白蛋白测定与线性范围试验

• 相关系数r——是说明有直线关系的两个变量 间相关关系的密切程度和相关方向的统计指 标。 • 相关系数没有单位，其值-1 ≤r≤ 1。 • |r|越大，两变量的关系越密切。
• 当两变量呈同向变 化时，0＜r＜1，为 正相关；
• r=1为完全正相关。
• 当两变量呈反向变 化 时 ， -1 ＜ r ＜ 0 ， 为负相关；
• 配对样本是指同一样本进行两次测试所获得 的两组数据，或对两个完全相同的样本在不 同条件下进行测试所得的两组数据。
• SPSS13.0操作： 1、录入数据； 2、选择菜单：Analyze > Compare Means >Paried-Sample T Test 3、生成统计结果，查看P“sig.(2-tailde)” （值（P值>0.05，可以认为两种方法的结 果差别无显著性差异；P<0.05，有显著性 差异。）
血清总蛋白（TP）测定 与线性范围试验
邹佳峻
一、双缩脲法测定血清总蛋白（TP） 二、线性范围试验
一、双缩脲法测定血清总蛋白（TP）
1.实验目的：
• 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法
• 熟悉722分光光度计的使用 • 了解TP测定的临床意义
2.实验原理：CO(NH2) 2 + CO(NH2) 2
6.总蛋白测定的临床意义：
（1）血清总蛋白浓度增高见于：
a.蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）； b.血浆浓缩（如呕吐、严重腹泻、高烧）。
（2）血清总蛋白浓度降低见于：
a.蛋白质合成障碍（如肝严重受损）； b.蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病综合 征）； c.营养不良或消耗增加（如低蛋白饮食、严 重结核病、甲亢）； d.血液稀释。
• 回归直线的求法 最小二乘法： 各实测点到直线的纵向 距离的平方和最小。
（二）直线相关
• 直线相关——如果两个随机变量中，一个变 量由小到大变化时，另一个变量也相应地由 小到大(或由大到小)地变化，并且测得两个 变量组成的坐标点在直角坐标系中呈直线趋 势，就称这两个变量存在直线相关关系。
• 可用相关系数r表示。
血清（用蒸馏水稀释，浓度为120g/L）。
• 需用到的公式： C1*V1=C2*V2 • 器材：试管、加样枪、吸量管、722分光光
度计、水浴箱。
4.实验方法：
取试管 31 支，除空白管外， 1~10 号管各做 3 个平行 管，一共有10个浓度。按表三加样：
5.实验结果：
所得数据如实填入表四：
6.注意事项：
• ŷ=a+bx称为Y对X的回归直线方程，相应 的直线称为回归直线。
• a：是回归直线在Y轴上的截距，即X=0时 Y的预测值。 • b：是回归直线的斜率，又称为回归系数。 表示自变量X对因变量Y影响大小的参数， 即当X改变一个单位时，Y的预测值平均改 变|b|个单位。 • 要确定回归直线方程，只要确定截距a与回 归系数b即可。
4、修改小数点和输入标签名称 ：
5、选择“Data View”选项卡 ：
6、输入数据，注意“自变量”和“因变量” 所对应的位置 ：
7、选择“分析”→“回归分析” →“线 性” ： Analyze >Regression >Linear
8、选择自变量（X），因变量（Y）： 将“因变量”选入“Dependent”下框内， “自变量”选入“ Independent” 下框，点击 “OK”
（ 1 ）标本、试剂的加量必须十分准确，应用 加样枪进行加样。
（ 2 ）稀释时，应使测定管系列成为精确的浓 度等差系列。
（ 3 ）质控血清稀释时，要严格规范操作，准 确加样。
（ 4 ）同一浓度应采用三管平行操作，初步判 断测出的吸光度值，若相差超过 0.100 ，应 去掉其中的异常数值后再算平均值。
7.注意事项：
（ 1 ）样品中 TP 含量超过 100.0g/L 则用蒸馏水 稀释后测定，结果乘以稀释倍数。 （ 2 ）黄疸、溶血标本对本法有干扰，故用标 本空白管来消除。 （3）取量要准确，操作要规范。
8.思考题：
（1）氨基酸可以用双缩脲法测定吗？为什么？ （2）结合实验数据分析结果进行讨论，最后得 出本次实验的结论。
缩合
（1）双缩脲反应： H2N-OC-NH-CO-NH2 Cu2+ OH紫红色化合物
+
（2）双缩脲法测定TP的原理
OH蛋白质分子中的肽键 + 铜离子
（-CO-NH-）
Cu2+
紫红色复合物
• 紫色复合物在 540nm 波长有特定的吸收峰， 其颜色的深浅（吸光度）与蛋白质的浓度在 一定范围内成正比。
• 此反应和 2 个尿素分子缩合后生成的双缩脲 2+ 在碱性溶液中与Cu 作用生成紫红色复合物 的反应相似，故称双缩脲反应。
• 相关：表达两个变量之间相互关系的密切程 度和方向。 • 回归：表达两个变量之间的数量关系，已知X 值可以预测Y值。
8.思考与讨论
（1）结合实验数据分析的结果进行讨论，最后 得出本次实验的结论。
（2）线性范围试验在方法学评价中有何作用？
SPSS13.0统计学软件 回归分析步骤
1、SPSS13.0软件的安装：
• 在此情况下，待测物浓度与吸光度的比值为 一常数，直线上任何一点的斜率tanθ都相等， 即 tanθ=A1/C1=A2/C2=A3/C3=……An/Cn =K此处K即为校正常数。

• 在实际工作中并不存在理想的反应曲线，当 被测物浓度过高、仪器处于非理想状态时， 都可导致对 Lambert-Beer 定律的偏离，出 现正偏离和负偏离现象。
二、线性范围试验
1.实验目的：
• 通过线性范围的测定，选择线性段作为该测 定方法的分析范围。 • 掌握线性范围试验的评价及意义。 • 熟悉线性范围试验的具体操作过程。
2.实验原理：
• 在比色分析中，在符合Lambert-Beer定律 的条件下，有色溶液的吸光度与被测物质浓 度成正比。 • 以标准物质浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐 标，可在普通方格纸上绘出一条直线，即剂 量反应曲线或校正曲线。
（一）线性回归
• 在两个具有相关关系的变量的一组数据（X 与 Y）间，通过散点图我们可观察出所有数 据点都分布在一条直线附近，这样的直线可 以画出许多条，而我们希望其中的一条能最 好地反映 X 与 Y 之间的关系，即我们要找出 一条直线，使这条直线“最贴近”已知的数 据点。
• 线性回归 —— 用直线方程表达 X （自变量） 和Y（因变量）之间的数量关系。 • ŷ ：是 y（实测值）的预测值，表示当 x取 值xi=（1， 2，……，n）时， y相应的预 测值为yi。
3.实验材料：
• 试剂：（1）商品双缩脲试剂
（2）自配双缩脲试剂 （3）血清样品 （4）总蛋白标准液（70.0g/L）
• 器材：试管、加样枪、吸量管 、722分光光
度计、水浴箱
4.实验方法：
取5支试管，按下表操作：
另取5支试管，按下表操作：
5.实验结果：
• 参考值：
60~82g/L
• 结合实验数据分析结果进行讨论,用SPSS13.0 分析两组数据间有无统计学意义（配对t检 验）。
• r=-1为完全负相关。
• r=0 为零相关， 表示无直线相关 关系 。
• 决定系数 r² ：反映了回归平方和占总平方和 的比例，其越接近于 1 ，回归直线拟和的效 果越好。 • 拟合度越大，自变量 X 对因变量 Y 的解释程 度越高，自变量引起的变动占总变动的百分 比高，观察点在回归直线附近越密集。
9、生成分析结果 “Regression” 并标注 ：
• 因此，新建立的分析方法，其线性范围尚未 确定时，为较准确地测出该方法符合 Lambert-Beer 定律的浓度范围，我们需要 进行线性范围的测定。
• 线性范围的确定： 要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病 的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机 会。
3.实验材料：
• 试剂：自配双缩脲试剂、TP标准液、质控
（ 5 ）标准溶液和样品溶液的蛋白质浓度均应 超过10mg/mL。
7.数据处理与分析：
（1）用Excel软件制作出浓度C 对吸光度值 A的标准曲线图，求出线性范围。
（ 2）采用 SPSS13.0软件对线性范围内的浓 度 C 与对应吸光度值 A作直线回归分析，求 出回归方程ŷ=a + bx，并求出相关系数（r） 和决定系数（r2）。
（1）运行“SPSS13Eval，点击“下一步”， 直至安装完成； （2）复制“Patch.exe”至SPSS安装文件夹 （默认为C：\Program Files\SPSSEVAL），“运行”→“破 解”。
2、运行SPSS13.0，选择“输入数 据” ：
3、选择“Variable View”选项卡 ：