吉 尔森 移 液器 、 ｐｅ ｄ ｒ全 Ｔｑ ａ 酶 ５／ Ｕ 儿 ０７ ／ ． Ｕ 虬 ｌ Ｅ ｐｎ ｏ ｆ ｐ ｅ ｄｒ 冷冻 离 心机 、Ｇｎ Ｑａ ｔＯ 紫 外分 光光 度计 、 ｅ ｅｕ ｎ ｌ０ ＤＡ Ｎ 模板 ５ｎ ／ ０ ｇ 虬 ３５ｎ／Ｌ ． ｇＩ Ｘ １ １１３ 主要 试 剂及 配制 方法 胆 固醇 、溶菌 酶 、蛋 白酶Ｋ ａ 酶 、 ．． 、Ｔｑ 三蒸水 ３． ０４ ｄ Ｔ ； １Ｓ ｒ Ｎ ￣物 合 成 于英 潍 捷 基 贸 易有 限公 司 ；Ｍ Ｓ ＮＰ ６ ＲＡ ｌ Ｒ 培养 基 合 计 ４ ０ 参照 《 常见 细 菌系 统 鉴 定手 册 》 中所 提 供 的方 法进 行 配制 。Ｍ Ｓ Ｒ— 表 ２菌 株Ｌ 的生 理生化 实验 结 果 ２ Ｃ Ｏ 高 胆 固醇 培 养 基 的配 制 方 法 ：准 确 称 取 １ Ｏ 胆 固醇 ，溶 于 ＨＬ ．ｇ ｌＯ Ｌ 水 乙醇 中 ，此 时，溶 液浓 度为 １． ｇＬ 向ｌＯＬ Ｍ Ｓ 体 Ｏｍ 无 ０ Ｏ／ 。 Ｏｍ Ｒ液 实验项 目 结果 实验项 目 结果 培 养加 入 ｌＬ １． ｇＬ ｍ ０Ｏ ／ 的胆 固醇 溶液 ，胆 固醇 在培 养基 中的最 终浓 革兰 氏染色 ＋ 甘露糖 度 约为 ｌＯ ｇＬ Ｏｍ ／ 。 过氧化氢酶实验 山梨糖 １ ２ 方法 ． 明胶液化 实验 乳糖 ＋ １２ １ 中 国传 统 乳制 品 中乳酸 茵的 初 筛 将采集 的传统 乳制 品样 品 ．． 吲哚 实验 麦芽糖 于Ｍ Ｓ Ｒ 固体 培养 基平 板 上 划 线 ，置厌 氧 培 养箱 中， ３ ℃培 养４ ｈ ７ ８。 ＨＳ ２ 实验 蜜二糖 挑选 出 不 同形态 的 菌落 重复 划线 ， 于３ ℃厌 氧培 养箱 中培养 ２ｈ ７ ４， 硝 酸盐还原实验 蔗糖 ＋ 重 复几 次 ，直 至 分 离得 到 纯 化 的乳 酸 菌 。将 纯化 的乳 酸菌 菌 株 穿 ｐ ４５ ｔ ． 实验 ｔ ＋ 纤维二糖 ＋ 刺接 种 在Ｍ Ｓ 固体 培 养 基 中 ，３ ￣厌 氧 环境 下 培养 ２ ｈ Ｒ半 ７Ｃ ４ ，保 存 于 柠檬酸盐利用试验 棉籽糖
摘要 ：文章 从 中 国传 统 乳 制 品 中 分 ｇ￣ ，株 乳 酸 茵 纯 茵株 。通 过 邻 苯二 甲醛 法 测 定 了每 株 茵株 对培 养基 中胆 固醇 的降 解 能 力 ， Ｊ ５ 其 降解 率 分别 为１ ．％ Ｏ ２ 、 １． ％ ６ ９ 、２ ． ％ 并通 过 对 降解 率 最 高 的 菌株Ｌ 进行 了形 态观 察、 生理 生化 实验 、 鉴定 ｇ １Ｓ ８ ４ 、５ ． ％ ５ ４ 、２ ．％ ４ １ 。 ２ ￣ ６ ｒ Ｎ 序 列 分 析 等研 究， 鉴 定其 为干 酪 乳杆 菌 。 ＲＡ 关键 词 ： 中 国传 统乳制 品 ； 降胆 固醇作 用；乳 酸 茵 中图分 类号 ：￥ ７ ５１ 文 献标 识码 ：Ａ 文 章编 号 ：１７ —４ ２ （０ １ ０ —０ ７２ ６ ４０ ３ ２ １ ）一 ６０ ９—
木糖 阿拉伯糖
苦杏仁苷 半乳糖 果糖 ＋
甘露醇 山梨醇
七叶苷 水扬苷
＋ ＋
＋ ＋
存 。Ｐ Ｒ 物经 １ 的琼脂 糖凝 胶 电泳 检测 ， 并委 托天 一辉 远 生物科 Ｃ产 ％ 技有 限公 司测 序 。测 得序 列 在Ｎ Ｂ 上 进 行Ｂ Ａ Ｔ ＣＩ ＬＳ ，与Ｇ ｎ ａ ｋ 的 ｅＢｎ中 乳酸 菌标 准株 的 １ＳｒＮ 序 列进 行 同源性 比对 。 ６ Ｒ Ａ
，
－
（ ）使 用 秸 秆还 田均 较 不使 用 的增 产 显著 １
，
一
般 增 产
４ １％ 并 能培 肥地 力 ，值得 大 面 积推 广 。 ０， （ ）使 用 ５ 腐 熟 剂 处 理秸 秆 后 ２ 种
，
秸 秆 腐 熟 程 度 较 均 的 加
且 产量 均 较 不使 用 的增 产 。其 中鸿 生源 、金 葵 子较 京 蒲 园 、 处 理 的产 量 均 高 于 空 白对 照 （ 理 ２ ，增 产 ２ ５ ｋ ／ ６ ｍ， 处 ） 卜 １ｇ ６ ７ 增 济 宁 有机 物 腐 熟剂 与 瑞 莱特 金 葵子 增产 作 用 稍 大 。
２结果与分析
２ １中国传统乳制品中乳酸菌的初 筛结果 ．
经 过划 线纯 化 ，本 研 究从 中 国传统 乳制 品 中筛选 Ｎ５ 纯 化 的 株
１ ２ ３ ４ ５ 物 （ ｏ ｗ ｒ ｒ ｍ ｒ 一 Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ ３ ；Ｒ ｖ ｒ ｅ 乳酸 菌菌 株 ，分别 命名 为Ｌ 、Ｌ 、Ｌ 、Ｌ 、Ｌ 。 Ｆ ｒ ａ ｄ Ｐ ｉ ｅ ：５ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ 一 ｅｅ ｓ
ｂ
Ｂ
ｂ Ｂ ｃ ａ Ａ
注 ： 考 种 时 每 处 理 随 机 连 续 取 ５ 记 半 均 数 蔸
２ ３不同处理对水稻产量结构的影响 ．
产９ ３ ｋ ／ ６ ｍ， 长１ ６ ５ ５ 。方差分析表 明，处理１ 、 — ０ ｇ ６ ７ 增 ．－ ．％ 、３
２ ３ １ 差 异性 比 较 从 农 艺性 状 比较 ，秸 秆 还 田 的结 实率 均 较 空 ５ ７ 处 理４ 异显 著 ， 其 中 ，处 理３ 差 异极 显 著 。 ．． 、 较 差 、７ 白高 ，差 异 显著 ，这 是 因为 施用 秸 秆 还 田 的土 壤造 成 对 水稻 中 后 ３ 结 论
ＪＬＮＡＲＣＬＵＥ ９ ＩＩ Ｇ Ｉ ＴＲ ７ Ｕ
表３
亩有效穗万 每 穗 穗／ ６ ７ ６ｍ 总粒数 实粒数
１ ． ３ ８９３ １ ． ３ ６９５ １． ９ ９７
１ ．３ ９６９
结实率 （） ％
６．ｂ ３ ５ ５．ｃ １５ ６．ａ ９８
６ ． ａ ６Ｏｂ
． Ｐ ｉ ｅ ：５ 一 ＡＧ Ｇ Ｔ Ａ ｃＡ Ｃ 一 ）进 行Ｐ Ｒ ｒ ｍ ｒ Ａ Ｇ ＡＧ Ｇ Ｔ ｃ Ｇ Ｃ ３ Ｃ 扩增 。扩增 体 系 ２ ２降胆固醇乳酸菌的筛选结果 ５ 株乳 酸 菌 都 具 有 一定 的 降胆 固 醇 能力 ，但 是 菌株 之 间差 异 见表 １ 。 较 大 。对照 组 的胆 固 醇含 量 为９ ．ｍ ／ ，Ｌ 、Ｌ 、Ｌ 、Ｌ 、Ｌ 的 ５３ ｇ Ｌ １ ２ ３ ４ ５ Ｐ Ｒ 增 的 反应 条 件 ：９ ￣预 变 性３ ｉ ，９ ℃变 性３ ｓ ３ Ｃ扩 ４Ｃ ｍｎ ４ ０ ，５ ℃ （ 转 ９页 ） 下 ９ 退 火 ３ ｓ ７ ℃ 延 ｛ ６ ｓ ３ 个 循 环 后 ， ７ ℃延 伸 ｌ ｍ ｎ ＂ ０， ２ ＊Ｏ， ０ ２ Ｏ ｉ ，４Ｃ保
６ ．ａ ８７ ６ ．ａ ８７ ６．ｂ ２ ９
２ ． ８ １ ２ ． ８８ ２ ９
３ ． ０５ ２ ． ８５ ３ ．５ ０ ２
２ ．５ ９ ７ ３ ．０ ２ ０ ２．５ ８ ２
２．０ ４ Ｏ ２．５ ５ ７ ２．５ ７５
２ ． ８ １ ２．５ ７７ ２．８ ８６
５２ ６ ５５ ５ ５４ ７
清 测 定 胆 固醇 的含量 。然后 混 匀 ，将 其 置 ３ ￣ 氧 培养 箱 中培养 ７ Ｃ厌 ２ｈ ４ ，离心 ，取上 清测 定 胆 固醇 的含量 。将 同一株 纯化 菌株 同时做 ｌ个 平行 实验 ，求 该菌 株 的胆 固醇 降解率 的平 均值 。 Ｏ 胆 固醇 的降解 率＝ （ 照组 胆 固醇 的 含量 一 对 发酵 后胆 固醇 的含 量 ）／ 照 组胆 固醇 的含 量 。 对 １２ ３ 降胆 固醇乳 酸茵 的生理 生 化实 验 镜检 观 察具 有胆 固醇 降解 ．． 作 用 的乳 酸 菌 的菌 体 形 态 ，观 察 平板 培 养菌 落 的 形态 ，进 行革 兰 氏染 色和 触 酶 实验 ，对 菌株 进 行初 步 鉴 定 。将 该 菌株 接 种 于糖 发 酵 管 中 ，３ ＂ ７ Ｃ厌氧 培养 ２ｈ 观察 实验 结果 ，对 该 菌株 的属 、种 进 ４后 行 鉴定 。 １２ ４ １Ｓｒ Ｎ 的 分子 鉴 定 提 取筛选 到 的具 有胆 固醇 降解 作用 的 ． ． ６ ＲＡ 乳 酸 菌 的基 因 组Ｄ Ａ 以其 为模 板 ，利用 细 菌 １ Ｓ ＲＡ Ｎ， ６ ｒ Ｎ 的通 用 引
４ ℃备 用 。 １２ ２ 降胆 固醇乳 酸 茵的 筛选 胆 固醇 含量 的测 定采 用邻 苯 二 甲醛 ．．
０ １美兰还原试验 ．％ 石蕊牛奶 葡萄糖 ＋ ＋ ＋ 海藻糖 松三糖 淀粉
法 。将 分离 得 到 的 纯菌 株 分 别接 种 与Ｍ Ｓ 养基 中活 化２ ３ ， Ｒ培 —代 取 ｌＬ ｍ 菌液 接 种 于５ Ｌ Ｒ— Ｈ Ｌ ｍ Ｍ Ｓ Ｃ Ｏ 培养 基 中，摇 匀 后立 即离心 ，取上
２．０ ４ ５
差异显著性 比较
ｌ ２ ３
４
９ ． ４８ ９ ． ９７ ９．４ ７８
ｇ ．３ ７５
ｌ１９ ７． １５２ ６． ｌ８１ ５ ．
１８ ２ ６ ．
１９１ ０ ． ８ ． ５１ １０４ １．
１ １０ １ ．
２． ７９ ２ ． ７８ ２ ． ６５
期 养分 供 给 的差 异 ， 使每 穗 结实 率 不 同从 而 影 响产 量 。腐 熟 剂 处 理 的较 秸 秆 空 白 的差 异不 明 显 ，不 同 腐熟 剂 间 鸿 生源 、京 蒲 园 、 济 宁有 机 物腐 熟 剂 与瑞 莱 特 、金 葵 子 差异 显 著 。
２ ３ ２ 不 同处 理 对 水稻 产 量 的影 响 从 测 产 结果 分 析 ，秸 秆 还 田 快 ・・
２ ． ８４
５４ ６ ５５ ２ ５６ ７
５６ ４
ｂ
Ｂ
ｄ Ｃ ａ Ａ
ｃ Ｂ
５ ６ ７
９． ８４ ｉ０ ３ ０． ９．３ ８ ９
２ ．９ ０６７ １．９ ８ ５ ２．２ ０４９
１９ ５ ５ ． １２ ７ ４ ． ｌ １５ ５ ．
wk.baidu.com
１９ ６ Ｏ ． ９ ． ８１ ９ ． ５３
小区产量
折亩产量 平均
２． ８２ ２．５ ６ ２ ２ ． ８８
２ ． ７３
处理
株高ｃ ｍ
千粒重 （ ｇ ）
Ｉ
３．５ １２ ２．０ ８５ ３．５ １ ７
２．５ ８７
Ｉ Ｉ
２ ． ７０ ２． ６５ ２．５ ８７
２ ．５ ８ ７
ＩＩ Ｉ
２ ．Ｏ ６ ２ ２．５ ３ ７ ２．０ ６ ０
２ １年第 ０ 期 ０ １ ６ （ 总第２ ６ ） ５期
吉 林 农 业
ＪＬＩ ＡＧＲＩ Ｉ Ｎ ＣＵＬＴＵＲＥ
ＮＯ ． ６． ２ ｌ Ｏ Ｏｌ
（ ｕ ｌｔ ｅｙ Ｃ ｍｕａｉ ｔ ＮＯ． ５ ） ｖ ２ ６
传统乳制品中降胆 固醇作用乳酸菌的分离研究
蒋 利 亚 ，潘
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（ 阳职 业技 术 学院 ， 湖 北 岳 阳 ４ ４ ０ ） 岳 １ ０ ０