水稻线粒体atpA基因的克隆及其与细胞质雄性不育的关系

缓冲液洗一次，回 收的效果可通过紫外光下检
查负极端胶条中有无 Ｄ Ａ来确定。将上面提 Ｎ 到的 ２０ 含有回收 Ｄ Ａ 的溶液， ５川 Ｎ 用等体积 酚和酚一 氯仿混合液各抽提 一次，乙醇 沉淀， Ｄ Ａ 溶于少量 Ｔ Ｎ Ｅ中， 用微电泳检测， 并估计 Ｄ Ａ 的量， Ｎ 其余部分置 ４ ℃下保存备用。 结 果
码的Ｃ ，， １ ７ 其它几个亚基由核基因编码。 ，Ｉ ４ 水稻是重要的粮食作物，研究 其 线 粒 体 粒体 。ｐ 基因探针为爱丁堡大学 Ｌ ａｅ ｔＡ ｅｖｒ教
授提供， ． ｂ的 Ｈｉｄ ４ｋ ８ ｎＩ Ｉ Ｉ酶切片段中含有完 整的玉米线粒体 ａｐ 基因Ｉ 菠菜叶绿体 ｔＡ ｓ ］ 。 ａｐ 基因探针为我所 １５ ｔＡ ０ 组提供， ． ｋ ２ ５ ４ ｂ的 Ｓｌ ａＩ 酶切片段中含有完整的叶绿体 。ｐ 基 ａＡ 因。克隆所用载体为 ｐＲ ２质粒， Ｂ ３ ２ 受体菌为
用限制性内切酶完全酶解， 以玉米线粒体 。 Ａ基因和菠菜叶绿体 。 Ａ基因做为探针，进行分子杂 ｔ ｐ ｔ ｐ
交， 将保持系线粒体 。 Ａ 基 因定位在 ３５ 的 Ｂｍ 酶 切片段上 ， ｔ ｐ ．ｋ ｂ ａＨ Ｉ 并且以 ｐ Ｒ ２ Ｅ ３２为载体 ， 克隆了
这一片段．另外， ａ Ｈ 在Ｂｍ Ｉ完全酶解谱带的杂交结果中， 不育系线粒体基因组中有两条阳性杂交带， 分 别是３５ ２９ 而保持系线粒体基因组中只有 ３５ ．ｋ ｂ和 ．ｋ， ｂ ．ｋ ｂ一条阳性杂交带， 因而认为水稻不育系线
和水稻细胞质雄性不育分子机制，都是非常有 意义的。本研究首先克隆了水稻线粒体 。ｐ ｔＡ 基因，初步探讨了它在水稻细胞质雄性不育系 和可育系线粒体基因组中的差异。
材料和方法
（ 一）实验材料 实验所用材料为水稻 Ｂ Ｔ型细胞质雄性不
取黄化苗， ０ 一２℃冷冻保存备用。
（ 四）水稻线粒体 ＤＮ 的提取及纯化 Ａ 参照 Ｋ ｍ ｌ８和 Ｃ ａｅ ｅｂ［ ｅ， ｈｓ［ 方法， ２ １ 经修改 用于水稻线粒体 Ｄ Ａ 的提取纯化， Ｎ 详细步骤 可参照我们实验室以前的报道［０ ［ １ ９ １ （ 五）特异 Ｄ ＮＡ 片段的回收 完全酶解后的线粒体 Ｄ Ａ在琼脂糖凝胶 Ｎ 上电泳后，Ｅ Ｂ染色， 在长波紫外光下观察， 切 下含有特异 Ｄ Ａ片段的区域， Ｎ 胶条用 Ｔ Ｅ缓 抖液冲洗数次， ， 装入用半透膜封好的转移槽中， 加人灭菌电泳缓冲液， ０Ｖ电泳 ４ １０ 小时， 结束 电泳前加一个反向电流，然后在转移槽的正极 端吸取最下部的 ２０ ０ ， 溶液， ｕ １ 并再用 ５ ｆ Ｔ ０ Ｅ ＆ １
功能基因如果位于重复顺序的边缘，就有可能 在重复顺序发生重组时受到影响，引起基因结 构的表化， 可育型玉米中。ｐ 基因有两个拷贝， ｔＡ
位于 ６ｋ ７ ｂ质粒状 ＤＮＡ分子上靠近 １ｋ ２ｂ同向
重复顺序的一端， 而三种类型不育型 （ ＭＳＣ Ｃ －， Ｃ －， － ）玉米中，ａｐ 基因只有 １ ＭＳＳ Ｃ Ｔ ＭＳ ｔＡ 个拷贝。研究发现， 不育型玉米的 １ｋ ２ｂ同向重 复顺序至少有部分是缺失的１１３ ５ ，。另外， ＯＩ ，１ １３ ＣＸ 基因［， Ｘ 基 因，１Ｓ ６ Ｃ Ｉ １ Ｏ Ｉ ８ ＮＡ基 因，２Ｓ ｒ Ｒ ６
图 ２ ｔ Ａ 基因在水稻 （ 光 Ｂ ａｐ 秋 ）线 粒休 Ｄ Ａ 限制 Ｎ 性 内切酶谱带上的定位 Ａ Ａ ． ＮＡ ． ｃ Ｒ － Ｈ ｎ Ｉ ； Ｂ ｍ Ｉ消化的水 Ｄ Ｅ ｏ Ｉ ｉｄ Ｂ ａ Ｈ Ｉ － Ｉ ． Ｉ 稻线粒体 ＤＮＡ Ｃ Ｈ ｎ ； ｉｄ川 消化的水稻线粒体 ＤＮＡ； ．
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体 Ｄ Ａ 并进行了琼脂糖凝胶电泳分析。 图 Ｎ，
１ 显示的是水稻线粒体 Ｄ Ａ在 ０ 外 琼脂糖 Ｎ ． ８ 凝胶上的电泳结果。秋光Ａ和秋光 Ｂ 都有 １ 条 主带 Ｄ Ａ分子和三条小的质粒状分子带。秋 Ｎ 光 Ａ较秋光Ｂ多出 １ １ ｋ 条 ９ ｂ左右的质粒状分 子带。将提取的线粒体 Ｄ Ａ用限制性内切酶 Ｎ Ｂ ｍ ａ ＨＩ和 Ｈｉｄ ｎＩ Ｉ Ｉ完全酶解， １ 在 ０ 的琼脂 ％ ｏ 糖凝胶上电泳，Ｅ Ｂ染色后在 ２ｋ 以上的地方 ０ｂ 不存在主带 Ｄ Ａ分子（ Ｎ 如图２ 所示） 。将电泳 后的 Ｄ Ａ分子转移到硝酸纤维素滤膜上，用 Ｎ ３ ２ ｐ标记的 ａｐ 基因探针进行分子杂交。 杂 ｔＡ 交结果显示，在 Ｂ ｍ ａ ＨＩ和 Ｈｉｄ ｎＩ Ｉ Ｉ酶切谱 带中各有 １ 条阳性杂交带，Ｂ ｍ ａ Ｈ Ｉ酶切谱带 中的阳性杂交带略低于 Ｈｉｄ ｎＩ Ｉ Ｉ酶切谱带 中 的阳性杂交带，大小约为 ３ ｋ ． ｂ左右 （ ２． ５ 图 ） 这表明在秋光Ｂ线粒体基 因组 中，含有 １ 个 ａｐ 基因的拷贝， ｔＡ 存在于 Ｂ ｍ 和Ｈｉｄ ａＨ Ｉ ｎＩ Ｉ Ｉ 酶切谱带的 ３ ｋ 左右的片段上。 ．ｂ ５ （ 二）水稻线粒体 ａ ｐ 基因的克隆和 ｔＡ
遗传
２ Ｈ Ｒ ＤＴ Ｓ（ｅ ｎ ） （） Ｅ Ｅ ＩＡ Ｂｉ ｇ １ ４
１ ４ ９ － １９ ０
水 粒 ａＡ基因 克 及 与 胞 稻线 体 ｔ ｐ 的 隆 其 细 质
雄性不育的关系
李 大东 王 斌
（ 中国科学院遗 传研究所 ， 北京）
本研究以水稻 Ｂ 型细 胞质雄性不育 系秋 光Ａ和 相应 的保持系秋 光 Ｂ Ｔ 为材料 ， 取线 粒体 Ｄ Ａ 提 Ｎ ，
ａｐ 基因的结构、 ｔＡ 表达及其在不育系和可育系
中的差异，对全面了解核质间基因的协调表达
大肠杆菌 １９０ ５２
（ 三）材料处理和培养 取水稻种子 １０ ０ 克，用 ３ 多安替福民表面 消毒 １ 分钟， ０ 自来水冲洗 １ 分钟， ０ 再用无菌水
洗涤 ３ －，次。种于铺于无菌水打湿的纱布上， ３ ℃ 黑暗培养，每天换水 ２ ０ －３次，７ －８天剪
为载体， 克隆这些片段， 通过抗菌素筛选得到重
组质粒。
由于受体菌基因组和植物线粒体基因组中 的 ａｐ 基因有一定的同源性， ｔＡ 因此，无法用 菌落杂交方法来进一步筛选含有 。ｐ ｔＡ基因的
克隆。我们用碱裂解法快速提取重组质粒，电 鉴 定， 泳检查质粒的大小，选出含有 ３ ｋ 左右插人 ．ｂ ５ 经 Ｂ ｍ Ｉ完全酶解 的 秋 光 Ｂ线 粒 体 ａ Ｈ 片段的重组质粒，将这些质粒 Ｄ ＮＡ分子总印 ＤＮＡ ，在 １ 的琼脂糖凝胶上， ０ ４ 电泳 外 ６ Ｖ， ℃ 吸附在硝酸纤维滤膜上， ａ 标记的 ａｐ 用Ｓ ｐ ｔＡ基 过夜，Ｅ Ｂ染色后在长波紫外光下切取含有 ３ ． 因探针进行分子杂交，结果如图 ３ Ｘ 胶片上 ５ ， 一 ｋ ｂ左右 Ｄ Ａ 片段的区域，用电转移的方法 显示出阳性杂交点，可初步认为显示阳性杂交 Ｎ 回收其中所含的 Ｄ Ａ片段，以ｐＲ 质粒 反应的质粒 Ｄ Ｎ Ｂ ３２ ２ ＮＡ 分子中含有 。ｐ 基因的 ｔＡ 同源顺序。 将杂交中表现阳 性 反 应 的 质 粒 Ｄ Ａ 分子用 Ｂ ｍ Ｎ ａ ＨＩ消化，电泳后将 Ｄ Ａ Ｎ 片段转移至硝酸纤维素滤膜上，用 ３ ２ ｐ标记 的 ａｐ ｔ Ａ基因探针进行分子杂交， 结果如图 ４ 在 ， ３ ｋ 处显示 ３ ．ｂ ５ 条阳性杂交带， 对应于电泳后的 ３ 条插人 Ｄ Ａ 片段， Ｎ 表明这 ３ 个重组质粒都 含有水稻线粒体 ａｐ 基因。 ｚＡ （ 三）ｕ ｐ 基因在水稻秋光Ａ和秋光Ｂ ｔＡ 线粒体基因组中拷贝数的差异 秋光Ａ和秋光 Ｂ 线粒体 Ｄ Ａ 经 Ｂｍ Ｎ ａ ＨＩ 完全消化， １ 在 多琼脂糖凝胶上电泳过夜，Ｅ Ｂ 图 ３ Ｎ 点 印杂交筛选含有 ａｐ 基因的正组 Ｄ Ａ ｔＡ 染色后将 Ｄ Ａ片段转移至硝酸纤 维素滤膜 Ｎ 质粒 箭头指 示出阳性杂 交点， 可能含有 。 Ａ 基 ｔ ｐ 因的插人片段。 上，ａｐ 基因探针杂交结果如图５ ｔＡ 所示：在
ｒＮ Ｒ Ａ基因， 在某些植物线粒体基因组中 都表
现多拷贝。研究表明，这时它们都和重复顺序 相邻。根据我们的实验结果，在水稻细胞质雄 性不育系线粒体基因组中有两个 。ｐ ｔＡ基因拷 贝，而可育系水稻线粒体 基因组 中只有 １ 个 ａｐ 基因拷贝。这种 。ｐ 基因多拷贝的现 ｔＡ ｔＡ 象很可能是由于线粒体基因组中的重复顺序间 发生重组， 影响到其周围的功能基因而造成的， 这种变化以后在进化中得到固定，这样便使不 育系线粒体基因组中 。 Ａ基因表现为两个拷 ｔ ｐ
Ｂ． ａ Ａ 基因探针杂 交 结 果； 在 水 稻 线 粒 体 ＇Ｃ． ＇ ｔ ｐ Ｂ ｍ 和 Ｈｎ Ｉ 酶切 ａＨ Ｉ ｉｄ Ｉ Ｉ 谱带中 各有 １ 条阳性杂交 带，
分子 量大约为３５ ．ｋ． ｂ
不清楚， 因此将 ａｐ 基因定位在限制性酶切 ｔＡ 图谱上是非常必要的。首先我们提取水稻线粒
粒体基因组 中可能 有两个 。 Ａ 基 因拷 贝，而 相应的保持系线粒体基因组中 只有 一 个 。 Ａ 基 因 拷 ｔ ｐ ｔ ｐ
贝。
关 键词 ：水稻 ， 细胞质 雄性不 育，ａ Ａ 基 因 ｔ ｐ
。此材料 植物线粒体内膜上的 Ａ Ｐ合成酶在能量 育系秋光Ａ及其相应的保持系秋光 Ｂ Ｔ 产物的形成过程中起重要作用。 合成酶由 Ｆ 由北京市农科院作物所洪立芳先生提供。 ， （ 二）ａｐ 墓因探针 ｔＡ 和Ｆ 。两部分构成，Ｆ 是酶蛋白的膜外区域， ： 实验中使用了玉米线粒体 。 Ａ基因探针 ｉ ｐ 具有催化 Ａ ＴＰ合成的功能，由 ５ 个亚基组成 ｔＡ 用两种探针分 （ｑ ， ， ）， ，； 。 ａ ， 丫 “ 。〔】， Ｆ 是酶蛋白的膜内区 和菠菜叶绿体 ａｐ 基因探针， ８ ｑ ，巧， ‘ ］ 得到的结果是一致的， 玉米线 域， 具有质子跨膜传输功能， 至少由４个亚基组 别进行杂交实验， 成（， ８ ９［。在酵母和动物细胞中， ， ６ ７ ， １ ， ）６ １ Ｆ部 分的所有亚基均由核基因编码阴，在高等植物 中则不同，Ａ Ｐ酶 。亚基是由线粒体基因编 Ｔ 一
贝。
在正常可育水稻线粒体基因组中只有 １ 个 ａｐ ｔＡ基因的拷贝， 说明植物线粒体基因组中有 １ 个正常功能的 ａｐ 基因， ｔＡ 植物即可正常生 Ｂ． ａ Ａ 基因 ＇Ｃ． ＇ ｓ ｐ 探针杂 交结果， 秋光Ａ 谱带中 长繁殖。在雄性不育水稻线粒体基因组中有两 有３５６ ． ｂ ．ｋ 和２９ 两条阳 ｋ 性杂交带， 秋光Ｂ 谱带中 个 。ｐ 基因拷贝， ｔＡ 这种变异和细胞质雄性不 只 ３５ 有 ．ｋ ｂ一条阳 性杂交带。 育会有怎样的关系呢？很多人认为细胞质雄性 Ｎ 秋光 Ａ的酶切谱带上有两条阳性杂交带，１ 条 不育是由于线粒体 Ｄ Ａ 分子突变和重组造成 ９１ ，， １ ３ ｋ １ ２ ｋ； ． ｂ，条 ． ｂ而秋光Ｂ线粒体 Ｄ Ａ ５ ９ Ｎ 的酶 的［０那么涉及线粒体编码的功能基因的突变 切谱带中只有 １ ３ ｋ 的阳性杂交带，我们 和重组对雄性不育的形成是不是更有作用？这 条 ． ｂ ５ 认为，由于两系酶切谱带中都有共 同的 ３ ｋ 些问题都有待进一步研究。 ． ｂ ５ 的阳性杂交片段，而且 ３ 条杂交带在Ｘ胶片上 参 考 文 献 表现相同的亮度。 可以认为， 秋光Ａ线粒体基因 组中含有两个 ａｐ 基因拷贝， ｉＡ 比秋光Ｂ基因 ［］ Ｂｕｒ， ，Ｍ． ｉｕｔ Ａ． ｆｅｕ １８． Ｂｏ． 」 ｏｔ Ｍ ｙ Ｂ ｑｅ ｒ ， Ｇ ｆ ： ３ Ｊ ｉ ｏ ａ ９ ． ｌ
Ｌ Ｄ ｄ ｎ ｅ ａ． Ｒｃ ａｐ Ｇ ｎ Ｃ ｏ ｉｇ ｎ ｉ ｏ ｇ ｌ ｉｅ Ａ ｅ ｅ ｌｎｎ ａｄ ａ ｔ ： ｔ Ｒ ｌｔ ｎｈｐ ｔ Ｃ ｔｐａｉ ｃ ａｅ ｒｌ ｙ ｅａｉ ｓｉ ｗ ｈ ｕｏ ｌｓ ｏ ｉ ｍｉ Ｍ ｌ Ｓｅｉ ｔ ｔ ｉ 本文于 １８ 年 ３ ９日收到。 ９， 月
图 ； Ｓｕｈｒ 交签定重组质拉 ｏｔｅｎ杂
Ａ ．ＮＡ・ ｃＲ ＋ Ｈ ｎ Ｉ ； ． ． Ｄ Ｅ ｏＩ ｉｄＩ Ｂ Ｉ －Ｄ 酶切后重组 质粒 ；Ｂ－Ｄ＇ ａｐ 基 因探 针杂交结果 。 三个重 ＇ ． Ａ ｔ 组质粒 中的插人片段都可和 ａｐ 基因探针杂 交， ｓＡ 确证重组片段 中含有 ａｐ 基因。 ｔＡ
（ 一）水稻秋光Ｂ线粒体 。ｐ ｔ Ａ基因在限 制性内切酶图谱上的定位 迄今我们未见有水稻线粒体基因组的物理 图谱， 关于 ａｐ 基因的定位、片段大小还都 ｉＡ
图 １ 水稻线粒体 Ｄ Ａ 电泳结果 Ｎ
Ａ ； ， ＤＮＡ・ ｃ Ｒ 十 Ｈｉｄ ； Ｅ ｏ Ｉ ｎ１ Ｂ １ １ ．秋光 Ａ线粒体 Ｄ ； 秋光 Ｂ ＮＡ Ｃ ． 线粒体 Ｄ ．除 主带 Ｄ ＮＡ ＮＡ分子 外， 秋光 Ａ和秋光 Ｂ线粒体 Ｄ ＮＡ 中都 存在 ３ 低分 条 子量带 （ Ｎ， Ｎ， ，， 秋光 Ａ 粒体 Ｄ Ｎ） 线 ＮＡ 中有 １ 条特异 的 １ｋ 左右低分子量带。 ９ｂ