蛋白质提取及纯化

蛋白质提取及纯化

提取蛋白质的当天早晨去后把高速离心机和超高速离心机都打开冷却

1、前一天晚上用Resuspension Buffer重悬4L菌体，然后离心于4C保存，第

二天使用。

2、用少量预冷的Resuspension Buffer重悬细菌，1 protease inhibitor

tablets(EDTA Free)，1mM PMSF, 然后用玻璃Homogenizer做均一化处理，将总体积调至80ml；

3、High Pressure Homogenizer破壁，特别注意样品一定要在不加压力的情况

下运行一个循环（2min）；然后1200bar，6min三个循环，整个过程冰水冷却；

4、DNaseI处理：加入2.5mg DNaseI，10mM MgCl2, 室温处理30min；

5、 11.000rpm，4℃，15min; then 11.000rpm，4℃，15min；

6、 1mM PMSF, 45.000rpm，4℃，90min;

7、用Resuspension Buffer洗两次以除去可溶性的蛋白质，然后预热分光光度

计；

8、用3-4ml Binding Buffer重悬Membrane pellets，动作一定要轻缓，重悬

后的总体积不超过8ml，取出300ul测定OD800和OD850(以OD850为准),测定时候是逐步稀释，每次吸光值小于1；

9、调整OD850≤30-50，在缓慢搅拌（速度一定要慢）的情况下逐滴加入30%的

LDAO使其终浓度达到0.5%，1mM PMSF，26℃黑暗条件下重悬1h，期间注意观察颜色变化；

10、45.000rpm, 4℃, 30min，注意观察颜色的变化以及沉淀是否发生明显的变化。

Charge and Equilibrate Resin

(1)用蒸馏水冲洗柱子以除去20%酒精，注意不要用buffer，1ml/min，至紫外

吸收和电导稳定；

(2)用0.1M NiSO4 Charge Resin，1ml/min，10倍柱体积，尽量使得紫外吸收

和电导稳定；

(3)用蒸馏水冲洗，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定；

(4)用binding buffer洗柱子，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定；

9、收集上清，0.22um滤膜过滤，取出200ul总蛋白分装保存，

10、上样：0.5ml /min （循环上样2次）；

11、洗脱：先用binding buffer，流速1ml/min；然后用Wash Buffer，1ml/min，最大限度地去除杂蛋白，最后用Elute Buffer洗目的蛋白，1ml/min。

12、超滤：一半直接超滤后用重悬binding buffer重悬，液氮速冻后-80C保存

13、strip buffer螯合，20%酒精，4C放置。

Buffer

（1）R esuspension Buffer: 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl, pass through 0.45um filter

（2）B inding Buffer: 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl,

10mM Imidazole, 0.1% LDAO

（3）W ash Buffer: 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl,

20mM Imidazole, 0.1% LDAO

（4）E lution Buffer: 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl,

500mM Imidazole, 0.1% LDAO

（5）C harge Buffer : 0.1M NiSO4

（6）S trip Buffer : 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl,

50mM EDTA

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