肋游仆虫ABCE1在蛋白质翻译过程中的作用开题报告
游仆虫第二类肽链释放因子C端功能区解析
游仆虫第二类肽链释放因子C端功能区解析【摘要】：蛋白质合成是细胞内最重要的生命活动之一，这一过程包括核糖体上新生肽链合成的起始、延伸和终止。
蛋白质合成终止需要两类肽链释放因子的参与。
在真核生物中，两类肽链释放因子协同执行蛋白质合成终止的功能。
第一类肽链释放因子eRF1识别终止密码子，水解肽酰-tRNA酯键；第二类肽链释放因子eRF3是一类依赖于核糖体和第一类肽链释放因子的GTPase，第二类肽链释放因子eRF3与第一类肽链释放因子通过相互作用在核糖体外形成复合体，然后结合于核糖体上通过水解GTP促进第一类肽链释放因子的功能。
原生动物八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)是一种单细胞真核生物。
其第一类肽链释放因子识别UAA和UAG，而终止密码子UGA在该生物体中编码半胱氨酸，这说明其蛋白质合成终止过程的特殊性。
目前，在八肋游仆虫中报道有两种第一类肽链释放因子(eRF1a和eRF1b)和一种第二类肽链释放因子(eRF3)。
在八肋游仆虫的eRF1b和eRF3中，各含有三个UGA终止密码子编码有义氨基酸Cysteine，而在eRF1a 中并没有终止密码子编码氨基酸的现象。
本研究围绕八肋游仆虫中第二类肽链释放因子与第一类肽链释放因子相互作用的功能区分析，获得以下主要结果：利用体内酵母双杂交分析和体外pulldown方法对八肋游仆虫两类肽链释放因子的相互作用进行了研究。
在酵母双杂交分析中，构建酵母双杂交重组质粒pGBKT7-eRF1a和pGADT7-eRF3，然后共转化酵母细胞AH109，得到的阳性克隆进一步进行β-半乳糖苷酶活性分析，结果表明八肋游仆虫两类肽链释放因子eRF1a和eRF3能在体内相互作用；在体外pulldown分析中，分别将eRF1α和eRF3基因克隆进表达载体pRSETC和pGEX-6P-1中，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
GST-eRF3表达产物利用GST亲和层析纯化，纯化产物经Westernblotting鉴定为融合蛋白，利用PreScissionProtease 切掉GST标签后，获得目的蛋白eRF3。
八肋游仆虫中心蛋白的研究
八肋游仆虫中心蛋白的研究八肋游仆虫中心蛋白的研究微管组织中心(MTOC)组织真核生物细胞中微管的数量,方向和极性。
MTOC复制缺陷将阻断双极纺锤体的形成,使细胞分裂终止在G2/M期,相反,过量的MTOC又会导致癌症的产生。
MTOC中含有大约150-200种蛋白,中心蛋白(centrin)是其中之一。
中心蛋白是一种约19.5 kDa的酸性钙结合蛋白,属于钙调蛋白超家族。
中心蛋白广泛存在于真核生物中,如藻类、酵母、原生动物、高等植物、哺乳动物等。
这种蛋白的高保守性和在生物界的普遍存在表明它对于正常细胞的功能是必不可少的。
中心蛋白参与了MTOC的复制和分裂,它的突变和缺失会导致细胞的异常分裂。
中心蛋白还在依赖于它的纤维系统的收缩中起重要作用。
原生动物八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)是一种进化上处于特殊地位的单细胞真核生物,这类生物中无典型的中心粒和中心体存在,细胞分裂时纺锤体的微管由核液(Karyolymph)中的微管组成中心形成。
对这类生物的中心蛋白的研究,有助于阐明低等真核生物的细胞分裂、细胞运动等重要生命活动过程的本质。
本研究以八肋游仆虫为材料,克隆了该生物的中心蛋白基因(EoCen)。
序列分析表明,该基因全长690 bp,两端为端粒序列C_4A_4C_4A_4C_4A_4C_4,开放阅读框有507bp,编码168个氨基酸,不含内含子。
将全长和N端截短型中心蛋白基因连入表达载体,构建了两个重组表达质粒pGEX-6p-EoCen和pGEX-6p-EoCenN,在大肠杆菌中获得了高效可溶性表达,经过GST亲和层析和Mono Q离子交换层析两步纯化后,获得了纯度达95%以上的重组游仆虫中心蛋白,每升LB培养液可以得到纯蛋白约10mg左右。
通过凝胶排阻层析分析了游仆虫中心蛋白的聚合特性,发现盐离子对它结构的变化起很重要的作用。
当有盐离子存在时,中心蛋白大部分以拉长的纤维状的单体结构存在,不含盐离子的蛋白随着pH的增高,聚合程度逐步增强。
八助游仆虫中心蛋白性质及功能的研究
八助游仆虫中心蛋白性质及功能的研究【摘要】：生命细胞中存在着一个精密的骨架系统,保证了细胞正常的形态结构与功能,而微管组织中心(microtubuleorganizingcentre,MTOC)充当着细胞骨架总设计师的角色。
不同种属细胞在MTOC的名称上有也有一定的差异。
在哺乳动物细胞中,MTOC被称做中心体,它随细胞周期进行复制、分离,并且在分裂期形成纺锤体的两极,是细胞的动力学中心,中心体是一个高度动态变化的结构。
每一个中心体均包括两个相互垂直的中心粒(centriole)和中心粒周围物质(pericentriolarmaterial,PCM)。
PCM的主要成分是蛋白质,中心蛋白即是其中的一种。
游仆虫中心蛋白是由168个氨基酸组成的单肽链酸性蛋白,属于钙离子结合蛋白家族成员。
它含有四个螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构域,即所谓的EF-hand结构域,每个结构域均可结合一个钙离子。
中心蛋白与钙调蛋白具有高度的序列同源性,其三维结构也可能相类似,整个分子呈哑铃型构象,氨基端和羧基端分别为哑铃的两头,各含两个EF手结构域,中间由一段8个氨基酸残基组成的弹性α-螺旋相连。
本研究利用基因重组技术,在已有八肋游仆虫中心蛋白基因的基础上,构建得到了半分子中心蛋白基因(N-EoCen、SC-EoCen、LC-EoCen)的重组表达质粒和带有突变位点G151W的重组质粒。
分别为①pGEX-6p-N-EoCen、②pGEX-6p-SC-EoCen、③pGEX-6p-LC-EoCen、④pGEX-6p-M-EoCen(G151W)、⑤pGEX-6p-M-SC-EoCen(G151W)、⑥pGEX-6p-M-LC-EoCen(G151W)。
并且将这些重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)BL21中,经IPTG诱导获得了中心蛋白的可融性表达,经GST亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析多步纯化得到了纯度较高的蛋白。
虫类蛋白质与免疫抗体的结构与功能分析
虫类蛋白质与免疫抗体的结构与功能分析在生物学中，蛋白质是最重要的有机分子之一，扮演着许多关键生物学过程中不可或缺的角色，其中包括激素、酶、抗体、结构蛋白等。
虫类蛋白质和免疫抗体作为其中的两种，具有重要的生理学意义。
本文将从虫类蛋白质和免疫抗体的结构与功能等方面进行分析和探讨。
一、虫类蛋白质的结构与功能虫类蛋白质结构主要由α螺旋和β结构组成。
虫类蛋白质分为丝蛋白、角蛋白、胶原蛋白和肌凝蛋白。
丝蛋白存在于丝绸等昆虫的丝绸中，主要有光泽、光滑、均匀等特点。
角蛋白则存在于昆虫的外骨骼（表皮），能够形成类似甲壳的硬结构，扮演着保护昆虫体内器官的作用，另外角蛋白还具有与丝蛋白不同的柔韧、透气等性质。
胶原蛋白存在于许多节肢动物的组织中，如肌肉、骨骼、软骨、皮肤、血管、腱等，是维持这些组织的主要成分。
肌凝蛋白存在于昆虫肌肉中，是构成肌肉纤维的主要成分。
虫类蛋白质的功能主要表现在两个方面，第一个是生物学作用，例如：肌凝蛋白能够通过肌肉收缩机制调节昆虫的运动。
此外，角蛋白可增加外骨骼的硬度和强度，防御来自外部环境的机械冲击、攻击或捕食。
第二个作用是工业技术应用，例如丝蛋白可制作衣物、绸被等，角蛋白可制作人造可分离式手术缝线等。
二、免疫抗体的结构与功能免疫抗体是一种对抗外部入侵的物质，其结构由多种蛋白质组成，形成具有高度变异性的特定结构和功能。
抗体由基础分子（IgM，IgA，IgG，IgE和IgD）组成，基础分子在表现出了在保持某些结构的同时，将某些域暴露在抗原上，从而实现免疫保护效果。
免疫抗体是一种特殊的蛋白质，主要的功能是与外部的抗原结合，防御入侵。
其结构形成了一个Y形，其中最上面的“Y”形部分为抗原结合部位。
抗原在抗体结构中与氨基酸侧链相互作用，使得抗体与抗原结合。
抗体作为免疫系统的主要组成部分，处于抵御感染的前沿。
实验和临床研究表明，通过对免疫系统的信息学探究对抗感染是必要的，而免疫抗体在防范疾病传播或治疗是否有效等方面都有很好的应用性。
八肋游仆虫中编程性翻译移码基因的研究
八肋游仆虫中编程性翻译移码基因的研究编程性翻译移码是指核糖体通过向前移动一个碱基(+1移码)或者向后倒退一个碱基(-1移码)然后继续多肽链合成的现象,这种现象更换了mRNA的翻译读框,发生在蛋白质的合成过程中。
-1位的编程性翻译移码最初发现于逆转录病毒中,后来在细菌以及一些真核生物基因中也陆续发现有此类现象。
现今,在很多种不同的生物中均发现有编程性翻译移码的存在,而游仆虫中发生编程性翻译移码的频率比其他真核生物中明显要高出很多。
我们推测游仆虫中需要通过编程性翻译移码来表达其完整蛋白的基因高达5%甚至更多,它们发生一个或多个+1位的移码从而产生它们的蛋白产物,这个推测是基于对游仆虫属中已知的67个基因的分析得出的。
影响编程性翻译移码的因素有多种,如tRNA、SD相似序列、假结或茎环结构、肽链释放因子等。
本课题组最近对八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)基因组转录组进行了数据分析,预测八肋游仆虫中需要发生编程性翻译移码来产生它们各自的蛋白产物的基因比例高达11.2%,其中编码蛋白激酶类基因居多。
为了进一步探究八肋游仆虫中这些预测到的移码基因的真实性及其是否发生编程性翻译移码现象,本研究利用了在酵母中研究编程性翻译移码的双荧光素酶报告检测体系,同时将报告质粒与杂合肽链释放因子pBF001转入酵母体系,检测移码基因的移码效率。
获得以下主要结果:1、本研究选取编程性翻译移码候选基因酪蛋白激酶CK2进行分析。
CK2是真核生物中普遍存在的非依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞周期,细胞增殖和生长,细胞生存和细胞凋亡中起着至关重要的作用。
八肋游仆虫转录组数据分析显示有七个蛋白激酶CK2编码序列,包括四个α亚基序列和三个β亚基序列。
本研究首先在大核DNA和cDNA中均获得了这七个基因的扩增产物,表明这些基因在八肋游仆虫中是存在的,而且是有转录产物的,将七条序列命名为EoCK2α-1,EoCK2α-2,EoCK2α-3,EoCK2α-4,EoCK2β-1,EoCK2β-2和EoCK2β-3。
蛋白质表达过程中翻译后修饰作用的阐述
蛋白质表达过程中翻译后修饰作用的阐述蛋白质是生物体内最基本的功能分子之一，扮演着许多生命过程中重要的角色。
蛋白质的合成包括转录和翻译两个主要步骤。
在翻译过程中，mRNA的编码信息被转化成具有功能和结构的蛋白质。
然而，翻译仅仅是蛋白质合成的第一步，翻译后修饰则是决定蛋白质功能和结构的重要环节。
翻译后修饰是指蛋白质在翻译完成后，通过一系列的化学反应和修饰酶的作用，调整其结构和功能。
这些修饰可以包括磷酸化、甲基化、乙酰化、酰化和糖基化等不同类型的化学修饰。
下面将详细介绍其中的几种修饰作用。
一、磷酸化修饰磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最常见的一种类型。
磷酸化修饰通过将磷酸基团添加到特定的氨基酸残基上，如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，改变蛋白质的电荷性质和结构，从而影响其功能和相互作用。
磷酸化修饰在细胞信号传导、基因表达调控和细胞凋亡等生物过程中起着重要的调控作用。
二、甲基化修饰甲基化修饰是一种将甲基基团添加到蛋白质氨基酸残基上的修饰方式。
这种修饰通常发生在赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基上。
甲基化修饰可以调节蛋白质的结构和功能，影响其相互作用和定位。
举例来说，组蛋白的甲基化修饰在染色质结构和基因表达调控中起到了重要的作用。
三、乙酰化修饰乙酰化修饰是一种将乙酰基团添加到蛋白质氨基酸残基上的修饰方式。
乙酰化修饰常见于赖氨酸残基上。
乙酰化修饰可以改变蛋白质的电荷性质和结构，影响蛋白质的稳定性、活性和亲和力。
例如，组蛋白在染色质重塑和基因表达调控中的乙酰化修饰是非常重要的。
四、酰化修饰酰化修饰是一种将酰基团（如丁酰、戊酰等）添加到蛋白质氨基酸残基上的修饰方式。
酰化修饰可以调节蛋白质的结构和功能，改变其活性、稳定性和亲和力。
例如，转录因子的酰化修饰可以调控基因的表达水平。
五、糖基化修饰糖基化修饰是指将糖基团添加到蛋白质上的修饰方式。
糖基化修饰通常发生在赖氨酸、赖氨酸和苏氨酸残基上。
糖基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、定位和相互作用。
蛋白质翻译前及后修饰的作用研究
蛋白质翻译前及后修饰的作用研究
蛋白质的前修饰和后修饰是指在蛋白质的合成过程中，或者在蛋白质
合成完成后，对蛋白质分子进行化学修饰或结构调整的过程。
前修饰通常
发生在蛋白质合成的过程中，包括信号肽的剪切和修饰、翻译后修饰等。
而后修饰则通常发生在蛋白质合成完成后，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化等各种化学修饰。
前修饰和后修饰的作用研究对于理解蛋白质的功能和调控机制至关重要。
它们可以影响蛋白质的稳定性、定位、交互作用和活性。
具体来说，
修饰可以改变蛋白质的磷酸化状态，从而调节其活性和信号转导通路的参与；修饰还可以改变蛋白质的糖基化状态，从而影响其在细胞表面的定位
和识别；修饰还可以改变蛋白质的结构和构象，从而影响其与其他分子的
结合和功能。
通过研究蛋白质的前修饰和后修饰，科学家们可以揭示蛋白质的功能
细节和调控机制，为疾病的发生和治疗提供重要线索。
此外，对蛋白质的
修饰还可以为药物设计和生物工程领域提供理论基础和实践指导。
因此，
前修饰和后修饰的作用研究对于生物学和医学领域的发展具有重要意义。
原核生物蛋白质翻译机制的研究
原核生物蛋白质翻译机制的研究原核生物蛋白质翻译机制是生物学研究的重要课题之一。
蛋白质是生物体内最基本的分子之一，它在细胞的生长发育和代谢过程中发挥着至关重要的作用。
如何实现蛋白质的合成，一直是科学家们关注和研究的问题之一。
早在1940年代初期，人们已经开始了蛋白质翻译机制的探索，但直到20世纪50年代，随着新的技术手段的引入，原核生物蛋白质翻译机制才逐渐被揭开了神秘的面纱。
一、原核生物蛋白质翻译的基本原理原核生物蛋白质翻译是指在细菌和古菌等没有细胞核的单细胞生物中进行的蛋白质合成过程。
这个过程包括三个主要的步骤：RNA转录、RNA翻译和蛋白质合成。
其中RNA翻译是决定蛋白质合成效率和质量的关键步骤。
RNA翻译的基本原理是：mRNA从基因中转录出来后，进入细胞质中。
在细胞质中，mRNA被核糖体识别，核糖体在mRNA 的三联密码子和tRNA之间建立氢键，使tRNA上的氨基酸与mRNA匹配。
之后，核糖体在mRNA上移动，将氨基酸一个个加入到正在合成的多肽链中。
一旦一个多肽链完成，它就被释放，开始进行折叠和修饰，最终成为一个完整的蛋白质。
二、原核生物蛋白质翻译的特点原核生物蛋白质翻译具有以下几个特点：（1）原核生物只有一个RNA聚合酶，可以同时合成mRNA、rRNA和tRNA，这使得mRNA的合成和翻译之间的联系更加紧密。
（2）原核生物的基因组蕴含有多个连续的基因，这意味着不同基因的mRNA可以同时转录和翻译，从而提高了蛋白质合成的效率。
（3）原核生物的RNA翻译速度远高于真核生物，这是由于原核生物中的核糖体和tRNA更加紧密地结合，从而减少了tRNA和核糖体之间的搜索时间和空间上的浪费。
（4）原核生物的核糖体小而简单，只含有30S和50S两个亚基，它们的组装和功能机制相对简单，在研究和应用方面都具有一定的优势。
三、原核生物蛋白质翻译的研究进展随着生物学研究的不断深入，科学家们对原核生物蛋白质翻译机制的认识也逐渐扩展。
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ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2008年4月24(4):348～351游仆虫重组核糖体蛋白L11与肽链释放因子的体外相互作用分析王玉瑶, 张志云, 柴宝峰, 梁爱华3(山西大学生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,太原 030006)摘要 核糖体蛋白L11(ribos ome protein L11)是一种高度保守的蛋白质.为研究真核生物的核糖体蛋白L11的功能,从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus )大核基因组中克隆到核糖体蛋白L11基因,构建了重组表达质粒p GEX 26p12L11,通过谷胱甘肽2Sepharose 4B 亲和层析,纯化了重组融合蛋白G ST 2L11.Pull down 分析显示,八肋游仆虫的核糖体蛋白L11与第一类肽链释放因子eRF1a 可以在体外相互作用.这一结果提示,与原核生物一样,低等真核生物的核糖体蛋白L11在肽链终止过程中可能起一定的作用.关键词 游仆虫;核糖体蛋白L11;eRF1a ;相互作用中图分类号 Q26Ribosome Protein L11from Euplotes I nteracts withPolypeptide R elease F actor in vitroW ANG Y u 2Y ao ,ZH ANG Zhi 2Y un ,CH AI Bao 2Feng ,LI ANG Ai 2Hua3(K ey Laboratory o f Chemical Biology and Molecular Engineering o f Ministry o f Education ,Institute o f Biotechnology o f Shanxi Univer sity ,Taiyuan 030006,China )Abstract The ribos ome protein L11gene was is olated from the Euplotes octocarinatus macronuclear DNA ,and cloned into a plasmid p GEX 26p12L11.The G ST fusion protein with L11(G ST 2L11)was expressed in E .coli ,then purified using glutathion 2Sepharose 4B affinity chromatography.G ST pull 2down analysis showed that the recombinant G ST 2L11interacted with the polypeptide chain release factor eRF1a of E .octocarinatus .The result suggested that the recombinant ribos omal protein L11from E .octocarinatus could be functional in translation termination.K ey w ords Euplotes ;ribos ome protein L11;eRF1a ;interaction收稿日期:2007208224;接受日期:2007211227国家自然科学基金(N o.30670282,N o.30470239)资助3联系人 T el :(0351)7018731,E 2mail :aliang @Received :August 24,2007;Accepted :N ovember 27,2007Supported by National Natural Science F oundation of China (N o.30670282,N o.30470239)3C orresponding author T el :(0351)7018731E 2mail :aliang @ 核糖体蛋白L11(ribos ome protein L11)的研究最早是Nierhaus 等[1]在大肠杆菌中进行的.L11蛋白由2个结构域组成,包括N 端结构域(N 2terminal domain ,L112NT D )和C 端结构域(C 2terminal domain ,L112CT D ).L112NT D 中与G TP 结合和水解,发生构象变化的区域称为分子开关区域.它可以通过改变自身的位置和构象靠近蛋白质合成过程中的其它蛋白.在肽链合成终止过程中,L11与2类肽链释放因子相互作用[2～4].原核生物有2种第一类肽链释放因子RF1和RF2,分别识别终止密码子UAG ΠUAA 和UG A ΠUAA.早在1978年,Armstrong 和T ate [5]提出了大肠杆菌核糖体蛋白L11是多肽链终止过程所必需的.随后,T ate 等首次将研究的重点放在核糖体成分对2个肽链释放因子活性的影响上,报道了体外缺失了L11的核糖体会削弱RF1的功能,而增强RF2的活性[6].2002年,Van Dyke 等[7]通过反义RNA 技术和基因敲除的方法,在体内降低L11的活性,探讨L11对肽链释放因子功能的影响.2003年,基于先前的研究结果,Van Dyke和Murg ola[8]报道了肽链释放因子RF1是与L11相互作用,而RF2是与23S rRNA相互作用.紧接着,Bouakaz等[3]又证实了核糖体蛋白L11的N端结构域是细胞中RF1与核糖体两者相互作用所必需的.游仆虫是一类低等的单细胞真核生物,它与高等真核生物不同,却与大肠杆菌一样存在2种第一类肽链释放因子.为进一步研究真核生物的核糖体蛋白L11对翻译终止过程的作用.本研究以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)为材料,克隆到了L11基因,在大肠杆菌中表达、纯化了G ST2L11融合蛋白,并对核糖体蛋白L11与第一类释放因子eRF1a的体外相互作用进行了检测.1 材料与方法111 菌株和质粒八肋游仆虫由本实验室培养;大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)由本实验室保存;质粒pRSET C2 eRF1a由本实验室构建[9];原核表达质粒p GEX26p1为Amersham公司产品.112 试剂和工具酶DNA回收试剂盒(G el Extraction Mini K it)和质粒抽提试剂盒(Plasmid Mini K it)购自上海华舜生物工程有限公司,Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶和限制性内切酶Bam HⅠ和XhoⅠ购于T aK aRa公司, p GE M2T easy Vector SystemⅠ购于Promega公司,PCR 引物合成及序列测定由大连宝生物工程公司承担, Anti2G ST antibody和Anti2His antibody单克隆抗体购自Amersham Biosciences,辣根酶标记的山羊抗鼠IgG (g oat anti rat IgGΠHRP)和DAB(diaminobenzidin)显色液购于北京中山公司.113 核糖体蛋白L11基因的扩增和重组表达质粒的构建全基因扩增策略见Fig.1.根据目前已知的核糖体蛋白L11的保守区,设计兼并性PCR引物,PCR 扩增得到基因片段,测序后设计特异性引物.利用端粒引物和特异性引物扩增基因两侧片段,测序后叠加得到全基因序列.游仆虫大核DNA的制备参照文献[10].以八肋游仆虫大核DNA为模板,分别加入缓冲液、引物、dNTP、Taq聚合酶,其最终体积用ddH2O加至50μl.PCR循环30周期.退火温度根据各对引物组成而定.琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果.所用引物分别为:引物3F:5′2G T N GG N G AR WS N GG N G A23′引物5R:5′2AR NAC NAC RT A RAA RT C23′其中,N为(A+C+G+T),R为(A+G),W为(A+ T),S为(C+G)引物T elo:5′2CCCC AAAACCCC AAAACCCC AAAACC2 3′引物S1:5′2AG CT C G TT TT C CTT G AC T CT23′引物S2:5′2TG C AAA AAG C AA C AA G A23′Fig.1 The PCR w orking strategy of L11gene from Euplotes octocarinatusPCR扩增后的产物经胶回收,Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆到用同样2种酶切的p GEX26p1表达载体中,得到重组表达质粒p GEX26p12L11.114 G ST融合蛋白的表达、纯化和Western印迹分析筛选阳性克隆,挑单菌落接种至5ml LB液体培养基中,37℃条件下,150rΠmin振荡培养过夜,再按2%比例接种到100ml LB液体培养基中,以同样条件培养3～5h至A600=015～017,加入IPTG至终浓度为011mm olΠL,37℃,150rΠmin诱导培养4～6h.诱导后的细菌培养物8000rΠmin离心收集菌体,重悬,超声破碎菌体,离心收集上清.上清用谷胱甘肽2Sepharose4B亲和柱层析,用P BS缓冲液洗柱,还原型谷胱甘肽洗脱液洗脱.表达产物经S DS2PAGE后,采用电转移法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,然后用5%脱脂奶粉封闭.加入G ST抗体,温和振荡,使其与膜上的特异蛋白结合,加入洗液洗膜后加入显色液显色.115 G ST2L11和H is2eRF1a的体外相互作用融合蛋白His2eRF1a的表达由本实验室完成[11].分别将含有G ST2L11和His2eRF1a表达产物的菌体超声破碎,离心收集上清,先将含有融合蛋白G ST2L11的上清与谷胱甘肽2Sepharose4B介质(可以与G ST特异结合)温育,1h后,用P BS缓冲液洗去杂蛋白,然后加入含有融合蛋白His2eRF1a的上清,继续温育1h后,用P BS缓冲液充分洗去杂蛋白,最943第4期王玉瑶等:游仆虫重组核糖体蛋白L11与肽链释放因子的体外相互作用分析 后用还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱结合于介质上的蛋白.将洗脱下的蛋白进行Western 印迹分析,一抗为Anti 2His 抗体,二抗为辣根酶标记的山羊抗鼠IgG.2 结果211 L11基因的克隆、表达和纯化根据Fig 11基因扩增策略,将得到的PCR 片段进行序列分析,去除重叠部分,获得游仆虫L11基因的全序列(G enBank 登陆号:EF061066).该基因编码区为531bp.重组表达质粒p GEX 26p12L11经双酶切鉴定.重组菌E .coli BL21(DE3)Πp GEX 26p12L11经IPTG 诱导,S DS 2PAGE 分析结果表明,在分子量46kD 左右有特异条带,与预测分子量基本相符,大部分为可溶性表达.经谷胱甘肽2Sepharose 4B 亲和柱纯化后,S DS 2PAGE 胶上基本为单一条带(Fig 12,泳道5).用抗G ST 抗体对表达产物G ST 2L11进行Western 印迹分析,在大约46kD 处有一特异反应条带(Fig 13),进一步证明了融合蛋白G ST 2L11的表达. Fig.2 15%SDS 2PAGE analysis of G ST 2L11protein produced in E .coli B L21(DE 3)A fter IPTG induction at 37℃for 4hours ,the expressed and purified fractions were analyzed by 15%S DS 2PAGE.M:M arkers ;1:Cell lysate of E .coli BL21(DE3);2:Cell lysate of E .coli BL21(DE3)Πp GEX 26p1;3:Uninduced cell lysate of E .coli BL21(DE3)Πp GEX 26p12L11;4:Induced cell lysate of E .coli BL21(DE3)Πp GEX 26p12L11;5:Product after purification212 体外相互作用的pull dow n 分析His 2eRF1a 与结合在谷胱甘肽2Sepharose 4B 介质上的G ST 2L11融合蛋白温育后,将洗脱下的蛋白进行Western 印迹分析,结果见Fig 14.泳道3在约50kD [9]处有反应条带,大小与泳道1阳性对照His 2eRF1a 相同,而泳道2阴性对照G ST 2L11没有任何反应,表明2种蛋白在体外能够相互作用.这说明八肋游仆虫同原核生物一样,其肽链释放因子eRF1a 与核糖体蛋白G ST 2L11能在核糖体外发生相互作用.Fig.3 Western blotting analysis of the G ST 2L11Protein sam ples were loaded onto 15%S DS 2PAGE to separate proteins and trans ferred to nylon cellulose membrane.W estern blots were probed with anti 2G ST m onoclonal antibody and then peroxidase 2conjugated g oat anti 2m ouse m onoclonal antibody as the second antibody.Boundantibodies were detected with the DAB.M:PageRuler Prestained Protein Ladder ;1:Cell lysate of E .coli BL21(DE3);2:Cell lyate of E .coli BL21(DE3)Πp GEX 26p1;3:Supernatant of induced cell lysate of E .coli BL21(DE3)Πp GEX 26p12L11Fig.4 Western blotting analysis of pull dow n assayProtein sam ples were loaded onto 15%S DS 2PAGE to separate proteins and trans ferred to nylon cellulose membrane.W estern blots were probed with anti 2his m onoclonal antibody and then peroxidase 2conjugated g oat anti 2m ouse m onoclonal antibody as the second antibody.Boundantibodies were detected with the DAB.M:PageRuler prestained protein ladder ;1:Supernatant of induced cell lysate of E .coli BL21(DE3)ΠpRSETC 2eRF1a ;2:Supernatant of induced cell lysate of E .coli BL21(DE3)Πp GEX 26p12L11;3:Product of pull down assay3 讨论 原核生物的核糖体蛋白L11在蛋白质合成中是必需的.翻译终止过程中,大肠杆菌的L11蛋白与肽链释放因子RF1和RF2的结合位点不同,从而调节2个第一类肽链释放因子识别终止密码的活性.研究表明,L11蛋白的N 端与RF1相互作用对RF1的功能是必需的,L11蛋白N 端缺失的核糖体会抑制RF1识别UAG 终止密码子,从而影响新生肽链的释放,但不影响RF2的功能[3,12].真核生物与原核生物的核糖体蛋白L11的同源性高达90%,核糖体蛋白L11对真核生物肽链释放因子识别终止密码的作用是否与原核生物有相似之处?八肋游仆虫作为纤毛虫的一种,属单细胞真核生物,其进化地位较为原053中国生物化学与分子生物学报24卷始,在这种生物中也存在像原核生物那样有2种第一类释放因子(eRF1a和eRF1b),推测可能分别识别不同的终止密码子[13].那么,这类生物的核糖体蛋白在翻译终止中是否也有同原核生物中那样调节2种第一类肽链释放因子的功能呢?为研究上述问题,获得纯的游仆虫核糖体蛋白L11是关键一步.本研究利用PCR获得了L11的全基因,并实现了该蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化.由于本实验室已经成功构建了表达第一类肽链释放因子eRF1a的重组表达质粒pRSET C2eRF1a,可以通过体外表达得到融合蛋白His2eRF1a,因此,本研究在设计实验时选用表达载体p GEX26p1,该载体在多克隆位点前融合有G ST基因序列,当目的基因被诱导表达时,得到N端融合有G ST的融合蛋白G ST2 L11.本课题组在研究His2eRF1a时发现,eRF1a在大肠杆菌中表达,其表达产物含有包涵体的形式,且亲和层析效率不高[9].因此,本研究选择可以结合G ST 的谷胱甘肽2Sepharose4B作为结合介质,先将G ST2 L11结合于介质上,再将含有His2eRF1a的上清,与已结合在介质上的G ST2L11作pull down实验,研究二者的相互作用.初步结果显示,2个蛋白在体外可以相互作用.迄今为止,尚无关于真核生物核糖体蛋白L11与肽链释放因子相互作用的研究报道,本结果为研究两个蛋白的体内相互作用,进而探讨真核生物核糖体蛋白L11的结构与功能奠定了基础.参考文献(R eferences)[1] Nierhaus K H,M ontejo V.A protein inv olved in the peptidyltrans ferase activity of E scherichia coli ribos omes[J].Proc Natl AcadSci US A,1973,70(7):193121935[2] W imberly B T,G uym on R,M cCutcheon J P,et al.A detailed viewof a ribos omal active site:the structure of the L112RNA com plex[J].Cell,1999,97(4):4912502[3] Bouakaz L,Bouakaz E,Murg ola E J,et al.The role of ribos omalprotein L11in class I release factor2mediated translation term inationand translational accuracy[J].J Biol Chem,2006,281(7):454824556[4] Lee D,W alsh J D,Y u P,et al.The structure of free L11andfunctional dynam ics of L11in free,L112rRNA(58nt)binary andL112rRNA(58nt)2thiostrepton ternary com plexes[J].J M ol Biol,2007,367(4):100721022[5] Armstrong I L,T ate W P.Requirement for the E scherichia coliribos ome protein L11in peptite chain term ination[J].J M ol Biol,1978,120(2):1552166[6] T ate W P,Schulze H,Nierhaus K H.The E scherichia coli ribos omalprotein L11suppresses release factor2but prom otes the release factor1activities in peptide chain term ination[J].J Biol Chem,1983,258(21):12816212820[7] Van Dyke V,Xu W,Murg ola EJ.Lim itation of ribos omal protein L11availability in viv o affects translation term ination[J].J M ol Biol,2002,319(2):3292339[8] Van Dyke N,Murg ola E J.S ite of functional interaction of releasefactor1with the ribos ome[J].J M ol Biol,2003,330(1):9213 [9] 张素平,贺晓静,袁静明,等.游仆虫第一类释放因子基因在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定[J].中国生物化学与分子生物学报(Zhang Su2Ping,He X iao2Jing,Y uan Jing2M ing,et al.Expression,purif ication and identif ication of eRF1a of euplotesoctocarinatus[J].Chin J Biochem M ol Biol),2002,18(1):23226 [10] T an M,Liang A,Brunen2Nieweler C,et al.Programmedtranslational frameshifting is likely required for expressions of genesencoding putative nuclear protein kinases of the ciliate Euplotesoctocarinatus[J].J Eukary ot M icrobiol,2001,48(5):5752582 [11] S ong L,W ang Y Y,Chai B F,et al.C2term inal76am ino acids ofeRF3are not required for the binding of release factor eRF1a fromeuplotes octocarinatus[J].J G enet G enom ics,2007,34(6):4862490 [12] Petry S,Brodersen D E,Murphy F V4th,et al.Crystal structures ofthe ribos ome in com plex with release factors RF1and RF2Bound to acognate stop codon[J].Cell,2005,123(7):125521266[13] Muramatsu T,Heckmann K,K itanaka C,et al.M olecular mechanismof stop codon recognition by eRF1:a w obble hypothesis for peptideanticodons[J].FE BS Lett,2001,488(3):1052109153第4期王玉瑶等:游仆虫重组核糖体蛋白L11与肽链释放因子的体外相互作用分析 。
蛋白质的翻译和修饰
蛋白质的翻译和修饰蛋白质是生物体中重要的分子，在维持细胞结构和功能方面起着关键的作用。
蛋白质的翻译和修饰是指蛋白质从基因信息中转录出的mRNA经过翻译过程后，进一步修饰成最终的功能蛋白质。
这个过程包括翻译过程中的翻译后修饰和在翻译结束后的蛋白质修饰。
下面将介绍蛋白质翻译和修饰的细节。
1. 蛋白质的翻译蛋白质的翻译是将mRNA上的核苷酸序列翻译成氨基酸序列的过程。
这个过程是通过核糖体完成的，核糖体由多个核糖核蛋白组成。
在翻译开始之前，mRNA上的起始密码子（通常为AUG）被辨认并与特定的tRNA结合，这个tRNA上携带着与起始密码子对应的氨基酸甲硫氨酸。
接着，核糖体逐渐移动，将mRNA上的下一个密码子与相应的tRNA结合，并用脱氨酰tRNA的方式将氨基酸串联起来，最终形成蛋白质的链。
2. 翻译后修饰翻译后修饰是指蛋白质在翻译结束后，通过一系列的化学反应和修饰酶的作用，对蛋白质进行化学改变和修饰。
这些修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化等。
这些修饰的目的是为了赋予蛋白质更多的功能和活性，同时还可以调控蛋白质的稳定性、定位和相互作用。
3. 蛋白质修饰方式蛋白质修饰有多种方式，下面介绍一些常见的修饰方式：3.1 磷酸化磷酸化是通过酶催化将磷酸基团连接到蛋白质上的氨基酸残基上。
这个修饰方式可以调控蛋白质的活性、稳定性和相互作用。
磷酸化的氨基酸残基包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
3.2 甲基化甲基化是指通过甲基转移酶将甲基基团连接到蛋白质上的氨基酸残基上。
这个修饰方式可以改变蛋白质的电荷、形状和相互作用，从而影响蛋白质的功能。
3.3 乙酰化乙酰化是指通过酰基转移酶将乙酰基团连接到蛋白质上的赖氨酸残基上。
这个修饰方式可以改变蛋白质的电荷和相互作用，从而调控蛋白质的稳定性和功能。
3.4 糖基化糖基化是指通过糖转移酶将糖基团连接到蛋白质上的羟基或氨基残基上。
这个修饰方式可以改变蛋白质的电荷、稳定性和相互作用。
糖基化的蛋白质通常被称为糖蛋白。
植物蛋白质翻译后修饰及其对植物生长发育的影响研究
植物蛋白质翻译后修饰及其对植物生长发育的影响研究在植物生长发育过程中，蛋白质翻译后的修饰是至关重要的。
这些修饰可以改变蛋白质的功能、位置、稳定性等特性，从而对植物的代谢、生长、发育等方面产生影响。
本文将探讨植物蛋白质翻译后的修饰及其对植物生长发育的影响研究。
1. 磷酸化修饰磷酸化是最常见的蛋白质后翻译修饰之一。
它通常由激酶催化，将磷酸基团添加到蛋白质的亚氨酸、丝氨酸或苏氨酸上。
通过这种方式，蛋白质的电荷、结构和相互作用等方面都可以发生变化，从而影响其功能和相互作用。
例如，激酶CDPK 可以催化蛋白质的钙调神经激酶磷酸化，从而影响其与钙离子的结合和储存。
磷酸化修饰在植物的生长和发育中发挥着重要作用。
例如，ABA受体PYR1的磷酸化可以激活ABA信号传导通路，促进萎缩素的合成和保护植物免受干旱胁迫。
此外，CBF1蛋白的磷酸化可以增强其与DNA的结合，促进低温信号的响应，增加植物在低温环境下的耐受性。
2. 泛素化修饰泛素是一种小分子蛋白，能够与靶蛋白结合并标记其进行降解。
泛素化修饰通过E1、E2和E3等酶的协作完成。
其中，E1激活泛素，E2将泛素转移给靶蛋白，E3则帮助泛素与靶蛋白结合。
泛素化修饰对植物生长发育的影响主要表现在植物的抗逆性和生长节律上。
例如，在植物对胁迫的响应中，泛素化修饰可以调节蛋白的稳定性和活性，从而参与植物的抗病、抗氧化和耐盐性等方面。
此外，在植物生长节律的调控中，泛素化修饰可以影响植物发育的速率和方向，调节植物在不同环境下的适应性和生态性。
3. 糖基化修饰糖基化是指将糖基团连接到蛋白质的氨基酸上。
这种修饰常见于细胞膜上的蛋白质，可以增加蛋白质的稳定性和活性，调节蛋白质与其他分子的相互作用等。
在植物的生长发育中，糖基化修饰也具有重要作用。
例如，糖基化可以在植物细胞壁的合成和重建中发挥作用。
在细胞壁的生长和发育过程中，糖基化修饰可以调节细胞壁的硬度、厚度和稳定性，从而影响植物的机械强度和抗逆性。
蛋白质翻译和细胞分泌机制
蛋白质翻译和细胞分泌机制细胞是生命的基本单位，它们根据自身的遗传信息合成蛋白质，这是维持生命的关键过程之一。
蛋白质翻译是DNA信息通过mRNA转录成蛋白质的过程，而细胞分泌则是将蛋白质从细胞内部运输到细胞外，并随后进行作用的过程。
蛋白质翻译及其机制蛋白质翻译是细胞中最为重要的过程之一，该过程发生在细胞内的核糖体内。
当细胞核内的DNA被转录成mRNA时，mRNA通过核孔运输到细胞质中，此时，核糖体便开始进行蛋白质翻译。
蛋白质的翻译是一种三联体密码子与tRNA互作的过程，tRNA上的氨基酸将与相应的三联体密码子互补结合。
随着mRNA的向前移动，下一个氨基酸被加到氨基酸序列上，并绑定到之前的氨基酸上，这样就形成了一个越来越长的蛋白质链。
在蛋白质翻译的过程中常常伴有一些修饰过程，如剪切，修饰和折叠，从而形成符合功能的蛋白质。
此外，蛋白质翻译也很容易出现错误，这种错误的积累会对细胞的功能产生很大的影响。
细胞分泌及其机制除了在细胞内完成一系列功能外，蛋白质在一些情况下还会被释放到细胞外，此时就需要通过细胞分泌将蛋白质从细胞内部运输到细胞外部。
细胞分泌是一个复杂的过程，通常分为三个步骤：初级分泌、中级分泌和终级分泌。
初级分泌是指蛋白质在合成后往内质网转运的过程，蛋白质被串联成为泛素前物，也是多肽链的一种后转录修饰。
在内质网上，蛋白质发生一系列修饰，如糖基化和成型等，以便蛋白质能够被运输。
经过中级分泌后，蛋白质被运输到高尔基体，并进一步修改。
最终，蛋白质沿着细胞内的转运途径向细胞外运输。
细胞分泌是一个复杂的过程，它受到多种因素的影响，如蛋白质的性质和外部环境的影响等。
细胞分泌不同类型的蛋白质时，机制和过程也不同，但总体来说，它们都是通过一系列分泌途径将蛋白质从细胞内部成功输送到细胞外。
总结蛋白质翻译和细胞分泌是细胞生物学中最为重要的过程之一，这两个过程共同保证了细胞整体功能的正常发挥。
通过对这两个过程的深入研究，人们可以更好地理解细胞的工作原理，从而为许多疾病的治疗和预防提供新的思路。
研究蛋白质翻译后修饰的机制和功能
研究蛋白质翻译后修饰的机制和功能蛋白质翻译后修饰是生物体中广泛存在的一种重要的生物化学过程。
通过对蛋白质进行修饰，可以改变其活性、稳定性、亲水性等性质，从而调节细胞内许多重要的生物学过程。
蛋白质翻译后修饰的机制和功能非常复杂，涉及到一系列酶、底物和信号通路的相互作用。
本论文将对蛋白质翻译后修饰的机制和功能进行综述分析。
1. 引言蛋白质翻译后修饰是指蛋白质在翻译完成后，在氨基酸序列上发生的化学修饰过程。
这种修饰可以改变蛋白质的活性、稳定性、亲水性等性质，从而调节细胞的生物学过程。
蛋白质翻译后修饰在细胞生物学中具有重要的功能，如调节信号传导、维持细胞结构、参与细胞分化等。
本文将从蛋白质翻译后修饰的机制和功能两个方面进行探讨。
2. 蛋白质翻译后修饰的机制蛋白质翻译后修饰的机制非常复杂，涉及到一系列酶、底物和信号通路的相互作用。
常见的蛋白质翻译后修饰方式包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等。
2.1 磷酸化磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰方式，通过酶催化将磷酸基团添加到蛋白质的特定氨基酸残基上。
磷酸化修饰可以引起蛋白质结构和功能的改变，从而调节信号通路的传导和细胞的生物学过程。
2.2 甲基化甲基化是一种通过酶催化将甲基基团添加到蛋白质的特定氨基酸残基上的修饰方式。
甲基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、亲水性和相互作用的能力，从而调节细胞的生物学过程。
2.3 乙酰化乙酰化是一种通过酶催化将乙酰基团添加到蛋白质的特定氨基酸残基上的修饰方式。
乙酰化修饰可以改变蛋白质的电荷状态和结构，从而调节蛋白质的功能。
2.4 泛素化泛素化是一种通过酶催化将小分子泛素（ubiquitin）添加到蛋白质的特定位点上的修饰方式。
泛素化修饰可以促使蛋白质被降解或定向到细胞器中，从而调节细胞的生物学过程。
3. 蛋白质翻译后修饰的功能蛋白质翻译后修饰的功能非常复杂，涉及到细胞的生长、分化、凋亡等多个生物学过程。
3.1 调节信号传导蛋白质翻译后修饰可以调节细胞内外信号的传导。
八肋游仆虫中心蛋白的表达、纯化及光谱性质研究
八肋游仆虫中心蛋白的表达、纯化及光谱性质研究【摘要】：中心蛋白(Centrins)是真核细胞中一种重要的蛋白质，与细胞中纤维的收缩、细胞的分裂等密切相关。
目前，中心蛋白结构与功能的研究依然是细胞生物学研究的热点之一，但国内外关于Centrins的研究多集中在生物功能上，仍没有晶体结构的报道，从溶液结构入手进行结构与功能关系的探讨也很少。
近年来稀土资源的不断开发利用增加了稀土元素进入生命体的途径和机会，这使得稀土元素在生命体中的代谢模式受到普遍重视。
Centrins 是钙结合蛋白家族的成员，含有四个EF-hand结构域，每个结构域可能结合一个Ca~(2+)，所以它可能是稀土离子在生物体内实现其生物效应的载体。
目前国内外尚无关于单细胞低等真核生物-游仆虫中心蛋白基因表达、溶液构象和生物功能等方面的研究报道。
本研究利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术构建了八肋游仆虫中心蛋白基因centrin的重组表达质粒pGEX-6p-1-centrin，并将其转入大肠杆菌(E．coli)BL21中用IPTG诱导，获得centrin的可溶性融合表达。
融合蛋白GST-Centrin菌体裂解液上清经GST亲和层析后用PreScissionProtease(PPase)酶切，酶切产物再经GST亲和层析和HitrapQ阴离子交换层析两步柱层析纯化后，得到纯度较好(90％以上)的Centrin。
纯化后的Centrin先运用GenePro对它的一些参数及性质做了预测，诸如等电点、净电荷量、亲水亲脂性、α-螺旋分布及钙结合区氨基酸序列分布等，以期为后续实验研究起到理论性的指导作用。
预测分析表明：中心蛋白是一个酸性(pI6.5)、小分子量(19664Da)、水溶性(Hydrophobic26.2％)蛋白，它含有四个EF-hand型结构域，每个结构域可能结合一个钙离子，但N-端区和C-端区的钙结合能力可能有差别。
然后通过紫外光谱和荧光光谱的方法探讨了它与金属离子(Ca~(2+)、Tb~(3+))及小肽(Melittin)的相互作用。
原核生物中蛋白质的翻译机制
原核生物中蛋白质的翻译机制蛋白质是生命体中最重要的分子之一，也是生命体所依赖的重要组成部分。
蛋白质在生物体中发挥着诸多的重要作用，如催化酶反应、生理体内信息的传递、质量的支撑等等，它的功能非常的复杂和多样化。
在许多领域，比如药物研发、基因工程、农业和制药等等，对于蛋白质学的研究和理解是非常重要的。
本文就来介绍一下原核生物中蛋白质的翻译机制。
细胞中蛋白质合成的过程是非常复杂的，分为翻译和翻译作用等几个步骤。
翻译是指将RNA转化为蛋白质的过程。
RNA主要有mRNA、tRNA和rRNA三种，其中mRNA主要含有蛋白质合成所需的基因信息，而tRNA和rRNA则是构成蛋白质合成体的重要组成部分。
在蛋白质的合成过程中，mRNA提供了模板信息，tRNA提供了氨基酸，rRNA则是合成机的重要组成部分。
从理论上来说，蛋白质的翻译过程符合中心法则，即由DNA转录为RNA，再由RNA翻译为蛋白质。
然而，在真核生物的细胞中，这个过程相对而言比较复杂，可能需要经过RNA加工等多个步骤。
相比之下，在原核生物中，这个过程比较简单，没有那么多复杂的步骤，更加便于研究。
在原核生物中，蛋白质的翻译过程主要包括四个步骤:启动、延伸、终止和回收。
具体来说，启动是指由一个小而专门化的别的RNA引导核糖体通过寻找mRNA中的翻译起始密码子，找到与其互补的初始tRNA。
延伸是指核糖体在连续三个碱基上进行扫描，从而找到对应的tRNA和氨基酸，从而组装成一个越来越长的蛋白质链。
终止是指核糖体发现一个终止密码子，激发其释放已经合成的多肽链并分散并封闭如何利用是否需要解读广义型密码子的分子机器的终止信号。
回收是指mRNA、tRNA、核糖体等分子的回收再利用。
要注意的是，各种基因的mRNA的长度和起始密码子或终止密码子的位置都不相同。
因此，这有时需要研究员针对性地开发适应不同情况的翻译技术和翻译助剂。
此外，蛋白质翻译的过程还可能受到某些生理和环境因素的影响，如合成抑制剂、温度、营养等等。
八肋游仆虫绿色荧光蛋白(GFP)人工染色体的构建的开题报告
八肋游仆虫绿色荧光蛋白（GFP）人工染色体的构建的开题报告一、研究背景绿色荧光蛋白（GFP）是一种源自于海葵（Aequorea victoria）的蛋白质，具有绿色荧光特性。
由于其荧光性能，GFP已广泛应用于细胞生物学、分子生物学、生物物理学等领域的信号监测和生物成像。
GFP的荧光性质是通过蛋白质内部的三级结构形成的，由肽链中的三个氨基酸序列组成的环形结构是荧光底物。
GFP基因研究者Nobel Prize 服务于1992年、Douglas Prasher和博士Martin Chalfie于2008年也因研究GFP而获得了诺贝尔化学奖。
为了进一步利用GFP的荧光特性，一些研究者开始构建人工染色体来改变其表达或荧光颜色，为此进行了大量的研究。
目前，许多人工染色体载体已被构建出来，用于对GFP基因进行改造。
Wang等人利用Chromosome Transfer Technology（CTT）构建了人工染色体载体，并成功实现了GFP基因的改造和表达。
这种技术可以利用人工染色体的高表达和稳定性来实现对目标基因的高效表达和转录控制。
然而，这种方法的构建复杂，也存在许多其他问题，考虑到这些因素，我们将探究一种较为简单直接的构建方法。
二、研究内容2.1 GFP基因的克隆我们将采用RT-PCR技术，以Aequorea victoria的全长GFP基因为模板，进行基因的扩增和纯化。
由于GFP是广泛研究并且可靠获得的，GFP基因的纯化并不困难。
2.2 人工染色体的构建我们将设计一种基于CRISPR/Cas9技术的简单直接的人工染色体构建方法。
该方法的基本原理是通过使用CRISPR/Cas9技术将GFP基因定向插入靶向poi区域。
我们将使用GFP基因作为poi（point of insertion）标记，同时控制染色体上其它基因的表达。
首先，我们将设计两个针对poi区域的gRNA引物，将它们插入到载体中并进行验证。
接下来，我们将用PCR扩增gRNA序列，并转化到染色体片段中。
生物体内蛋白质翻译及翻译后修饰的研究
生物体内蛋白质翻译及翻译后修饰的研究蛋白质是生物体内最重要的大分子，它们参与了生物体内几乎所有的生命过程，如代谢、信号传导、细胞分裂等等。
然而，蛋白质的生物合成过程是一个十分复杂的过程，包括基因转录、RNA修饰和蛋白质翻译等多个步骤。
其中，蛋白质翻译是指将RNA的信息转化成氨基酸序列的过程，也是最为重要的步骤之一。
蛋白质的生物合成通常以基因的转录开始。
基因是DNA的一部分，而DNA存储了生物体的遗传信息，可以理解为生命中的“基因密码本”。
基因的作用是指导分子进行指定的合成或功能。
当细胞需要合成特定的蛋白质时，这个基因会被转录成RNA，被称为“信使RNA”（mRNA）。
mRNA是一个单链的分子，其核苷酸序列由DNA上序列的信息模板模板复制而来。
通常情况下，一个mRNA分子只包含一个基因的信息，因此mRNA的编码序列只对应一个蛋白质。
在mRNA编码序列被转录出来后，mRNA需要参与到蛋白质翻译的过程中。
蛋白质翻译是指将mRNA中的信息翻译成氨基酸序列的过程。
在该过程中，核糖体起到关键作用，它是由蛋白质和RNA组成的复合体，能够将mRNA上的信息转化为特定的氨基酸序列。
蛋白质翻译的过程可以分为三个主要阶段，包括起始、延伸和终止。
在起始阶段，核糖体会识别mRNA中的起始密码子，将自己与该位点配对，并将一种特定的tRNA带有特定的氨基酸期望到该位点。
在延伸阶段，核糖体会滑动到下一个密码子，并再次配对具有适当氨基酸的tRNA。
在tRNA的辅助下，氨基酸依此添加到氨基酸肽链上，直到遇到一个终止密码子。
在这个阶段，核糖体停止翻译，释放最后的氨基酸肽链。
然而，蛋白质的合成过程并没有结束。
翻译后修饰是指氨基酸肽链在蛋白质合成过程中发生的各种化学修改。
它们可以通过特定的酶来实现。
翻译后修饰包括了种类丰富的过程，如磷酸化、糖基化、去氧核酸化等。
这些修饰可以改变蛋白质的物理性质和机能，影响蛋白质的折叠、稳定性、丝态和相互作用等方面。
游仆虫第一类肽链释放因子N、C结构域的结构与功能分析
游仆虫第一类肽链释放因子N、C结构域的结构与功能分析【摘要】：在蛋白质合成的过程中,当三个终止密码子UAA、UAG或UGA 中的任意一个出现时,蛋白质合成即终止。
终止密码子是由第一类肽链释放因子识别的。
在真核生物中,eRF1可以识别三个终止密码子,并催化新生肽链与位于核糖体P-位点的tRNA之间的酯键水解,释放新生肽链。
随后,eRF3促使eRF1从核糖体上脱离。
绝大多数真核生物只有一种第一类肽链释放因子eRF1,真核生物的eRF1在蛋白质一级结构上极为相似,人的第一类肽链释放因子eRF1在晶体结构和溶液中都包含三个结构域(N,M和C结构域)。
N结构域在核糖体A位点识别终止密码子,M结构域与肽酰转移酶中心相互作用,通过高度保守的GGQ模块对肽酰-tRNA的酯键进行亲核进攻,使酯键水解释放新生肽链,C结构域则是与第二类肽链释放因子eRF3结合的主要区域。
两类肽链释放因子都是终止过程中的关键因子,在终止密码子的识别过程中eRF3与eRF1耦合成为翻译过程的校读因子,并有效地完成新生肽链的释放过程。
有些生物偏离了遗传密码体系称为遗传密码变异生物(variantcodeorganisms),例如：纤毛虫中的游仆虫和赭纤虫都是遗传密码发生变异的生物,使用UAA和UAG作为终止密码子,而将UGA 重新解码为有义密码子,UGA在八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)中被重新解码为半胱氨酸,而在日本赭纤虫(Blepharismajaponicum)中UGA则被重新解码为色氨酸。
遗传密码变异生物的eRF1与标准遗传编码生物(standardcodeorganisms)的eRF1高度同源,而局部的不同可能正是导致功能差异的原因。
这些在标准遗传编码生物中高度保守,而在遗传密码变异生物中保守性降低的模体可能正是密码子识别的关键位点。
与大多数真核生物不同,八肋游仆虫中有两种第一类肽链释放因子,分别为Eo-eRF1a和Eo-eRF1b。
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提取八肋游 仆虫总RNA
反转录cDNA
PCR扩增
Eo-ABCE1基 因
构建Eo-ABCE1 真核表达 Nhomakorabea建立人ABCE1基因的敲减细胞株 测定 RE
建立人ABCE1基因的过表达细胞株
研究内容及路线
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创新之处
• 原生动物ABCE1与蛋白质翻译过程的相关性研究尚未报道； • 本研究将为终止密码子的重新分配现象提供更多的实验数据。
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选题目的
• 克隆Eo-ABCE1基因,分析Eo-ABCE1蛋白的序列特征 • 阐明Eo-ABCE1在蛋白质翻译过程中的调控作用
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选题意义
• 阐明Eo-ABCE1在蛋白质翻译过程中的作用，将有助于更深入地理解低等真核生物蛋白 质合成的调控机制.
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构建Eo-ABCE1 原核表达质粒
纯化蛋白 分析其性质
八肋游仆虫ABCE1 在蛋白质翻译过程中的作用
报告人：洪嫣 指导老师：张志云
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• 研究背景 • 选题目的 • 选题意义 • 研究内容及路线 • 创新之处
主要内容
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研究背景
蛋白质翻译的终止过程主要由两类肽链释放因子介导。酵母中的研究表明，除eRF1和 eRF3外，ABCE1也参与调控翻译的终止。
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