家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的原核表达

角体 病毒 属的代 表 成 员 ， 病毒 是 具 有 囊 膜包 被 该
基金 项 目： 级 人 才启 动 基 金 （ ９Ｄ ０ ７ 来自百度文库高 ０ＪＧ ５ ）
作者 简 介 ： 国 辉 李
男 ， 士 ， 理 研究 员 。主 要 从 事病 毒 分 子 生 物学 及 基 因 工程 研 究 。Ｅｍａ ：ｇｏｕ ｎ＠ ｙｈｏｃｒ．ｎ 博 助 － ｉ ｌ ｕｈ ｉ ｌ ａｏ ．ｏ ｃ ｌｉ ｊ ｎ
李 国辉 ， 唐 琦 ，胡 朝 阳 ，陈 慧 卿
（ 苏 大 学 生 命科 学 研 究 院 ， 苏 镇 江 江 江 ２２ １ ） １０ ３
摘 要 通 过 Ｐｉ ｅ Ｐｅ ｉ ． ｒ ｒ ｒｍｅ ５０设 计 ｌ 特 异 性 引物 ， 于 扩 增 家蚕 核 型 多 角体 病 毒 囊 膜 蛋 白 Ｇ ６ ｍ ｒ 对 用 Ｐ４的 部 分
Ｐ ｏ ａ ｙ ｔ ｘ ｒｓｉｎ ｏ ｉ ｒ （ ｏ ｙ ｒ ｒ ｋ ｒｏｉ Ｅ ｐ ｅｓ ｆＳｌ Ｗｏ ｍ Ｂ ｍｂｘｍｏ ） ｃ ｏ ｋ
Ｎｕ ｌ Ｏ Ｏ ｙ ｄ Ｏ ｉ ｕ ｃ ｅ ｐ ｌ ｈｅ ｒ ｖ ｒ ｓ ＧＰ６ ｎｅ ４ Ｇｅ
Ｌ ｕ —ｕ ， Ａ Ｇ Ｑ ， Ｕ Ｚ ａ—ａｇ Ｈ Ｎ Ｈ ｉ ｉｇ Ｉ ｏｈ ｉ Ｔ Ｎ ｉ Ｈ ｈｏｙｎ ，Ｃ Ｅ ｕ— ｎ Ｇ ｑ
播 。Ｂ Ｖ与 Ｏ Ｖ在遗 传 组 成上 相 同 ， 们 表 型 不 Ｄ 它 同主要体 现在 病毒 囊 膜蛋 白组 分 上 的差 异 ， 中 其 Ｇ６ Ｐ ４蛋 白是 Ｂ Ｖ病 毒 粒 子 囊 膜 上 的一 种 特 有结 构蛋 白 。Ｇ ６ Ｐ ４蛋 白是病 毒囊膜 上 的一个 糖蛋
白， 病 毒感 染 宿 主 的过 程 中 ， 蛋 白能 够 介 导 在 该
通 过 Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ ．Ａ Ｅ对 诱 导 产物 进 行 电泳 分 析 ， 果 表 明 扩 增 的 目的 片段 获得 了表 达 ； 结 通过 Ｈ ｓ ｉ 单抗 对 诱 导 产 物进
行 Ｗｅｌｒ Ｂｏ 印 迹 分析 ， 结 果表 明诱 导 蛋 白带 为 融合 有 组 氨 酸 的 目的蛋 白 。对 原 核表 达 的 Ｇ ６ ｓ ｎ ｌ ｅ ｔ 其 Ｐ４截短 蛋 白
试 剂盒 购 自 Ｏ ｅａ公 司 ； 烯 酰胺 和 Ｎ， ． 甲 ｍｇ 丙 Ｎ亚 基 双丙烯 酰胺购 自 Ｐｏ ｇ 公 司 ； ｎｉ ｉ 单抗 购 ｒｍｅａ Ａ ｔＨ ｓ ．
自 Ｉｖｔ ｇｎ公 司 ； Ｒ ｎ ｉｏｅ ｒ Ｈ Ｐ标 记 的 羊 抗 鼠二 抗 购 自 武汉 博士 德公 司 ； Ａ Ｄ Ｂ底 物显 色 试剂 盒 购 自北京
收稿 日期 ：０ １ ７ ５； 回 日期 ：０ １ ７２ ２ １－ － 修 ００ ２ １－ － ０ ５
４期
李 国辉 等 ： 蚕 核 型 多 角 体 病 毒 囊 膜 蛋 白 Ｇ ６ 家 Ｐ４的原 核 表 达
９ １
Ｂ Ｎ Ｖ宿 主范 围域 较 窄 ， ｍ Ｐ 主要 感染家 蚕卵 巢组 织
来源的 Ｂ ｍＮ细 胞 系 ， 不 能 在 草 地 贪 叶 蛾 卵 巢 组 而
ｈｓ ｄｎ ．Ｔ ｅｃ ｔｓｏｔｐ ａ ｔ ｘ ｒｓｅ ｒｔｉ ｆＧ ６ ｎ ｍｍｕ ｅ ａｊｖ ｎ ｅｅｆｌ ｒｕ ｄ ａ ｄ ｔｅｆｌ ｉｔ ｉｅ ｈ ｕ ｈ ｒ ｍｋ ￣ｏｉ ｅ ｐｅｓｄ ｐ ｏｅｎｏ Ｐ ４ ａ ｄ ｉ ｉ ｃ ｎ ｄｕ ａ ｔｗ ｒ ｕｌ ｇｏ ｎ ｎ ｈ ｕｌ ｙ ｙ ｇｏ ｎ ｖ ｎ ｐａｍａｗａ ｙ ｏｅｍｉａｌ ｎｅｔｄｉｔ Ｋｕ ｍｉｇｍｉｅａ ｍｕｔ ｐ ｉｔ ｈ ｏａ ｒｔｉ ｒｍ ＢｍＮ ｃｌ ｒｕ ｄ ｅｅ ｌｓ ｓｈ ｐ ｄ ｒ ｃ ｙｉｊｃｅ ｎｏ ｎ ｎ ｃ ｔ ｌ —ｏｎ．Ｔ ｅｔｔｌｐｏｅｎ ｆ ｌ ｉ ｏ ｅｌ ｓ
Ｂ Ｌ 。 Ｒ ） １ １３ 主 要 试 剂 限 制 性 内 切 酶 Ｅ ｏ 饿ｎ ． ． ｃＲ Ｉ、 ｄ
其生 活史 中会 出现 ２种 典 型 的病 毒 粒 子 ： 出芽 型 病毒 粒子 Ｂ Ｖ和 包 埋 型 病 毒 粒 子 Ｏ Ｖ。Ｏ Ｖ病 Ｄ Ｄ
毒粒 子介导 家 蚕 个 体之 间 的传 播 ； Ｂ 而 Ｖ病 毒 粒 子介导 家蚕 体 内细胞 以及 体外培 养细胞 之间 的传
ＰＡＧＥ ｌｃｒ ｐ ｏ ｅ ｉ ． Ａｎｄ ｔ ｅ ｕｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔｔ ｅａ ｌｆｅ ａ ｇ ｔｆａ ｍｅ ｔｗａ ｘ ｒ ｓ ｅ Ｗ ｅ ｔｒ ｌｔａ ｌ ｓｓ ｅｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓ ｈｅｒ ｓ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｍｐ ｉ ｄ ｔｒ ｅ ｒ ｇ ｎ ｓｅ ｐ ｅ ｓ ｄ． ｓ ｉ ｓｅ ｎ ｂｏ ｎａｙ ｉ ｕ ｉｇ ６ × Ｈｉ ｎ ｅｏ ａ ｎ ｉｏ ｙ ｈ ｄ ｃ ｎ ｒ ｄ ｔ ｔ ｔｅ ｎ ｃ ｄ ｐｒｔ ｉ ａ ｓ ｈ ａ ｇ ｔｐ ｏｅｎ ｂ ｅ ｄ ｄ ｗｉ ｓｎ ｓ ｍｏ ｏ ｌｎ ａ ｔｂ ｄ ａ ｏ ｆ ｍｅ ｈａ ｈ ｉｄｕ ｅ ｏｅｎ ｂ ｎｄ ｗａ ｔｅ ｔｒ ｅ ｒ ｔｉ ｌ ｎ ｅ ｔ ｌ ｉ ｈ
ｉｆ ｃｅ ｔ ｎ ｅ ｔｄ ｗｉｈ Ｂｍ ＮＰＶ ｓｅ ａ ｎ ｄ ｂｙＷ ｅ ｔｒ ｏ ｎ ｌｓｓｕ ｉｇ ｒ ｉｅ ｗａ ｘ ｍｉ ｅ ｓｅ ｎ Ｂｌｔａ ａｙ ｉ ｓｎ ａｓ ｄ ＧＰ６ ｎｉｅ ｍ ． Ａ ｐ ｃｆｃ ｈ ｂ ｉ ｒ ｔｉ ４ ａ ｔｓ ｒ ｕ ｓ ｅ ｉ ｙ ｒｄ ｐ ｏｅｎ ｉ ｂ ｎ ｔ ｂ ｕｔ６ ｕ ａ ｐｅ ｒ ｄ ｏ ｈｅ ｈ ｂ ｉ ｅ ｂ ａ ｅ，ｉ ｄｉａｉｇ ｔａ ｈｅ ｐ ｅ ａ ｅ ＧＰ６ ｓ ｅ ｉ ｃ ａ ｔｂｏ ｏ ｄ ａ ｄ ｗｉｈ ａ ｏ ４ ｋ ｐ ａｅ ｎ ｔ ｙ ｒｄ ｍ ｍ ｒ ｎ ｎ ｃ ｔｎ ｈ ｔｔ ｒ ｐ ｒ ｄ ４一ｐ ｃｆ ｎ ｉ ｄｙ ｃ ｕｌ ｉ
９ ０
微 生物 学 杂 志 ２ １ 年 ７ ０１ 月第 ３ 卷 第 ４ １ 期 Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ ＩＲ ＢＯ Ｏ ＹＪｌ２１ Ｖ１ １ ｏ Ｏ Ｒ Ａ Ｆ Ｃ Ｏ ＩＬ Ｇ ｙ ０ １ ｏ ３ Ｎ ． Ｍ ｕ ． ４
家 蚕核 型 多角体 病 毒 囊 膜 蛋 白 ＧＰ ４的原 核 表 达 ６
ｂ ｅ ｏ ｕ ｈｅ ｔｄｙ ｏ ｔ ｕ ｃ ｉｎ． ｅ ｕｓ ｄ ｆｒｆ ｒ ｒｓｕ ｆｉｓｆ ｎ ｔｏ ｔ
Ｋｅ ｙｗｏ ｄｓ Ｂｏ ｂ ｘ ｍｏ ｉｎ ｃ ｅ ｐｏｙ ｅ ｒ ｖｒ ｓ Ｇ ４ ｇ ｎｅ；ＧＰ ４ ｒｔ ｉ ｒ ｍ ｙ ｒ ｕ ｌ ｏ ｌｈ ｄ ｏ ｉ ； Ｐ６ ｅ ｕ ６ ｐ ｏｅｎ；ｐ ｏ ａ ｙ ｔ ｘ ｒ ｓ ｉｎ；ａ ｔｂ ｄ ｒ ｐａ ｒ ｋ ｒ ｏｉ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｎｉ ｏ ｙ ｐ ｅ —
ｆ ｄｗｉ Ｃ ｉ ｔ Ｐ Ｒ．Ｔ ｅｐ ｒ ｅ ａｇ ｔＤＮ ｒｇ ｎ ｎ ｒｋ ｒｏｉ ｘ ｒｓｉｎ ｖ ｃｏ Ｅ ２ ａｗａ ｕ ｊｃｅ Ｏ ｄ ｕ ｌ ｅ ｈ ｈ ｕｉ ｄｔｒｅ Ａ ｆａｍｅ ｔａｄ ｐ ｏａｙ ｔ ｅ ｐｅｓ ｅ ｔｒｐ Ｔ ８ ｓｓ ｂｅ ｔｄ ｔ ｏ ｂｅ ｉ ｆ ｅ ｏ ｅ ｚｍａｉ ｉｅｔ ｎｗｉ ｃＲＩａ ｄ ＨｉｄＩ ａ ｄ ｔｅ ａｒ ｄ ｏ ｔｔｅｌ ａｉｎ；Ｅ ｃｉ ＢＬ １（ ３）ｃｌ ｈ ｔｈ ｄ ｎ ｙ ｔ ｄｇ ｓｉ ｔ Ｅ ｏ ｎ ｎ ＩＩ ｎ ｈ ｎ ｃ ｒｅ ｕ ｈ ｉ ｔ ｃ ｏ ｈ ｉ ｇ ｏ ． ｏｌ ２ ＤＥ ｅｌ ｔａ ａ ｓ
ｐ Ｔ２ ａ 粒购 于 Ｎ ｖｇｎ公 司。 雄性 昆 明小 鼠 Ｅ －８ 质 ｏ ａｅ 购 自江苏大 学动 物实 验 中心 。
织 来源 的 Ｓ２ 或 者 Ｓ 细胞 系 以及 粉纹 夜蛾胚 胎 ｆ１ 来 源 的 Ｈ ５细胞 系 中有 效地增 殖 。Ｂ Ｎ Ｖ在 ｉ ｍ Ｐ
１ １ ２ 培 养基 大 肠 埃 希 菌 的培 养采 用 常 规 固 ．． 体或 液体 Ｌ Ｂ培养基 ； ｍ Ｂ Ｎ细胞 培 养 于 Ｔ 一０ Ｃ １０培 养 基 （ ｐ ｌ ｈｍ）辅 以 １ ％ 胎 牛 血 清 （ ｉｃ Ａ ｐｉ ｅ Ｃ ０ Ｇｂ ｏ
（ ｃｄ ｆＬ ｅＳｉ， ｉｎｓ ｎ． ｈｎａ ｇ２２ １ ） Ａ ａ ．ｏ ｉ ｃ ＪａｇｕＵ ｉ，Ｚ ｅｆ ｎ １０ ３ ｆ ． ｉ
Ａ ｂｓｒ ｃ Ｓ ｅ ｉｉ ｒｍｅ ｓｗｅ ｅ ｄ ｓｇ ｅ ｏ ａ ｌｆ ｒ ｃ ｔｄ ｆａ ｍｅ ｔｏ ｉｋ ｗｏ ｎ ｔａ ｔ ｐ ｃｆｃ ｐ ｉ ｒ ｒ ｅ ｉｎ ｄ ｔ ｍｐ ｉ ａ ｔｕｎ ａｅ ｒ ｇ ｎ ｆｓｌ ｒ ｌＢｍ ＮＰ ＧＰ６ ｅ ｅ ａ ｕｒ— ｙ Ｖ ４ ｇ ｎ ｎｄ ｐ ｉ
和 免 疫佐 荆 进 行 充 分研 磨 ， 充分 研 磨 后 的 匀浆 液 对 昆明 小鼠 进 行 皮 下 多 点注 射 ， 将 以制 备 的 Ｇ ６ Ｐ ４多抗 对 家蚕
核 型 多 角体 病 毒 粒 子 感 染 的 Ｂ ｍＮ细 胞 总 蛋 白进 行 Ｗｅｔ ｎＢｏ 印 迹 分析 ， 果 在 杂 交膜 上 出现 一 条 特 异 杂 交 ｓ ｒ ｌ ｅ ｔ 结 带 、 分 子 量 大 小约 为 ６ ｕ表 明 制备 的 Ｇ ６ 其 ４ｋ ， Ｐ ４多抗 可 用 于其 功 能 的进 一 步研 究 。 关 键 词 家蚕 核 型 多 角体 病 毒 ；Ｐ ４基 因 ； Ｐ４蛋 白 ； Ｇ６ Ｇ６ 原核 表 达 ； 体 制 备 抗 中 图分 类 号 Ｑ ８ ７６ 文献标识码 Ａ 文章编号 ｌ０ —７２ （０ １０ ０ ９ Ｏ Ｏ ５ ０ １ ２ １） ４— ０ ０一 ５
１ 、５ ｐ Ｄ Ａ Ｌ ｄ ｅ Ｍａｋｒ 蛋 白质低 分 子 量 １ ２ ０ ｂ Ｎ ａ ｄｒ ｒｅ、 Ｉ Ｍａｋｒ Ｔｑ酶 购 自 Ｔ Ｋ Ｒ ｒｅ、 ａ ａ ａ ａ公 司 ； 白 质 预 染 蛋 Ｍ ｒｅ Ⅲ购 自 Ｆ ｒ ｅ ｔ 公 司 ； ａｋ ｒ ｅｍ ｎａ ｓ 质粒 提 取和 胶 回收
ｃ ｕ ｈ ｈ ｅ ｏ ａ ｇ ｔｔ ｅ ｒｃ ｍｂｉａ ｔｐａ ｍｉ ｎ ｎ ｌｓ ｄ ｐＥＴ ２８ａ ＧＰ６ ｓ ｎ ｃ ｄ ｗｉｈ ＰＴＧ ｎｄ ａ ｌ ｚ ｄ ｔ ｎｄ ｃ ｄ ｐ ｏ ｕ ｔｗｉ ・ ４ ｗａ ｉｄｕ ｅ ｔ Ｉ ａ ｎａｙ ｅ ｈｅ ｉ ｕ ｅ ｒ ｄ ｃ ｔ ＳＤＳ－ ｈ ・
Ｄ Ａ 片段 ， Ｐ Ｒ扩 增得 到 的 Ｄ Ａ 片段 进 行 纯 化 ， 对 纯化 后 的双 酶 切 Ｄ Ａ 片段 与 经 同样 双 酶切 后 的 原 核 Ｎ 对 Ｃ Ｎ 并 Ｎ
表 达 载 体 ｐ Ｔ ８ 进 行 连接 ； Ｅ ２ａ 对捕 获 有 重组 质 粒 ｐ Ｔ８ —Ｐ ４的 大肠 埃 希 茵 Ｂ ２ （ Ｅ ） 胞 进 行 ＩＴ Ｅ ２ ａＧ ６ Ｌ１Ｄ３ 细 Ｐ Ｇ诱 导 ，
ｒ ｔｏ ａ ｉｎ
家 蚕 核 型 多 角 体 病 毒 （ ｏ ｙ ｏｉｎ ｃ — Ｂ ｍｂｘ ｍ ｒ ｕｌ ｅ
ｏｏｙｅ ｒｖ ｕ ， ｍ Ｐ 是 昆 虫杆 状 病 毒 科 核 多 ｐ ｌ ｄｏ ｉ ｓ Ｂ Ｎ Ｖ） ｈ ｒ
的双链 环状 Ｄ Ａ病 毒 ， Ｎ 其基 因组 为 １ ８ｋ ， 论 ２ ｂ 理 预计 有 １６个 开放 阅读框 （ ３ 编码具有 ６ ０个 氨基 酸 以 上 的 Ｏ Ｆ， ｐｎ ｅｄｎ ｆ ｍ ） 。 究 报 道 ａ Ｏ ｅ ａ ｉｇｒ ｅ … 研 ｒ ａ