拯救细胞系恢复重组家蚕核型多角体病毒包涵体实现外源蛋白在家蚕中产业化生产

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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 30 No. 5 2010
翅目昆虫细胞 (如家蚕 )内活性非常低 ,故需换成其他 高活性启动子 。来源于杆状病毒 O rgyia p seudotsugata multicap sid nuclear polyhedrosis virus (舞毒蛾核型多角 体病毒 , OpMNPV )的极早期转录因子 IE2 启动子在鳞 翅目昆虫细胞内活性较高 。用引物 IE2F 和 IE2R 从 p IZV5H is模板中扩增出 IE2 启动子 , PCR 产物首先克 隆到 T载体 ,经测序正确后 ,用 N ru I/B am H I切下目的 片段 ,连接进 pFBDM 获得 pFA IE2 (即用 IE2 启动子代 替 polh 启 动 子 ) 。用 EcoR I/H ind III切 下 转 座酶 基 因 p iggyBac ORF, 克隆到 pFA IE2, 获得广谱性鳞翅目启 动子驱动的转座酶辅助质粒 p IE22p iggyBac (图 1 ) 。用 引物 A3F和 A3R 从 BmN 细胞基因组 DNA 模板中扩增 出肌动蛋白启动子 (A3 p romoter) , PCR 产物首先克隆 到 T载体 ,测序后克隆到 pRADM 的 N ru I/B am H I位点 获得 pRADM 2A3。引物 phF 和 phR 从野生型 BmNPV DNA 模板中扩增出多角体 ( ph ) ORF, 经 T载体测序 后 , 克 隆 到 pRADMA3 的 EcoR I 与 pst I 位 点 , 获 得 pRADM 2A3ph 。引物 zeocinF and zeocinF 从 p IZV5H is 扩增 出 IE12zeocin 表 达 盒 , 经 EcoRV 单 切 后 克 隆 到 pRADMA32ph的 N ru I位点 ,获得 pRADM 2A3ph2ie1zeo。 A sc I酶切 pRADM 2A3ph2ie1zeo,将 A32ph2ie1zeo 片段克 隆到 pBac3xp32[ egfp ] 获得转座供体载体 pBac2A3ph2 ie1zeo (图 1) 。 1. 3 转染及稳定细胞系筛选 BmN 细 胞 用 补 加 10% 胎 牛 血 清 ( FBS ) 和 Penicillin2strep tomycin双抗 ( 50U /m l) 的 TC2100 培养基 于 28℃培养 。为确定 zeocin 筛选最佳浓度 ,用不同浓 度 zeocin培养正常 BmN 细胞 ,以确定 zeocin浓度对细 胞生长的影响 。将对数生长期细胞接种至 12 孔板中 , 待细 胞 贴 壁 且 汇 片 约 50% 时 , 分 别 设 置 50μg /m l、 100μg /m l、150μg /m l、200μg /m l、250μg /m l、300μg /m l 6 个 zeocin浓度梯度对正常 BmN 细胞进行筛选 ,以确定 最佳 zeocin工作浓度 。转染具体方法按 L ipofectin 2000 说明书进行 。转染前将对数生长期细胞接种到 12 孔 板中培养 ,当细胞汇片形成至 70% ～80%时 ,将转座供 体 pBac2A3ph2ie1zeo和辅助转座载体 p IE22p iggyBac 按 1∶1比例共转染 BmN 细胞 。48h后 ,将被转染细胞以 1: 1的稀释比例接种到另外孔中 ,待细胞贴壁后 ,添加最 佳终浓度 zeocin抗生素 ,继续培养 。 3 ～4 天后换含有 抗生素的培养液 ,直到无细胞死亡 ,获得的 zeocin抗性 细胞即为稳定转化细胞系 BmN 2A3ph。
中国生物工程杂志 China B iotechnology, 2010, 30 (5) : 962102
拯救细胞系恢复重组家蚕核型多角体病毒包涵体 实现外源蛋白在家蚕中产业化生产 3
吴 坤 1, 2 冯 娟 1, 2 姚伦广 133 楚素霞 1, 3 阚云超 1
(1 中英南阳洛桑昆虫生物学联合实验室 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室 南阳师范学院生物科学与技术学院 南阳 473061) (2 河南农业大学生命科学学院 郑州 450002 3 河南师范大学生命科学学院 新乡 453007)
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8 zeocinR gatatcagacatgataagatacattga 27
N ru I B am HⅠ
N ru I B am HⅠ EcoR Ⅰ
PstⅠ
EcoRV EcoRV
1. 2 载体构建 常规 连接 、转化 及 酶切 按 分 子 克 隆 实 验 指 南 进 行 [13 ] 。质 粒 phspBac 携 带 由 果 蝇 热 休 克 启 动 子 ( hsp70)驱动的 p iggyBac转座酶 。因 hsp70启动子在鳞
摘要 构建家蚕 B om byx m ori肌动蛋白 (BmA3)启动子驱动的家蚕核型多角体病毒 (BmNPV )多 角体基因 ( ph)和 OpNPV 极早期启动子 ( IE1)驱动的 zeocin抗性筛选基因转座供体载体 ,与鳞翅 目辅助转座质粒 p ie2p iggyBac共转染家蚕卵巢细胞 BmN ,经 200μg /m l zeocin抗生素筛选一个月 , 成功获 得持 续表 达 BmNPV 多角 体蛋 白的 稳定 细胞 系 BmN 2A3ph。多角体 缺陷 型重 组病 毒 BmBac2GF P感染拯救细胞系 BmN 2A3ph, 细胞成功装配出病毒包涵体颗粒 ,其包装效率约为野 生型病毒感染正常 BmN 细胞的 8%。用拯救型包涵体病毒颗粒喂食家蚕幼虫进行复感染 ,结果 表明稳定细胞系所包装的包涵体病毒与野生型病毒一样能够通过口服途径感染宿主 ,却并不在 宿主体内形成包涵体 ,从而保证外源基因高效表达 。拯救型包涵体病毒可望解决传统注射感染 效率较低问题 ,通过喂食感染可促进杆状病毒介导的家蚕生物反应器产业化进程 。 关键词 拯救细胞系 p iggyBac转座 包涵体 家蚕生物反应器 中图分类号 Q789
因对人及哺乳动物安全 、超强的多角体启动子与 p10启动子驱动外源基因在昆虫细胞内高效表达 、昆虫 细胞培养方便 、病毒操作简单 、克隆外源片段能力大 ( 30～50kb) 、表达产物具有正确加工等特点 ,杆状病毒 表达系 统 已 成 为 表 达 真 核 基 因 的 优 秀 表 达 系 统 之 一 [1 ] 。近来 ,该系统应用逐渐扩大到研究蛋白复合体 功能 ,病毒样疫苗制备 ,全价抗体生产以及基因治疗传 递等领域 [2 ] 。目前主要使用两种杆状病毒表达系统 , 一种为商业化的 AcNPV ( 苜宿银纹夜蛾核型多角体病 毒 ) 2Sf9 (秋粘虫 )细胞系统 , 该系统利用重组杆状病毒 AcNPV 在离体培养细胞 Sf9 中进行外源基因表达 [3 ] 。 另外一种就是 BmNPV (家蚕核型多角体病毒 ) 2家蚕幼 虫表达系统 ,其利用重组 BmNPV 在家蚕活体内进行蛋 白表达 [4 ] 。虽然昆虫细胞培养不需要 CO2 相对方便 , 然与大肠杆菌相比其培养条件苛刻 ,无法大规模发酵
收稿日期 : 2009212231 修回日期 : 2010202223 3 国家自然科学基金 (30700750) 、河南省省教育厅科技攻关项目 ( 2008A180020 )资助项目 33 通讯作者 ,电子信箱 : lunguangyao@163. com
生产 、成本较高 。相比之下 , 家蚕饲养在我国历史悠 久 ,家蚕饲养方式简单经济 , 其成本为细胞培养的 1 / 10, 而蛋白表达量则为其 10 倍左右 ,因此利用杆状病 毒在家蚕体内经济高效地表达外源蛋白方面具良好的 应用前景 。近几年来 ,构建重组 BmNPV 在方法学上的 研究已经取得长足进展 ,除传统的家蚕细胞内同源重 组外 ,基于 BmNPV 的 Bac to Bac系统 ,以及在此基础上 建立的细菌间结合转移构建重组病毒和利用条件型复 制子和 attTn7位点封闭型宿主菌的零背景转座方法都 得以建立 [528 ] 。最近 ,一种不依赖于转染试剂使用携带 重组 Bacm id的 DA P营养缺陷型细菌感染昆虫细胞而 直接获得重组病毒的方法也由本实验室建立 [9 ] 。 由于表达型重组病毒都是包涵体 (也常称为多角 体 )缺陷型病毒 ,不能形成包涵体病毒 ,只能形成出芽 型病毒粒子 (BV ) ,该种形式的病毒无法通过喂食口服 感染家蚕 ,必须注射到家蚕幼虫血腔才能感染家蚕幼 虫 ,以实行外源基因表达 。注射方式在实验室应用问 题不大 ,一旦进行产业化大规模生产gaggagtcggggagaggttaca 21
4 A3R ggatcccttgaattagtctgcaag
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5 phF gaattcaaaaacctataaatatgccg 26
6 phR ctgcagttaatacgccggaccagtga 26
7 zeocinF gatatcttaagggattttggtcatgc
2010, 30 ( 5) 吴 坤 等 : 拯救细胞系恢复重组家蚕核型多角体病毒包涵体实现外源蛋白在家蚕中产业化生产
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不利之处在于 : ( 1)操作繁琐 ,效率低下 ; ( 2 )手工注射 是一个经验性工作 ,和操作者经验密切相关 ,因此其感 染率也会发生变化 ; ( 3 )注射方式容易造成幼虫死亡 , 主要由伤口面积太大造成体液外流死亡或者伤口感染 死亡 ,从而影响产量 ; ( 4)出芽病毒不容易保存 ,在 4℃ 约可保存一年 ,并且病毒滴度会逐渐下降 ; ( 5 )注射方 式无法选择虫龄 ,只能选择 4 ～5 龄 ,太小容易死亡 ,太 大不容易感染 。如果重组病毒保留多角体基因 ,会造 成外源基因表达水平显著下降 ,这是因为多角体蛋白 约占整个包涵体病毒的 90% ,约占被感染细胞的表达 蛋白 40% ～60%。多角体蛋白得以超量表达而影响目 的基因表达 。而且病毒核衣壳被迅速包装成包涵体病 毒 ,影响 BV 的形成和传播 ,同时包涵体会逐渐充满整 个细胞 ,消耗细胞资源 ,细胞会迅速死亡 ,进一步造成 外源蛋白表达低下 [10 ] 。而缺失多角体基因则不会出现 该情况 ,细胞死亡推迟 , BV 传播迅速 ,外源基因得以高 效稳定表达 。 如果能够找到一种避免注射 ,能进行口服感染但 是同时又保留外源基因的高效表达方式 ,则上述问题 可迎刃而解 。因为包涵体病毒可以长期保存 ,感染方 式十分简单 ,只需要将合适量病毒撒在桑叶上 ,皆可进 行大规模感染 , 感染虫龄可以随意选择 , 劳动生产率 高 。包涵体喂食感染剂量低 ,通常一头幼虫可生产上 百万乃至上千万个包涵体病毒粒子 ,通过选择合理虫 龄 ,可以感染上万头家蚕幼虫 。如果简单地采取将多 角体基因还原到病毒基因组中 ,势必造成表达大量多 角体蛋白 ,并迅速装配成包涵体病毒消耗细胞资源而 造成外源基因表达显著下降 ,细胞提前消耗死亡 ,因此 必须另辟蹊径 。我们拟通过拯救方式来实现这一点 , 首先获得在培养细胞或者家蚕幼虫中稳定表达多角体 基因的拯救细胞系或者拯救型家蚕品系 ,重组病毒在 感染拯救细胞系或拯救型家蚕幼虫时由于细胞中已经 表达出多角体蛋白 ,因此能在拯救细胞中装配成包涵 体病毒 。这些被拯救的重组病毒包涵体可以经过口服 方式感染家蚕幼虫 ,由于重组病毒基因组中没有多角 体基因 ,当这些病毒粒子感染家蚕幼虫时 ,无法表达多 角体和再次形成包涵体病毒 ,只能以出芽型病毒粒子 进行水平传播和感染 ,从而外源基因依然得到高效表 达 。本研究通过构建稳定表达多角体蛋白的拯救型细 胞系恢复表达型重组杆状病毒的口服感染力 ,为将来 构建稳 定 表 达 多 角 体 蛋 白 的 拯 救 型 家 蚕 品 系 打 下 基础 。