细菌内毒素检查法的应用进展

欧洲药典于 1987 年、英国药典 1989 年增补本分别收载了 细菌内毒素检查法。1990 年日本药局方增补本也收载了这一方 法。英国药典 1993 年版及增补本（1994～1997）规定细菌内毒素 检查法的品种有 40 多种。 1.2 国内发展简况 在我国，1975～1982 年是鲎试剂的研究阶 段。1988 年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许 4 种药品使用 细菌内毒素法初试[1]。1993 年中国药典 1990 年版第 2 增补本收载 细菌内毒素检查法，但在药典各正文中涉及[2]。1995 年 Chp95二
细菌内毒素检查法有凝胶法、浊度法、显色基质法、免疫学 法。浊度法和显色基质法合称为光度测定法。凝胶法、光度测定 法已收载于中国药典 2005 版二部附录中。 4.1 凝胶法 凝胶法是鲎试验中应用最多最早的一种方法，系 指通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量 内毒素的方法。凝胶法又分为几种：最常用的凝胶-凝块法 （Gel-Clot,亦称试管法），微量玻片法（Microslides）,同位素检测 法 （Raduiusitioes）, 干燥法 （Dry up method） 及微量稀释法
* 作者单位：海南省药品检验所，海南 海口 570216.
中国热带医学 2009 年第 9 卷第 1 期 CHINA TROPICAL MEDICINE Vol . 9 No.1 January 2009
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鲎血细胞内充满细胞浆颗粒，颗粒中含有能被微量细菌内毒素 激活的凝固酶原、凝固蛋白原、B 因子、C 因子等。内毒素激活 C 因子，活化的 C 因子又激活 B 因子（C 因子系统），或由（1-3）βD 葡聚糖激活 G 因子（G 因子系统）；活化的 B 因子或 G 因子再 去激活凝固酶原，使凝固酶原转化成凝固酶，凝固酶切断凝固 蛋白原中特定的精氨肽链，形成凝固蛋白产生凝胶。凝固酶还 对鲎三肽有酰氨酶活性，使硝基苯胺（PNA）游离，而产生成色 反应。
郑霞，赵毓梅
摘要：目的 介绍细菌内毒素检查法的发展简况、作用原理和方法特性及其在药物热原检查方面的研究、应用和进 展。 方法 查阅相关文献 ,并进行综合、分析和归纳。 结果 细菌内毒素检查法 ,正因其较家兔热原检查法快捷、准 确、简便、经济等优点在国内外得到日益广泛的应用。我国细菌内毒素定量法的应用和国际间比还存在一定差距。 结 论 必须加强对细菌内毒素检查法及鲎试剂的研究 ,使之更加专一性。
细菌内毒素检查法已被广泛用于临床、制药、药检等领域。 在临床应用中可以作为辅助诊断，细菌内毒素检查法的敏感性 和特异性较高，对诊断革兰阴性菌所致的败血症、内毒素血症、 泌尿系统及中枢神经系统感染均有一定意义，可用该法检查患 者血液、脑脊液、尿液、腹水、子宫颈渗出液等体液中的革兰阴 性菌所产生的内毒素含量[12]。由于内毒素是革兰阴性菌细胞壁 的成分，而革兰阳性菌无此成分，因此该法可做为鉴别 2 种细 菌感染的方法，但目前这方面的实验报导较少。应用在药生产 过程质控中，细菌内毒素检查法较之家兔热原法有灵敏、准确、 快速、重现好、以及多样化、微量化的特点，可使（下转第 20 页）
部附录规定注射用水等 5 种药品用细菌内毒素检查法取代热 原检查。2000 年 Chp2000 二部规定细菌内毒素检查法的品种有 47 种[3]，并且增加了细菌内毒素检查法应用指导原则。2005 年 Chp2005 二部规定细菌内毒素检查法的品种有 120 种[4]，同时检 查法中增加了定量测定法中的浊度法和显色基质法。 2 细菌内毒素 2.1 细菌内毒素的化学结构 细菌内毒素一般由革兰阴性菌 （GNB）产生，是细菌胞体的组成部分，是 GNB 细胞壁的最外层 结构的一部分脂多糖（LPS），它由多糖 O 抗原、核心多糖和脂质 A 三部分组成。脂质 A 是内毒素生物活性的主要成份[5]。内毒素 既含有亲水的多糖链，又含有疏水的脂肪酸链，因此决定了内 毒素在水溶液中有自然聚集成团的特性。疏水的脂质 A（活性 成份）包于聚集团的内部或吸附在玻璃器皿内壁，因此在进行 鲎试验时，内毒素的溶解和稀释都要强烈振荡。 2.2 细菌内毒素的生物活性 细菌内毒素的生物活性在机体 水平表现为发热性、致死毒性、体重减轻、白细胞及血小板减少 等；在细胞水平表现为巨噬细胞的活化性（TNF，IL-1，IL-6），阻 止巨噬细胞游走、前列腺素的产生的抗肿瘤坏死作用等[6]；内毒 素能激活凝固酶系统，使糖、脂类代谢发生变化，激活补体，改 变血液流动状态，导致血小板聚集，释放血管活性肽，诱导释放 血管的凝固蛋白，造成休克最终死亡等病理生理变化。 2.3 细菌内毒素和热原 早期医生发现病人在输液治疗时，有些 病人伴随有发热的反应，这种反应通常发生在注射后 30min~2h 内，症状是持续的寒战和高热。以后的研究表明输液引起的致 热反应是由内毒素引起的。 3 鲎试剂特性及其与内毒素反应的作用机理 3.1 鲎试剂 细菌内毒素检查中最重要的试剂是鲎试剂，鲎试 剂是鲎科动物血细胞（即变形细胞）溶解物的冷冻干燥品。鲎血 中仅含有一种参与循环的血细胞，称为变形细胞。用于制备鲎 试剂的只有美洲鲎和东方鲎两种。 3.2 鲎试剂的作用机理 关于鲎血变形细胞裂解液反应机理 研究，直到 20 世纪 70 年代后期才由日本学者岩永氏所阐明[7]。
（Microdilution plates）等。大多数的鲎试验是采用试管法，因为 该法操作简单、经济，不需专用测定设备，可在 0.03EU/ml 的范 围内进行半定量。
4.2 浊度法 [8（] turbidimeric method） 系利用检测鲎试剂与内
毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。此操作 比较简单、经济,灵敏度较高,检测范围较大 (0.006～300EU/mL)。 根据原理，可分为终点浊度法(Endopoint turbidimetric method) 和动态浊度法(Kinetic turbidimeric method )。终点浊度法是依 据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光 度或透光率） 之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。 动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸 光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的。本方法因 有配套仪器而较为广泛应用于药物检测及临床。 4.3 显色基质法 根据被测内毒素激活的凝固酶水解外加鲎 三肽 (如:BOC2LEU2GLY2ARG2PNA)等中的精氨酸肽链，释放 出黄色的对硝基苯胺 (PNA),用冰醋酸终止反应进行吸光度测 定，或用游离的 PNA 和偶氮试剂反应，最终形成红色偶氮蓝复 合物而进行检测的一种方法。也分为终点显色法和动态显色 法。此法操作较复杂，但灵敏度和精密度都较高，通常 0.006～ 15EU/mL 的范围内进行定量。目前主要用在血液、体液中的微 量内毒素测定方面。 4.4 免疫学法 4.4.1 火箭免疫电泳鲎试验法 （TAL-RIE）[9] 丹麦的雷夫、贝 克等发明的将火箭电泳与鲎试验结合用于临床内毒素血症的 定量检测内毒素，我国林柏溪等人将鲎血中形成凝胶的凝固蛋 白原纯化，并将其免疫家兔产生抗血清，用火箭免疫电泳法测 定鲎试剂与内毒素反应后凝固蛋白原残存量，根据此残存凝固 蛋白的量与参加反应的内毒素量呈负相关关系，建立了火箭免 疫电泳鲎试验法 4.4.2 酶联免疫吸附测定法[10] ( LAL-ELISA) 该法是将鲎试 验酶联免疫测定法结合的一种定量测定内毒素的方法，基本原 理是用酶联免疫吸附的方法以抗凝固酶原的单克隆抗体，测定 经鲎试验后样本中残存的凝固酶原量，可以得到一个内毒素浓 度与吸附呈反比的曲线，通过标准曲线可以测得样品毒素的 量。该法操作简便，灵敏度高，可达 0.1pg/mL，重复强，样品需要 量少，只需 0.01mL，且受样本影响少。另外，有利用内毒素作为 外源性致热原的生物学活性，通过对内毒素刺激巨噬细胞后产 生的内源性致热原如(TNF、IL21 等)进行检测，从而对内毒素进 行定量检测[11]。 5 细菌内毒素检查法的应用
关键词：细菌内毒素检查法；作用机理；鲎试剂的特异性 中图分类号：R-33 文献标识码：B 文章编号：1009-9727（2009）1-170-02
热原系指一切可以引起人体及动物发热反应的物质。细菌 内毒素是一种与革兰阴性菌细胞壁相关的热原物质，是至今发 现在水溶液中最普遍的热原。药品注射剂中的热原检查是药品 安全性的重要检验项目之一，自 1942 年美国首先将家兔法作 为药品的热原检查之后，这项检查对保障药品的安全性方面发 挥了重要作用。随着制药工业迅速发展、新药品种的不断增加， 家兔法的的局限性日益突出（如放射性药品、抗肿瘤药物等药 物本身药理作用干扰家兔升温试验）。20 世纪 60 年代创建了微 量细菌内毒素的鲎血细胞溶解物检测法（简称鲎试验法），并应 用于药品和生物制品的热原检测。下面就细菌内毒素检查的相 关问题进行综述。 1 细菌内毒素检查法国内外发展简况 1.1 国外发展简况 1968 年 Liven J.和 Bang F.建立了鲎试验 法。1973 年美国 FDA 制定了鲎试验准则，阐明“鲎试剂是一种 检测细菌内毒素的灵敏指示剂。1980 年美国 FDA 发布用鲎试 剂检查人用和兽用注射剂成品内毒素的准则。同年美国药典 20 版收载了细菌内毒素检查法，但在药典各正文中未涉及。1984 年美国药典增补本中，修订了该检查原检查。美国 药典 22 版第五增补本规定 185 种药品以细菌内毒素检查取代 热原检查。美国药典 23 版 1 至 7 增补本采用细菌内毒素检查 法的品种已达 620 余种，保留热原检查的品种仅约 30 种，同时 除了经典的凝胶外，还收载了动态浊度法、动态显色法、终点显 色法。
内毒素
C 因子 活化 C 因子
（1-3）β-D-Glucan
B 因子 活化 B 因子 活化 G 因子 G 因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白原 凝固蛋白 鲎三肽 PAN（黄色）
凝胶 3.3 鲎试剂的特异性 鲎试剂的特异性是指鲎试剂是否存在 对内毒素以外的其他物质的凝集反应。 3.3.1 假阳性 从鲎试剂反应机理可以看出，（1-3）β-D 葡聚 糖可以激活 G 因子，活化的 G 因子激活凝固酶造成假阳性。也 有报导胰蛋白酶、凝血酶、多核苷酸等与鲎试剂发生凝聚反应， 但这些物质产生凝聚反应所需的量要比内毒素的量高得多，而 一般这些物质很难混入至制药工艺流程中。日本学者羽田允报 导[5]，（1-3）β-D 葡聚糖使鲎试剂凝聚的量要比内毒素高出 100 倍，日本推出第二代无 G 因子的鲎试剂，旨在消除（1-3）β-D 葡 聚糖因素的干扰，以及无 C、B 因子的鲎试剂，专门用来测定（1-3） β-D 葡聚糖（在霉菌细胞壁普遍存在），我国也开发出这种特异 性试剂，但这种试剂比普通试剂昂贵，一般没有普遍的实用价 值。 3.3.2 假阴性 鲎试剂的凝聚反应是在二价阳离子参与下的 酶反应系统。一切干扰反应的因素均会干扰凝胶的形成。干扰 反应的物质有：血清中的某种凝血因子、多数中药成分、生化药 品、抗生素、可使蛋白质变性的物质、高糖溶液、络合物等。此外 样品的 pH、反应温度等也存在一定的影响。因此，当测定一种新 的样品之前，必须先做该品种细菌内毒素检查的干扰试验，以证 实样品本身是否存在干扰凝聚反应的因素。通过干扰试验即可 确定样品或处理后的样品是否可以用鲎试剂检查其内毒素。为 了排除干扰因素，可对样品进行处理，处理方法有加热法、调节 pH 值、稀释样品、化学试剂处理等，最简单有效的方法是稀释。 4 细菌内毒素检查的方法