浙江大学生物化学实验甲 用正交法测定几种因素对酶活力的影响 PPT课件
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酶活性测定的主要影响因素及控制要点PPT课件
选购试剂盒时
要仔细阅读试剂盒说明书；
了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等；
选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方 法，或选择公认的测定方法。
使用时
定期对试剂盒的质量进行监测；
准确性、重复性、稳定性好，线性范围宽；
正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸 光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。
如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高 100、15和7倍左右。
RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能 使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的 测定。
.
6
1.1 Hb的吸光度曲线
.
7
1.1 溶血影响的控制
减少溶血
体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加 以克服；
分清体内溶血与体外溶血。
血清置于空气中时，
血中CO2丧失极快，pH可在15min内由 7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感 的ACP活性迅速下降。
某些酶易受光线破坏，
CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆 地失活，其失活程度与暴光时间的长 短成正比。
.
15
1.5 副反应
副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应 外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶 测定的反应。
ALT活性测定的反应式如下：
L 丙 2 氨 氧 酸 代 A 戊 L L T 谷 二 L 氨 丙 酸 酸
L 丙 N 酮 A H 酸 D L D H L 乳 N 酸 AD
.
17
1.5 副反应的控制
可通过加入副反应抑制剂， 或对样品进行预处理等方法给予排除。 双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗
.
12
1.3 贮存不同室温体液酶的稳定性 （活性变化小于10%）
影响酶活性的因素-PPT课件
二.刻度吸量管
刻度吸量管的种类： 按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、 0.5、1、2、5、10ml等数种。其精密度按不同的容积可达移 取量的0.1~1%。通常将管身标明的总容量分刻为100等分。 因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表 0.01ml,其余类推。
刻度吸量管的正确使用方法： 用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液 深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上 时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液 的泄放。吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与 刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液 面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的 刻度线相齐为止。然后将吸量管插到需加试剂的容器 中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。 液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去 （如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下 吸量管移去）。
生物化学实验基本操作
一. 玻璃仪器的洗涤 在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的 重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无 水珠附着在玻壁上。 ㈠ 常用的洗涤方法：
1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合 成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用 少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘 箱烤干备用。
2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能 用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检 查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。 （1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上； （2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡 4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗， 再用蒸馏水冲洗，最后干燥。
取试管4支，按下表操作管号ຫໍສະໝຸດ 1 21%淀粉溶液(ml)
酶活性测定的主要影响因素及控制PPT文档60页
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠要影响因素及控制
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
浙江大学生物化学实验甲不同植物SOD提取及活力测定PPT课件
不同植物SOD提取及活力测定
1、SOD简介
• 超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于动、植
物和微生物中的金属蛋白酶，是一种重要的抗氧化
剂，可清除自由基，其清除自由基的反应如下：
．
．
O2 + O2 + 2H+
SOD
H2O2 + O2
• 生物体在长期的生命活动中，常常会因为环境因素
或生理条件的变化而出现氧自由基增加、抗氧化能
3
不同植物SOD提取及活力测定
核黄素，TEMED ．
O2
光照
O2
． 光照 NBT + O2
还原剂
甲（qian） 蓝色，560nm处具特征光吸收， OD值与 O2 含量．成正比。
．
NBT + O2
SOD 光照
抑制反应
抑制原因：
2 +
2H+
SOD
H2O2 +
O2
SOD对NBT光化还原的抑制程度与SOD活性成正比，
8
（二）SOD同工酶活性染色
• 电泳完后，根据SOD活性测定原理，将NBT溶液加 入凝胶，在光照下，凝胶中不含SOD的地方，由于 NBT进行光化还原生成蓝色甲潛，因此凝胶呈蓝色；
• 而在SOD同工酶谱带处，由于SOD抑制NBT的光化 还原，无蓝色甲潛的生成，因此凝胶透明，即蓝色 背景下的透明带即为SOD同工酶谱带。通过这种方 法，可观察到不同来源SOD同工酶之间以及同一来 源不同发育阶段之间SOD同工酶的差异。
7
（二）SOD同工酶活性染色
• Cu、Zn-SOD则一般是由两个相同的亚基组成的二 聚体，每个亚基的分子量约为16000D，含一个铜原 子及一个锌原子，不同来源的Cu、Zn-SOD其一级 结构的同源性也很高。
1、SOD简介
• 超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于动、植
物和微生物中的金属蛋白酶，是一种重要的抗氧化
剂，可清除自由基，其清除自由基的反应如下：
．
．
O2 + O2 + 2H+
SOD
H2O2 + O2
• 生物体在长期的生命活动中，常常会因为环境因素
或生理条件的变化而出现氧自由基增加、抗氧化能
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不同植物SOD提取及活力测定
核黄素，TEMED ．
O2
光照
O2
． 光照 NBT + O2
还原剂
甲（qian） 蓝色，560nm处具特征光吸收， OD值与 O2 含量．成正比。
．
NBT + O2
SOD 光照
抑制反应
抑制原因：
2 +
2H+
SOD
H2O2 +
O2
SOD对NBT光化还原的抑制程度与SOD活性成正比，
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（二）SOD同工酶活性染色
• 电泳完后，根据SOD活性测定原理，将NBT溶液加 入凝胶，在光照下，凝胶中不含SOD的地方，由于 NBT进行光化还原生成蓝色甲潛，因此凝胶呈蓝色；
• 而在SOD同工酶谱带处，由于SOD抑制NBT的光化 还原，无蓝色甲潛的生成，因此凝胶透明，即蓝色 背景下的透明带即为SOD同工酶谱带。通过这种方 法，可观察到不同来源SOD同工酶之间以及同一来 源不同发育阶段之间SOD同工酶的差异。
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（二）SOD同工酶活性染色
• Cu、Zn-SOD则一般是由两个相同的亚基组成的二 聚体，每个亚基的分子量约为16000D，含一个铜原 子及一个锌原子，不同来源的Cu、Zn-SOD其一级 结构的同源性也很高。
浙江大学生物化学实验甲用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响PPT课件
用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影 响
• 我们常常需要考察各因素对实验影响的情况，但在多因素、多水平试验中，如果对每个因素的每个水 平都互相搭配进行全面试验，需要做的试验次数就会很多。
• 比如对两个7水平的因素，如果两因素的各个水平都互相搭配进行全面试验，要做72=49次试验， • 而3个7水平的因素要进行全面试验，要做73=343次试验。 • 作这么多次试验，要花费大量的人力、物力，还要用相当长的时间，显然是非常困难的。
水平就均出现几次） ➢ b、任何两列中，横行组成的数对出现的次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一
次），即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3， 2）、（3，3）各出现一次。
第9页/共19页
用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影
响
• 以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析 数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。
分钟（显色反应）。 • 取出后立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入5ml蒸馏水，摇匀，测A540值。
第13页/共19页
用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影 响
• 2、非酶对照管（调零用） • 另取试管一支作非酶对照管（调零用）， • 先加入蔗糖酶溶液0.5ml ， • 再加入蒸馏水2.0ml，摇匀后沸水中加热10min让酶变性失活， • 再加入5%蔗糖溶液0.5ml，65℃保温10分钟。 • 然后向管中加入1.0ml 3.5-二硝基水杨酸试剂（碱性终止酶促反应，同时为显色剂），沸水中加热5分
• 试验次数n=q（t-1）+1
• 本试验选用四因素，每个因素选三个水平，因此可选用正交表L9（34）。 4、在所选的正交表上进行表头设计
• 我们常常需要考察各因素对实验影响的情况，但在多因素、多水平试验中，如果对每个因素的每个水 平都互相搭配进行全面试验，需要做的试验次数就会很多。
• 比如对两个7水平的因素，如果两因素的各个水平都互相搭配进行全面试验，要做72=49次试验， • 而3个7水平的因素要进行全面试验，要做73=343次试验。 • 作这么多次试验，要花费大量的人力、物力，还要用相当长的时间，显然是非常困难的。
水平就均出现几次） ➢ b、任何两列中，横行组成的数对出现的次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一
次），即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3， 2）、（3，3）各出现一次。
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用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影
响
• 以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析 数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。
分钟（显色反应）。 • 取出后立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入5ml蒸馏水，摇匀，测A540值。
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用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影 响
• 2、非酶对照管（调零用） • 另取试管一支作非酶对照管（调零用）， • 先加入蔗糖酶溶液0.5ml ， • 再加入蒸馏水2.0ml，摇匀后沸水中加热10min让酶变性失活， • 再加入5%蔗糖溶液0.5ml，65℃保温10分钟。 • 然后向管中加入1.0ml 3.5-二硝基水杨酸试剂（碱性终止酶促反应，同时为显色剂），沸水中加热5分
• 试验次数n=q（t-1）+1
• 本试验选用四因素，每个因素选三个水平，因此可选用正交表L9（34）。 4、在所选的正交表上进行表头设计
《酶活力的测定》课件
数据记录与整理
实验数据记录
在实验过程中，应准确、及时地记录实验数据，包括实验条件、实验步骤、实 验结果等。
数据整理
将实验数据整理成表格或图表，便于分析和比较。数据整理时应确保数据的准 确性和完整性。
数据分析与处理
数据分析
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、误差等指 标的计算。
数据处理
对异常值或离群数据进行处理，如剔除、替换或修正，以确 保数据分析的准确性。
未来，酶活力测定技术的发展将更加注重高灵 敏度、高特异性和自动化方向，为生物工程领 域的研究提供更加精准和高效的工具。
感谢您的观看
THANKS
问题
实验操作复杂，耗时较长。
改进建议
优化实验流程，简化操作步骤，提高实验 效率。
酶活力测定在生物工程领域的应用前景
酶活力测定是生物工程领域中重要的研究手段 ，可用于研究酶促反应动力学、酶的抑制剂和 激活剂等方面的研究。
随着生物工程技术的不断发展，酶活力测定的 应用范围将不断扩大，如应用于生物制药、生 物能源和生物环保等领域。
通过实验，我们掌握了酶活力测定的基本原理和方法，学会了如何设置实验条件和 操作实验。
实验过程中，我们观察到了酶促反应的动力学特征，如米氏方程的适用性和酶促反 应的速率常数。
实验中存在的问题与改进建议
问题
改进建议
实验过程中存在误差，如温度控制不精确 、底物浓度不均匀等。
采用更精确的仪器和设备，如恒温控制器 和磁力搅拌器，以提高实验的准确性和可 重复性。
米氏方程是描述酶促反应速率与底物浓度关系的方程，其形式为V=Vmax[S]/（Km+[S]），其中V代表反应速率，Vmax代表 最大反应速率，[S]代表底物浓度，Km代表米氏常数。
生物化学实验课件-影响酶活力的因素-温度和pH
注意事项
注意事项
1.反应试管应清洗干净，不同试剂、酶液以及移液管不能交叉使用。 2.使用混合唾液或者通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。 3.使用完毕的生物试剂（如：人唾液）的无公害处理。
生物化学实验
THANKS
实验步骤 3.pH对酶活力影响
取干净试管5只，按下表加入试剂并操作。
试剂/管号
1
2
3
4
5
0.2mol/lNa2HPO4/ml
0.16
0.56
1.47
2.43
2.84
0.2mol/lNaH2PO4/ml
2.84
2.44
1.53
0.57
0.16
pH
5.6
6.2
6.8
7.4
8
1%淀粉溶液/ml
1
1
1
1
1
唾液淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小分子的糊精及麦芽糖。它们 遇碘呈不同的颜色。直链淀粉(即可溶性淀粉)遇碘呈蓝色；糊精按分子从 大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽 糖遇碘不呈现颜色。因此可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断。
实验步骤
1.酶的专一性
取干净试管4只，按下表加入试剂并操作。
生物化学实验
影响酶活力的因素-温度、pH
目录 / CONTENTS
CHAPTER 01 CHAPTER 02 CHAPTER 03 CHAPTER 04 CHAPTER 05
实验目的 实验原理 实验试剂 实验步骤 注意事项
实验目的
实验目的
1.掌握温度、pH对酶活力的影响。 2.理解温度、pH影响酶活力的机制。 3.了解测定酶的最适温度、最适pH的方法。
用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验报告
用正交法测定几种因素对酶活力的影响一、前言正交实验法正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。
正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。
正交实验设计包括两部分内容:第一，是怎样安排实验;第二，是怎样分析实验结果。
酶活力酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
1.学习并掌握正交法应用原理。
2.采用正交法测定多种因素对酶活力的影响。
三、实验原理酶促反应常常同时受到多种因素(包括激活剂和抑制剂等)的交互影响，可采用正交法进行综合研究，即通过少量试验收到更好的效果：多快好省。
本实验以正交法同时测定[S]、[E]、温度和pH值对trypsin活性的影响，以求得酶活最大时相应影响因素的最佳值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。
四、实验器材和试剂实验器材：①试管②漏斗③温度计④吸管⑤恒温水浴锅⑥分光光度计实验试剂：①2%血红蛋白液(Hb)②15%三氯醋酸液(TCA)③trypsin酶液④0.04mol/L巴比妥缓冲液(pH 7, 8, 9)⑤考马斯亮蓝染液1.实验设计本实验为四因素三水平(总试验次数34=81)，可选用L9正交表（仅需9次试验)，展开后其特性为均衡搭配（1）每列中水平数1、2、3出现次数相同，均为3次；（2）每两列的横行数对(1-1/1-2/…/3-2/3-3)各出现一次。