0.3 nm分辨率绿豆胰蛋白酶抑制剂Lys活力碎片―牛胰蛋白酶(MBILF-BTRY)复合物的晶体结构分析和分子
绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离和纯化
绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离和纯化刘同祥;牛建昭;许惠玉;屠衡青;王继峰【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2007(28)3【摘要】目的研究1种高效分离纯化绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的方法.方法采用硫酸抽提,硫酸铵分级沉淀,缓冲液溶解沉淀,用相对分子质量(Mr)为30 000的超滤膜去除大分子蛋白质,Mr为5 000的超滤膜除盐及小分子蛋白质,亲和色谱纯化,得MBTI,高效液相色谱法(HPLC)和SDS-PAGE电泳法分别测定其纯度和Mr,以酪蛋白为底物测其活性.结果纯化的MBTI经HPLC和SDS-PAGE鉴定为2条蛋白质带,其Mr分别为12 000和8 000,其活性约为大豆蛋白酶抑制剂的3倍.结论超滤法与亲和色谱结合能快速高效地分离纯化MBTI.【总页数】4页(P145-148)【作者】刘同祥;牛建昭;许惠玉;屠衡青;王继峰【作者单位】北京中医药大学,细胞生化实验室,北京,100029;北京中医药大学,细胞生化实验室,北京,100029;北京中医药大学,细胞生化实验室,北京,100029;北京中医药大学,细胞生化实验室,北京,100029;北京中医药大学,细胞生化实验室,北京,100029【正文语种】中文【中图分类】TQ464.8【相关文献】1.红肉菠萝蜜种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其特性 [J], 韦双双;张英霞;贾万贤;周海龙2.银杏种子中胰蛋白酶抑制剂的分离纯化 [J], 陈金铭;郭瑞华;耿增岩;张朋远;3.尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)分离纯化研究 [J], 王富花4.竹笋胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其性质 [J], 余能富;贺磊;王小东5.竹笋胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其性质 [J], 余能富;贺磊;王小东;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
豆制品中胰蛋白酶抑制剂的研究
·食品科技·豆制品中胰蛋白酶抑制剂的研究杨丽杰吴非霍贵成孙占海（东北农业大学）【摘要】对豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性进行了调查，发现水解蛋白、乳用蛋白、组织蛋白、水豆腐、干豆腐中胰蛋白酶抑制剂活性均被钝化了以上；对腐乳、豆酱中胰蛋白酶抑制剂活性进行检测，结果未检出。
无糖豆粉、豆粉、豆浆以及内酯豆腐中胰蛋白酶抑制剂钝化率低于。
比较了种热处理方式对胰蛋白酶抑制剂的钝化效果，得到巴氏杀菌可钝化胰蛋白酶抑制剂；高压杀菌可钝化，超高温灭菌可钝化。
【关键词】豆制品；胰蛋白酶抑制剂；热处理中图分类号：文献标识码：文章编号：（）大豆营养价值高，是人和动物的主要蛋白质来源，但其中含有胰蛋白酶抑制剂，有碍营养素的吸收，导致食用后身体不适或豆制食品感官上的缺陷，严重时会造成人或动物的死亡。
豆制品中胰蛋白酶抑制剂的存在还没有引起人们足够的重视。
目前失活胰蛋白酶抑制剂主要采用热处理，为达到彻底钝化而采用的过度加热可使大豆中的蛋白质溶解度降低，营养物质遭到破坏。
而且，胰蛋白酶抑制剂比较耐热，热处理的效果也很有限。
本研究对市场上多种豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性进行了测定调查，比较了常用热处理方式对胰蛋白酶抑制剂的钝化效果，有利于人们对豆制品安全性的认识，为更彻底地失活胰蛋白酶抑制剂提供依据。
材料与方法材料与设备腐乳、干豆腐、内酯豆腐、豆浆、水豆腐、豆酱、豆粉为市售；无糖豆粉、水解蛋白、乳用蛋白、组织蛋白为大豆蛋白食品公司提供；生豆粉为实验室自备；所用化学试剂为分析纯或生化试剂。
牛胰蛋白酶、、均由美国公司生产。
仪器设备：振荡培养箱（上海医用仪表厂）、离心机（北京医用离心机厂）、型凯氏定氮仪（北京宜兴科教仪器研究所）、多功能恒温水浴锅型（沈阳市医疗器械厂）、紫外可见分光光度计型（日本岛津公司）、高压灭菌器（上海医用核子仪器厂）。
试验方法豆制品中常规营养成分测定d水分含量测定：常压干燥法。
i粗蛋白测定：微量凯式定氮法。
Lyso-Tracker Red (溶酶体红色荧光探针) 产品说明书
Lyso-Tracker Red (溶酶体红色荧光探针)产品简介：Lyso-Tracker Red 是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，能通透细胞膜，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。
Lyso-Tracker Red 为采用Molecular Probes 公司的DND-99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，其中仅弱碱可部分提供质子，以维持pH 在中性,可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。
中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。
Lyso-Tracker Red 适用于活细胞溶酶体的荧光染色，但不适合用于固定细胞溶酶体的荧光染色。
Lyso-Tracker Red 分子的化学结构式参考图1。
图1. Lyso-Tracker Red 的化学结构式。
Lyso-Tracker Red 的分子式为C 20H 24BF 2N 5O ，分子量为399.25，最大激发波长为577nm ，最大发射波长为590nm 。
Lyso-Tracker Red 的激发光谱和发射光谱参考图2。
图2. Lyso-Tracker Red的激发光谱和发射光谱。
Lyso-Tracker Red 是嗜酸性荧光探针，用于活细胞内酸性细胞器的标记和示踪。
这些探针具有几个重要特征，包括高度选择靶向酸性细胞器和在纳摩尔浓度有效标记活细胞。
Lyso-Tracker Red 必须在极低浓度(通常约50nM)下才能获得优异的选择性。
这些探针的滞留(retention)机制虽然没有被研究清楚，但很可能与酸性细胞器的质子化和滞留性有关，Lyso-Tracker Red 探针的内吞作用动力学研究显示染料进入活细胞的摄入时间仅几秒即可。
然而，这些溶酶体探针会导致溶酶体被碱化，长期孵育会诱使溶酶体pH 值的增加。
线粒体自噬-NLRP3炎症小体通路在新生大鼠缺血性脑损伤中的作用研究
天津医药2023年11月第51卷第11期线粒体自噬-NLRP3炎症小体通路在新生大鼠缺血性脑损伤中的作用研究林永文，陈巧媚，敖当，黄炳龙，骆成珠，李承燕△摘要：目的探讨线粒体自噬-NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体通路对新生大鼠缺血性脑损伤的影响。
方法将42只1周龄SD 大鼠分为Sham 组、脑缺血-再灌注损伤（CIRI ）组、CIRI+二甲基亚砜（DMSO ）组、CIRI+Mdivi-1组、CIRI+MCC950组、CIRI+Ac-YVAD-cmk 组，每组7只。
除Sham 组外，其他各组采用单侧颈总动脉阻断法建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型。
采用Londa 法行神经行为障碍评分，HE 染色观察海马体CA1区细胞形态，透射电子显微镜观察海马神经元超微结构，Western blot 检测线粒体自噬和NLRP3炎症小体通路相关蛋白。
结果与CIRI+DMSO 组比较，CIRI+Mdivi-1组的神经行为障碍评分增加，突触数减少及肿胀线粒体数增多（均P ＜0.05）；与CIRI+Mdivi-1组比较，CIRI+MCC950组及CIRI+Ac-YVAD-cmk 组神经行为障碍评分降低，突触数增多及肿胀线粒体数减少（均P ＜0.05）。
与CIRI+DMSO 组比较，CIRI+Mdivi-1组PTEN 诱导的激酶1（PINK1）、Parkin 、LC3Ⅱ/Ⅰ表达下调，线粒体外膜转位酶20（TOMM20）、P62及NLRP3、胱天蛋白酶（caspase ）-1、caspase-8蛋白表达增加（P ＜0.05）。
与CIRI+Mdivi-1组比较，CIRI+MCC950组及CIRI+Ac-YVAD-cmk 组PINK1、Parkin 、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达增加（P ＜0.05），CIRI+MCC950组NLRP3、caspase-1、caspase-8蛋白及CIRI+Ac-YVAD-cmk 组caspase-1、caspase-8蛋白表达下调。
绿豆胰蛋白酶抑制剂的提取纯化及抗豆象机理研究
绿豆胰蛋白酶抑制剂的提取纯化及抗豆象机理研究胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,TI)是一类对胰蛋白酶有抑制作用的多肽或蛋白质,在豆类作物种子中含量较高,不仅有抗虫作用,还有抗病毒、抗肿瘤的作用。
因此寻找新型的、高活性的胰蛋白酶抑制剂具有重要的理论价值和应用价值,而目前有关胰蛋白酶抑制剂的研究主要集中在大豆、红豆等少数几种豆子中,关于抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor,MBTI)的活性高低以及杀虫机理还未见报道,为此,本研究以不同绿豆为试验材料,进行了绿豆胰蛋白酶抑制剂的提取纯化和稳定性的研究,筛选出具有较强活性的绿豆胰蛋白酶抑制剂,并进行了抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫体内蛋白酶、代谢酶、保护酶活性以及生长发育的研究,旨在明确抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性以及抗豆象的杀虫机理,以期为抗虫绿豆资源的开发利用提供理论依据。
研究结果如下:1、绿豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性试验表明:不同温度、不同pH、不同振幅超声波、不同高温高压、不同变性剂和不同还原剂对5个绿豆品种胰蛋白酶抑制剂残余活性均有一定影响,且处理时间越长,影响越大。
其中抗虫绿豆B18、B20是绿豆胰蛋白酶抑制剂稳定性较高的2个品种,应用价值较大。
2、绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化试验表明:绿豆胰蛋白酶抑制剂粗提的最适提取剂为氯化钠溶液,最适提取时间为12h,其中抗虫绿豆B18胰蛋白酶抑制剂粗提物中蛋白质含量、总活力和比活力均最高,分别为96.252 mg、553.738 U 和5.753 U/mg。
选取最适硫酸铵饱和度为60%时对其进行沉淀,得到的粗蛋白通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析后分离纯化出胰蛋白酶抑制剂纯品,得出抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂活性明显高于感虫品种,其中B18的胰蛋白酶抑制剂比活力和纯化倍数最高,分别为88.766 U/mg和14.641倍,B20次之,同时检测出5个绿豆品种中胰蛋白酶抑制剂的分子量约为8.8KDa。
Natrix Q 蛋白质膜产品说明书
Figure 1. The Natrix ® Q chromatography membrane family offers scalable polishing from R&D to clinical to commercial manufacturing.Data SheetKey Benefits• Best-in-class HCP , DNA, endotoxin and virus removal • Salt and pH tolerance even in phosphate buffer • High capacity final polishing with high mAb throughput (>10 kg/L)• Simple, low-cost purification in a single-use formatInnovative Membrane TechnologyThe unique Natrix ® Q membrane is a porous polyacrylamide hydrogel containing a high density of pendant quaternary ammonium (Q) binding groups physically reinforced by an inert fiber web (see Figure 2). The interconnected pore structure (nominal pore size, 0.4 μm) and high ligand density provides a large surface area for protein binding, high permeability and enables fast flow rates with high throughput to extremely high loads (> 10 kg per liter of membrane for some mAbs) while maintaining excellent impurity clearance at these extreme operating conditions. In combination with the well-established Q ligand chemistry, these features make the Natrix ® chromatography membrane an excellent choice for reliable purification in commercial scale.Natrix ® QChromatography MembraneFor single-use, scalable purificationNatrix ® chromatography membrane is a high capacity, high throughput strong anion exchange device designed to purify biomolecules. It combines the capacity of high performing resins with the exceptional flow properties of chromatography membranes. The Natrix ® chromatography membrane platform is fully scalable from0.2 mL devices to production-scale and delivers enhancements in productivity, flexibility, and process robustness for any bioprocess.The Life Science business of Merck operates as MilliporeSigma in the U.S. and Canada.2Flexible polymeric support web physically reinforces functional hydrogel.Web is enclosed by and filled with porous functionalized hydrogel,establishing pore size.Figure 2. Structure of Natrix ® membrane technology Composed of a porous, functionalized 3-dimensional hydrogel polymerized within and around a flexible fiber web support.SpecificationsNatrix ® Q PilotCatalogue No.NXF-10Pack size1 unitMembrane material Porous polyacrylamide hydrogel reinforced with inert polymeric web LigandQuaternary amine (Q)Membrane configuration Pleated Number of layers2Nominal membrane bed thickness0.5 mm Typical membrane bubble point pore diameter 1.4 μm Typical membrane flow pore diameter 0.4 μm Nominal unit membrane volume 15 mLTypical unit flow rate range75–375 mL/minMaximum operating pressure & temperature (liquids)75 psi/5.2 bar at 32–100 °F/0–38 °C Nominal unit weight110 gLength (connector-connector)Approximately 165 mm/6.5 in.Width (weld diameter)Approximately 69.9 mm/2.75 in.ConnectorsInlet, outlet: 3/4 in. sanitary (TC) Vent: Luer Drain: Luer Housing material (polypropylene), biological reactivity USP <88> ClassVI Membrane cytotoxicityISO 10993-53Natrix ® Q Process 150Catalogue No.NXF-20Pack size1 unitMembrane material Porous polyacrylamide hydrogel reinforced with inert polymeric web LigandQuaternary amine (Q)Membrane configuration Pleated Number of layers2Nominal membrane bed thickness0.5 mm Typical membrane bubble point pore diameter 1.4 μm Typical membrane flow pore diameter 0.4 μm Nominal unit membrane volume 115 mL Typical unit flow rate range0.6–3.0 L/minMaximum operating pressure & temperature (liquids)90 psi/6.2 bar at 32–100 °F/0–38 °C Nominal unit weight 665 gLength (base to vent tip)Approximately 330 mm/13.0 in.Width (connector-connector)Approximately 133.4 mm/5.25 in.Width (diameter)Approximately 88.4 mm/3.48 in.ConnectorsInlet, outlet: 1 in. sanitary (TC) Vent: SanitaryDrain: 1/4 in. Sanitary Housing material (polypropylene), biological reactivity USP <88> ClassVI Membrane cytotoxicityISO 10993-5Natrix ® Q 150Capsule Dimensions4Natrix ® Q Process 600Catalogue No.NXF-50Pack size1 unitMembrane material Porous polyacrylamide hydrogel reinforced with inert polymeric web LigandQuaternary amine (Q)Membrane configuration Pleated Number of layers2Nominal membrane bed thickness0.5 mm Typical membrane bubble point pore diameter 1.4 μm Typical membrane flow pore diameter 0.4 μm Nominal unit membrane volume 460 mL Typical unit flow rate range2.3–11.5 L/minMaximum operating pressure & temperature (liquids)90 psi/6.2 bar at 32–100 °F/0–38 °C Nominal unit weight 2080 gLength (base to vent tip)Approximately 1049 mm/41.3 in.Width (connector-connector)Approximately 133.4 mm/5.25 in.Width (diameter)Approximately 88.4 mm/3.48 in.ConnectorsInlet, outlet: 1 in. sanitary (TC) Vent: SanitaryDrain: 1/4 in. Sanitary Housing material (polypropylene), biological reactivity USP <88> ClassVI Membrane cytotoxicityISO 10993-5Natrix ® Q 600Capsule DimensionsTable 1. Primary characteristics of the Natrix® Q chromatography membrane technologyHydrogel Porous polyacrylamideFunctional group Quaternary amineTypical flow rate5–25 mL/minNominal pore size0.4 μmBSA binding capacity>200 mg/mLDNA binding capacity>20 mg/mLChemical compatibility Compatible with most buffers and solvents commonly used in chromatographic biomolecule purificationprocesses (see the Validation Guide for complete and detailed information)Incompatible chemicals Hypochlorite (1%); SDS (1%)Shipment conditions Dry, ready to use (free of preservatives or wetting agents)Storage conditions Store at room temperature prior to useTable 2. Natrix® Q Chromatography Membrane Properties21Natrix® Q Micro Scaled down laboratory model toscreen and fine-tune parameters.1–5mL/min Flat sheet20.040.2Natrix® Q Pilot Intermediate scale, intended to verifyand adjust operating parameters. Pilotmay be used for smallscale clinical orcommercial manufacturing.75–375mL/minPleated150315Natrix® QProcess 150 Process scale designed forclinical and commercialmanufacturing of proteins.0.6–3L/min115023115Natrix® Q Process 6002–10L/min4600924601B ased on typical process streams and loading up to 10 kg mAb/L-membrane. Loading capacity is not limited to 10 kg/L and depends on the total impurity content.2T ypical flow-rate range is based on 5–25 membrane volumes/minute. Specific flow-rates can be determined to accommodate process requirements (e.g. maximum back pressure, improved process time, etc.).Ordering InformationNatrix® Q Micro0.210NXF-00 Natrix® Q Pilot151NXF-10 Natrix® Q Process 1501151NXF-20 Natrix® Q Process 6004601NXF-505For additional informationplease visit To place an order orreceive technical assistanceplease visit /contactPS Merck KGaAFrankfurter Strasse 250 64293 Darmstadt, Germany© 2022 Merck KGaA, Darmstadt, Germany and/or its affiliates. All Rights Reserved. Merck, the vibrant M, Millipore, and Natrix are trademarks of Merck KGaA, Darmstadt, Germany or its affiliates. All other trademarks are the property of their respective owners. Detailed information on trademarks is available via publicly accessible resources.MK_DS2158EN Ver. 1.04136207/2022。
胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mgml)
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml) 使用说明书
10ml -20℃ 避光 1份
操作步骤(仅供参考)：
1、 开盖前请低速离心一下，以便将黏附于管壁的液体甩至管底。 2、 使用时，根据裂解液的用量加入胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml)，使其工作
浓度在 1-10μg/ml，多用在 3-5μg/ml。
Leagene 胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml)主要由胰蛋白酶抑制剂 Aprotinin 等组成，不含 EDTA。适用于从哺乳动物组织、细胞中提取蛋白质，能够更有效的获得目的 蛋白质。提取出来的蛋白可以用于 Western Blot、免疫共沉淀等试验。
组成：
名称
编号 PI0032
注意事项：
1、 胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml)有轻微刺激性，小心操作，同时应避免反复 冻融。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12 个月有效。
相：
编号 DC0032 TC0699
名称 Masson 三色染色液 葡植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)
北京雷根生物技术有限公司
胰蛋白酶抑制剂溶液(Aprotinin,1mg/ml)
简介：
蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor)是指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使 蛋白酶活力下降甚至消失但不使蛋白变性的物质。蛋白酶抑制剂有很多种，包括 EDTA、 E-64、NaVO3、Bestatin、Leupetin、Pepstatin A、Aprotinin 等均可有效抑制蛋白的降 解，并维持原有的蛋白间相互作用。
普洛麦格TnT
中 文 说 明 书适用产品目录号：L1170, L1171, L2080 和 L20812020 版 CTM045原英文技术手册TM045TnT ®Quick Coupled Transcription/Translation Systems G9711, G9712 and G9713普洛麦格(北京)生物技术有限公司Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B 座907-909电话：************网址： 技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)技术支持邮箱：*************************TM0452020制作1TnT ®Quick Coupled Transcription/Translation Systems 1. 产品描述 (2)2. 产品组成和储存条件 (6)3. 一般注意事项 (7)3.A. DNA 模板注意事项 (7)3.B. 创建无核糖核酸酶的环境 (8)3.C. 裂解物的处理 (8)4. 翻译流程 (8)4.A. 使用质粒DNA 进行TnT ®Quick Coupled Transcription/Translation Reaction 的一般操作流程 (9)4.B. 使用PCR 产生的DNA 进行TnT ®Quick Coupled Transcription/Translation Reaction 的一般操作流程 (10)4.C. 说明 (11)5. 使用萤光素酶的阳性对照翻译反应 (12)5.A. 放射性萤光素酶对照反应 (12)5.B. 非放射性萤光素酶对照反应 (12)6. 使用犬胰腺微粒体膜的共翻译加工 (13)6.A. 使用微粒体膜进行翻译的一般操作流程 (13)7. 翻译后分析 (14)7.A. 蛋白印迹分析 (15)7.B. 放射性标记物掺入百分比的测定 (16)7.C. 放射性标记翻译产物的变性凝胶分析 (17)7.D. 使用FluoroTect™Green Lys 体外翻译标记系统标记的翻译产物的变性凝胶分析 (18)7.E. 使用Transcend™非放射性翻译检测系统标记翻译产物的变性凝胶分析 (19)8. 阳性对照萤光素酶检测 (20)8.A. 使用发光检测仪 (20)8.B 使用闪烁计数器 (20)9. 疑难解答 (21)10. 参考文献 (22)11. 附录 (24)11.A. 缓冲液和溶液的组成 (24)11.B. 萤光素酶SP6 / T7对照DNA (25)11.C. 相关产品 (27)12. 变更概要................................................................................................................................................................30所有技术文献的英文原版均可在/ protocols 获得。
抗牛胰蛋白酶(TRY)抗体的制备和对杀虫剂抗性的初步检测
结 论 成 功 制备 小 鼠抗 ＴＲ 多 克 隆 ＩＧ 抗 血 清 ， 检 测 蚊 虫 抗 性 是 可 行 的 ， 得 进 一 步 研 究 。 Ｙ ｇ 其 值
关键词 ： 多克 隆 抗 体 ； 蛋 白酶 ； Ｌ Ｓ 胰 Ｅ ｌＡ 中 图分 类 号 ： １４ ３ 文 献 标 识 码 ： Ｒ８ ．１ Ａ
ＡＢ Ｔ Ｓ ＲＡＣ Ｔｏ ｐ ｅ ａ ｅ ｔ ｅ ｐ ｌ ｃｏ ａ ｎ ｉ ｏ ｙ ａ ａｎ ｔｂ ｖｎ ｒ ｐ ｉ （ Ｔ： ｒ ｐ ｒ ｈ ｏ ｙ ｌ ｎ ｌ ｔ ｄ ｇ ｉ ｓ ｏ ｉ ｅ ｔｙ ｓｎ ＴＲＹ）ａ ｄ ｉ ｓ ｏ ｄ ｔ ｃ ｈ ｎ ｅ ｔ ｉ ｅ ｒ ｓｓ — ａ ｂ ｎ ｔ ｕ ｅ ｔ ｅ ｅ ｔ ｔ ｅ ｉ ｓ ｃ ｉ ｄ ｅ ｉｔ ｓ ｃ
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蛋白酶 磷酸酶抑制剂
常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度来源：原创，转载请注明发布时间：2009-10-20 查看次数：21在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。
蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotin in抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，N a3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。
对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。
蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。
溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，+25℃时稳定至少9个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。
p H约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。
用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法
附件1：用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法基本原理：将蛋白样品还原并烷基化后，用胰蛋白酶把蛋白酶解成肽段，然后用液相色谱/质谱仪对其进行分析。
试剂、生产厂家以及产品编号：使用方法：1.取约1毫克的总蛋白样品放入离心管中，加入1毫升6M的Guanidine(配制在100mMNH4HCO3中，PH 8.0)溶液，得到1mg/mL的蛋白溶液。
2.加入20微升1M的DTT到上述离心管中，震荡混合5秒钟。
3.将上述离心管恒温在37℃条件下反应1小时(以还原蛋白中的双硫键)。
4.加入25微升1M新鲜配制在1M NaOH中的Iodoacetic acid，在避光、室温条件下放置30分钟。
5.将以上样品平均注入两个(每个约注入500mL)具有分离10kDa以下蛋白的Centriconfilter，以12000rpm离心50分钟。
6.在以上离心管中分别加入200mL 0.1M的NH4HCO3，并离心30分钟。
多次重复此操作，以使蛋白样品中的Guanidine含量降到0.5M左右。
7.将以上两个离心管滤层上的蛋白样品，分别、多次加入总量约500mL 0.1M的NH4HCO3溶液以完全溶解，并将这些含有蛋白样品的溶液转移到装有20mL的Trypsin试管中，再加入500mL 0.1M的NH4HCO3溶液。
使试管中液体的总量为1000mL，Trypsin约占总量的1/50。
8.将上述试管恒温在37℃水浴中反应16小时。
9.分别吸取上述样品500mL到两个Centricon filter中，以13400rpm离心50分钟。
这样可以除去多余的Trypsin，终止酶切反应。
(为节省时间，这里的过滤步骤可省略)10.将上述两个离心管下部的滤出液收集到一个离心管中，在35℃下真空干燥浓缩60分钟。
此过程有助于NH4HCO3的分解并挥发，降低样品中盐的浓度。
继续干燥浓缩至样品量到100mL左右。
11.加0.1%的甲酸溶液定量到所需要的样品浓度，并注意观察样品溶液是否澄清。
胰蛋白酶（Trypsin）试剂盒说明书（分光光度法）
胰蛋⽩酶（Trypsin）试剂盒说明书（分光光度法）正式测定前务必取2-3个预期差异较⼤的样本做预测定测定意义：胰蛋⽩酶选择性⽔解变性蛋⽩质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是⼀种重要的消化酶。
此外，胰蛋⽩酶还⼴泛应⽤于脓胸、⾎胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产⽣的局部⽔肿、⾎肿及脓肿等的辅助治疗。
测定原理：胰蛋⽩酶催化⽔解TAME的酯键，释放出的游离羧基与反应体系中的氢氧化钠发⽣中和反应，导致溶液的pH值降低，以**红为指⽰剂，测定溶液在555nm处吸收值的变化，可以快速测得胰蛋⽩酶活性数据。
胰蛋⽩酶在⼀定范围内与555nm处吸收值的降低呈良好的线性关系。
组成：产品名称PI007-50T/48S Storage提取液：液体60ml4试剂⼀：液体10ml4试剂⼆：液体10ml4避光试剂三：液体4ml4说明书⼀份⾃备仪器和⽤品：紫外可见分光光度计、1ml玻璃⽐⾊⽫、台式离⼼机、⽔浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏⽔。
粗酶液提取：提取：粗酶液1、组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的⽐例（建议称取约0.1g组织，加⼊1ml提取液）冰浴匀浆，10000g，4离⼼10min，取上清，即粗酶液。
测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长⾄555nm，蒸馏⽔调零。
⼯作液的配制：临⽤前根据⽤量按照试剂⼀（V）：试剂⼆（V）：蒸馏⽔（V）：试剂三（V）=1ml：1ml：5.4ml：0.4ml的⽐例充（注意：现⽤现配，⽤多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有4个空瓶）分混合。
（注意：现⽤现配，⽤多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有3. 吸取25µl样本，加⼊975µl⼯作液，混匀后⽴即测定，记录555nm下1min时的吸光值A1和2min时的吸光值A2。
计算A=A1-A2注意：如果A⼩于0.005，可将反应时间延长到5min。
如果A⼤于0.5，体系迅速变⾊，可将样本⽤提取液稀释后测定（建议稀释10倍），计算公式中乘以相应稀释倍数。
绿豆多肽的制备工艺及抗氧化作用
绿豆多肽的制备工艺及抗氧化作用傅亮;何倩;陈勇;孙颖莺【摘要】以绿豆蛋白为原料,研究碱性蛋白酶酶解剖备绿豆多肽的工艺,以水解度(DH%)为指标,得到酶解最佳条件为:酶与底物比([E]/[S])3.5%,温度55℃,pH值9.0,底物浓度为2%,酶解时间为120 min.抗氧化试验结果表明:绿豆多肽有良好的还原能力,其对羟自由基和超氧阴离子的清除作用的IC50分别是13.96,12.67 mg/mL,抗脂质过氧化能力的IC50为15.77 mg/mL.绿豆多肽在4种抗氧化体系中均表现出较强的抗氧化性.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2010(026)006【总页数】4页(P79-82)【关键词】绿豆;多肽;抗氧化【作者】傅亮;何倩;陈勇;孙颖莺【作者单位】暨南大学食品科学与工程系,广东,广州,510632;暨南大学食品科学与工程系,广东,广州,510632;佛山市广粮饮料食品有限公司,广东,佛山,528137;佛山市广粮饮料食品有限公司,广东,佛山,528137【正文语种】中文绿豆是一种豆科、蝶形花亚科豇豆属植物，富含蛋白质、糖类、多种微量元素和人体必需维生素，其中蛋白质含量高达19.5%～33.1%，是蛋白质的良好来源之一［1］。
而且绿豆蛋白具有良好的起泡性和泡沫稳定性，以及乳化性等功能特性［2～3］。
中国绿豆资源十分丰富。
但大多数生产厂家都侧重于绿豆淀粉的加工生产，而忽略绿豆蛋白的开发［4］。
天然抗氧化肽由于具有很高的安全性和强抗氧化性，在医药、食品等行业的应用中已显示出它的优势，已经成为国内外的研究热点。
目前已通过酶解大豆蛋白、大米蛋白、罗非鱼皮胶原蛋白等各种不同来源的蛋白质得到抗氧化肽［5～8］，但利用绿豆蛋白制备抗氧化肽的研究未见报道。
本试验研究碱性蛋白酶酶解制备绿豆多肽的工艺，通过考察绿豆多肽的体外抗氧化性，为制备绿豆抗氧化肽提供理论和试验基础，同时为开发绿豆蛋白开拓新思路，深化绿豆的综合利用。
应用RFLP特异基因片段检测绿豆成分
应用RFLP特异基因片段检测绿豆成分
刘金华;魏春艳;马立晖
【期刊名称】《植物检疫》
【年(卷),期】2006(20)6
【摘要】通过对绿豆RFLP分子标记图中特异片段序列的扩增,建立了一种利用PCR方法来检测、鉴定绿豆成分的方法。
该方法成功地扩增出了470bp大小的绿豆特异基因片段,通过对大豆、豇豆等其他豆类作物的验证,表明该引物具有较强的特异性,可以用来作为食品中绿豆成分的鉴定基因或绿豆转基因检测中的参照基因。
【总页数】3页(P336-338)
【关键词】绿豆;RFLP;PCR;成分
【作者】刘金华;魏春艳;马立晖
【作者单位】吉林出入境检验检疫局;内蒙古呼伦贝尔市鄂伦春自治旗植保植检站【正文语种】中文
【中图分类】S522
【相关文献】
1.食品中绿豆成分PCR特异性检测方法的建立 [J], 赵仲麟;李瑞歌;秦志扬;王成;王永;袁超;兰青阔
2.肠出血性大肠杆菌O157毒力及黏附相关基因的PCR检测和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析 [J], 丁红雷;毛旭虎;王豪举;邹全明
3.PCR方法扩增种属特异性片段检测牛羊肉成分 [J], 晏华春;马晓燕;刘艳芳;依
明·苏来曼
4.PCR方法扩增种属特异性片段检测猪源成分 [J], 毕道荣;高宏伟;孙敏;梁君妮
5.第Ⅷ凝血因子基因内限制性片段长度多态性(RFLP)的研究及其在甲型血友病基因连锁分析中的应用 [J], 何小平;杜传书;曾瑞萍;安业浩;刘莉莉
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酶底物等色原
um-bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid
1-(苯 2-31-2 胞增殖、
氨酰
药敏检
基)-3,
测等细
4-四氮
胞活性
1819 41
Toluidine blue
唑]-二 (4-甲 氧基 -6-硝 基)苯 磺酸钠
检测
甲苯胺 92-31-
蓝
9
um Chloride.
氯化四 8-9 检测各
Iodonitrotetrazolium chloride
氮唑蓝
种脱氢 酶的电
子受体
1806 MTT 10
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2h-tetrazol 溴化噻 2348-
iumbromide
唑蓝四 71-2
货号 缩写 英文名称
中文名 CAS 号 应用 称
1944 ABTS 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 2,2'- 30931 过氧化
30
diammonium salt
联氨- -67-0 物酶底
双(3-
物，
乙基苯
ELISA，
并噻唑
酶底物等色原
Trinder 反应 此反应首先由 Trinder 于 1969 年提出，故名 Trinder 反应。其原理为被测物质通过酶作用产生的
过氧化氢(H2O2)在 4-氨基替比林(4-AAP)、过氧化物酶(POD)的存在下，使色原物质可生成红色醌亚 胺化合物。最初使用苯酚作生色剂，后来有许多种化合物替代苯酚，使反应的灵敏度得以显著提高。 Trinder 反应构成了葡萄糖、胆固醇、甘油三脂及尿酸等酶法测定的基础。
芝麻林素对皮肤光老化小鼠AQP3表达和Nrf2信号通路活化的影响
芝麻林素对皮肤光老化小鼠AQP3表达和Nrf2信号通路活化的影响韩耕涛;董卓;姚韧辉【期刊名称】《日用化学工业（中英文）》【年(卷),期】2024(54)4【摘要】研究芝麻林素(Sesamolin,SES)对紫外线B(UVB)诱导的皮肤光老化小鼠的影响。
将小鼠随机分为5组(n=12):Control组、UVB组、低剂量SES组(L-SES)、中剂量SES组(M-SES)和高剂量SES组(H-SES)。
其中Control组小鼠不进行UVB照射,其他组小鼠均进行8周UVB照射。
此外,照射当天开始,L-SES组、M-SES组和H-SES组小鼠分别灌胃0.5 mL20,40和80 mg/(kg·d)的芝麻林素溶液,共给药8周。
给药结束后,分别测定各组小鼠的表皮含水量。
通过HE染色评价皮肤组织形态,通过Masson三色染色评价胶原蛋白沉积。
测定皮肤组织中氧化应激指标(SOD、CAT、GSH-Px和MDA)水平。
通过RT-qPCR和Western blotting检测皮肤组织中MMP-1、Collagen I、Nrf2、Keap1、HO-1、AQP3的mRNA或蛋白水平。
结果显示,与UVB组比较,L-SES组、M-SES组和H-SES 组小鼠表皮含水量升高,表皮厚度降低,皮肤病变减轻,胶原纤维排列整齐,胶原密度升高,MMP-1 mRNA和蛋白表达水平降低,Collagen I mRNA和蛋白表达水平升高,SOD、CAT和GSH-Px水平升高,MDA水平降低,Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白相对表达量升高,Keap1 mRNA和蛋白相对表达量降低,AQP3的mRNA和蛋白相对表达量升高(P<0.05)。
表明芝麻林素可剂量依赖性的提高小鼠表皮含水量和抗氧化能力,减轻皮肤损伤,其机制可能与上调AQP3的表达和激活Nrf2信号通路有关。
【总页数】8页(P431-438)【作者】韩耕涛;董卓;姚韧辉【作者单位】唐山职业技术学院医学系【正文语种】中文【中图分类】TQ658【相关文献】1.加味茵陈蒿汤影响Nrf2/HO-1信号通路抗大鼠皮肤光老化作用2.紫草素对肺炎链球菌引起的肺炎小鼠细胞外信号调节激酶/p38丝裂素活化蛋白激酶/核苷酸结合寡聚化结构域样蛋白3信号通路及肺血管通透性的影响3.绞股蓝七叶胆苷XVII对光老化小鼠血清中前列腺素2、环氧酶2水平及皮肤组织中MMP-1表达的影响4.矢车菊素-3-O-葡萄糖苷通过Nrf2/ARE信号通路对蛛网膜下腔出血小鼠血脑屏障完整性影响研究5.紫草素对慢性鼻窦炎小鼠鼻黏膜组织炎症反应及SIRT1/Nrf2信号通路的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用ELISA检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白中卡那霉素残留量
药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 20人促血小板生成素 模拟肽 -Fc 融合蛋白中卡那霉素残留量
常翠云，崔颖，李晓然，齐连权 *
（北京泰德制药股份有限公司生物制品部，北京 100176）
摘要 目的：建立灵敏度更高的 ELISA 方法检测卡那霉素残留量并进行方法学验证，用于重组生物制品的 质量控制。方法：采用直接竞争 ELISA 方法，样品中残留的卡那霉素将和酶标抗原竞争酶标板上预包被的 卡那霉素抗体，用 3，3，5，5- 四甲基联苯胺（TMB）底物显色，样品吸光值与残留卡那霉素的含量成负相关， 用酶标仪进行检测并用 Ridasoft Win 分析软件进行分析。结果：此方法灵敏度高，在 0.2~3.0 ng·mL-1 范围 内 spline 拟合良好，且平行复孔 RSD 小于 10%；方法精密度良好，加标回收率在 80%~120% 之间。应用该 方法对 1 批注射用重组人促血小板生成素模拟肽 -Fc 融合蛋白（简称 TMP-Fc）成品的卡那霉素残留量进 行测定，结果表明，每瓶 TMP-Fc（250 μg）卡那霉素残留量小于 0.2 ng。结论：该方法具有灵敏度高、操作 便捷、检测迅速等特点，可以用于重组生物制品中卡那霉素残留量的质量控制。 关键词：ELISA；卡那霉素；残留量；重组生物制品；质量控制；TMP-Fc
* 通信作者 Tel：13911264110；E-mail：qilianquan@ 第一作者 常翠云 Tel：13717780827；E-mail：changcy2008@ 崔 颖 Tel：13522266832；E-mail：cuiying119@
药物分析杂志
Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis