蛋白质提取及纯化

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蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。

由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。

蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。

蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。

在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。

离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。

这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。

凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。

通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。

电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。

最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。

层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。

常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。

凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。

在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。

首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。

其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。

然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。

最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。

提蛋白质的原理及步骤

蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。

常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。

裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。

2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。

3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。

这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。

提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。

蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。

通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。

虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。

蛋白质提取的方法和原理

蛋白质提取的方法和原理蛋白质提取是生物化学研究中一项非常重要的工作，它是通过化学或物理方法将目标蛋白质从混合物中提取出来，并获得纯度较高的蛋白样品。

蛋白质提取的方法和原理可以根据不同的需求和样本特点而有所区别，下面我将从样品处理、细胞破碎、蛋白质分离、纯化等方面详细介绍蛋白质提取的常用方法和原理。

一、样品处理样品的类型有很多，包括动物组织、细胞、血液等，每种样品的提取方法都有一定差异。

一般来说，细胞或组织样本在提取之前需要冷冻保存，并进行快速破碎以避免蛋白质降解。

对于血液样本，需要血样离心分离血浆或红细胞，再进行提取。

二、细胞破碎细胞破碎是蛋白质提取的关键步骤，目的是破坏细胞膜和细胞器，并释放蛋白质。

常见的细胞破碎方法有机械破碎、超声波破碎和化学法。

1. 机械破碎机械破碎是最常用的细胞破碎方法之一，可以通过碾磨、研磨、切割等方式破坏细胞。

例如，将样品置于液氮中冷冻后，使用研钵和研杵进行研磨，将细胞研磨成粉末状。

2. 超声波破碎超声波破碎是利用高频高能量的超声波震荡来破碎细胞，通常是在冷冻样品和显微量水中进行。

超声波的震荡可以高效破坏细胞和细胞器，并释放蛋白质。

3. 化学法化学法通常是通过加入化学试剂来破坏细胞。

例如，使用洗涤剂（如SDS、Triton X-100）可以溶解细胞膜，释放细胞内的蛋白质。

三、蛋白质分离蛋白质提取后，需要对蛋白质进行分离，去除杂质和其他成分。

1. 离心离心是最常用的蛋白质分离方法之一，通过不同速度的离心来分离蛋白质。

一般来说，较重的细胞碎片、细胞器和沉淀物会沉积在离心管的底部，而较轻的蛋白质上清液则在上方。

2. 电泳电泳是利用电场将带电蛋白质分离的技术。

常见的电泳方法有SDS-PAGE和凝胶过滤层析等。

SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小和电荷来分离，凝胶过滤层析则可以根据蛋白质的分子量和渗透性进行分离。

四、蛋白质纯化蛋白质分离后，还需要进行纯化以获得较高纯度的蛋白样品。

蛋白质分离纯化原理

蛋白质分离纯化原理
蛋白质分离纯化的原理主要基于其在溶液中的物理化学性质的差异。

以下是几种常见的蛋白质分离纯化方法及其原理：
1. 溶液pH调节：许多蛋白质在不同pH值下的带电性质不同，可以利用溶液pH的调节来使具有不同电荷的蛋白质发生电离，从而实现分离纯化。

例如，利用离子交换层析法，可以根据蛋白质的带电性质来选择性地吸附和洗脱目标蛋白质。

2. 亲和层析法：某些蛋白质具有与特定小分子结合的能力，可以利用这种亲和性质来实现蛋白质的分离纯化。

常见的亲和层析包括亲和吸附、亲和洗脱和竞争洗脱等步骤。

例如，利用亲和层析柱上特异性结合靶蛋白质的配体，可以选择性地富集和纯化目标蛋白质。

3. 分子量筛选：利用蛋白质的分子量差异进行分离纯化。

常见的方法包括凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography）和凝胶电泳（Gel electrophoresis）。

在凝胶过滤层析中，根据蛋白
质的分子量大小，通过孔径大小不同的凝胶来分离不同大小的蛋白质。

而在凝胶电泳中，蛋白质会受到电场的作用而迁移，根据蛋白质在凝胶中的迁移速率和电荷大小来分离不同的蛋白质。

4. 溶剂萃取：利用不同溶剂对蛋白质的亲水性和亲油性差异进行分离的方法。

例如，利用氯仿和甲醇的溶解性差异，可以将蛋白质从溶液中提取至有机相中。

5. 冷沉淀：利用低温和高盐浓度的方法使蛋白质从溶液中沉淀出来。

具有固定温度和浓度阈值的蛋白质会在特定条件下沉淀而分离纯化。

蛋白质的分离、纯化

胰岛素的分离纯化
胰岛素是一种由胰腺分泌的激素，具有降低血糖的作用。胰岛素的分离纯化通常采用离子交换色谱
和结晶法。
胰岛素的分离纯化对于治疗糖尿病具有重要意义。纯化的胰岛素可以用于注射，帮助糖尿病患者
控制血糖水平。
在胰岛素的分离纯化过程中，需要特别注意避免蛋白质的聚集和变性，以确保产品的安全性和有
利用半透膜，根据不同物质之间的分子大小和形状差异进行分离。
色谱分离
利用不同物质在固定相和流动相之间的吸附、分配等作用力差异进行分离。
蛋白质的纯度鉴定
化学分析
电泳分析
利用蛋白质中的特定化学基团进行定量分析，如测定氨基酸组成和序列、测定肽键等。
利用不同蛋白质在电场中的迁移率差异进行分离，再通过染色或放射自显影等技术进行检测。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低水的介电常数，使蛋白质发生沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮等。
离心法
高速离心法
利用高速旋转产生的离心力使溶液中的悬浮颗粒沉降，从而实现蛋白质的分离。
超速离心法
在高速离心的基础上，利用密度梯度离心技术，将不同密度的蛋白质进行分离。
膜分离法
微滤
利用微孔滤膜，将溶液中的悬浮颗粒和微生物截留，从而实现蛋白质的分离。
蛋白质在水中的溶解度受pH、离子强度、温度等因素影响。不同蛋白质具有不同的溶解度。
蛋白质的分离纯化方法
沉淀法
利用蛋白质的溶解度差异，通过改变某些条件（如pH、离子强度、温度等）使蛋白质沉淀析出。
离心分离
利用离心机的高速旋转产生的离心力，根据不同物质之间的密度和沉降系数差异进行分离。
膜分离
血红蛋白的分离纯化通常采用色谱技术，如凝胶过滤色谱和离子交换色谱。这些技术可以根据蛋白质的大小、电荷和疏水性等性质进行分离。

分离提纯蛋白质的方法

分离提纯蛋白质的方法
分离和提纯蛋白质是生物学和生物化学研究中常见的技术方法，其目的是获得纯度高、结构完整的蛋白质样品，以便进行结构和功能研究。

下面介绍几种常见的蛋白质分离和纯化方法：
1. 离心分离法：利用离心力将不同密度的蛋白质分离开来。

该方法适用于分离不同分子量的蛋白质。

2. 溶液层析法：利用化学亲和性或物理特性将蛋白质分离开来。

常见的溶液层析法有离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。

3. 电泳法：将蛋白质样品置于电场中，根据蛋白质的电荷、分子量或等电点等特性，将蛋白质分离开来。

4. 超滤法：利用超滤膜的筛选作用将不同分子量的蛋白质分离开来。

该方法适用于提纯分子量较小的蛋白质。

5. 氯仿法：利用氯仿的亲油性和蛋白质的亲水性差异，将蛋白质从混合物中提取出来。

6. 水相萃取法：利用蛋白质在水相和有机相中亲和性不同，将蛋白质从混合物中萃取出来。

以上是常见的蛋白质分离和提纯方法，不同的方法适用于不同种类和不同性质的蛋白质。

在实际操作中，需要根据样品的特点选择合适的方法进行分离和提纯。

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蛋白纯化方法大全

蛋白纯化方法大全蛋白纯化的技术很复杂，以下就会大家熟知蛋白纯化步骤。

那为什么蛋白质要纯化呢，去掉蛋白质含有的一些杂质与其他蛋白质一起沉淀。

那么又要去除蛋白质的杂质又要保证蛋白质的营养不被流失，于是就要制作不同的方案来应对，称为蛋白纯化技术。

根据蛋白的相似度和差异去除蛋白中的杂质!1、粗分级分离当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。

一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。

这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。

有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。

2样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。

进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。

必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。

用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。

3结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。

尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。

结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。

由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。

41.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。

常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。

这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

以上就是蛋白纯化的步骤，给大家了解一下。

这项技术目前在国内越来越先进，去除蛋白中的杂质让蛋白更纯粹。

蛋白质的提取与纯化

蛋白质的提取与纯化一，蛋白质的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。

提取的温度要视有效成份性质而定。

一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。

但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。

为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。

用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。

同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。

升浓度为宜。

缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。

但必须在低温下操作。

丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。

分离纯化的基本步骤

蛋白质分离纯化的基本步骤蛋白质分离纯化分为四个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎(二)蛋白质的抽提（三）蛋白质粗制品的获得（四）样品的进一步分离纯化。

蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。

（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。

常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。

这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。

在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。

被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。

能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理
蛋白质纯化是生物分子的一项重要技术，它是分子生物学的核心技术之一，也是蛋白质结构及功能的研究的基础。

它可以从生物样本中分离出蛋白质，研究其结构、性质、功能及相关特性。

根据蛋白质纯化的原理和方法，可以分为物理法、化学法和生物学法等。

1.物理法
物理法是纯化蛋白的最简单方法之一，通常通过使用力场或温度去把一定浓度的蛋白质从溶质中萃取出来。

物理法不耗费能量也不会改变蛋白质的化学结构，不改变蛋白质的结构和功能，但有时可能会引发蛋白质的活性降低，因为櫛发性和相互之间复合物的结合可能会受到改变。

例如分子筛膜技术、沉淀离心技术等。

2.化学法
化学法是一种可以改变蛋白质结构的方法，一般是通过有机溶剂或水溶性固定相，以水或有机溶剂和化学试剂实现蛋白质的分离和纯化。

化学法可以破坏蛋白质的活性，从而改变其化学结构和功能，或者通过改变蛋白质的电性或物理状态来实现蛋白质的分离和纯化。

例如偏光技术、电泳技术、蛋白质酶剪切技术等。

3.生物学法
生物学法是一种比较复杂的蛋白质分离方法，是利用特定生物因子。

蛋白质纯化的方法

蛋白质纯化的方法
蛋白质纯化的方法有多种，包括但不限于以下几种：
1. 层析法：包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。

2. 电泳法：包括区带电泳、等电点聚焦等。

3. 有机溶剂提取：与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低，因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。

4. 盐析：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。

5. 免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

6. 透析和超滤法：透析利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开；超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

以上方法可以根据实际需要进行选择，必要时可以组合使用。

请注意，不同方法的效果和适用范围可能存在差异。

生物化学研究进展论文蛋白质提纯

生物化学研究进展论文蛋白质提纯文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-生物化学研究进展作业题目蛋白质的提取、纯化姓名学号班级专业题目：蛋白质的提取、纯化姓名：专业：摘要：本文综述了蛋白质的提取原理及方法，蛋白质纯化的意义、基本原则及方法，蛋白质纯化的前景展望。

关键词：提取原理提取方法水溶液有机溶剂双水相萃纯化意义基本原则方法溶解度带电性质电荷数配体特异性前景正文：1 蛋白质样品的提取1．1蛋白质样品的提取原理提取蛋白质的基本原理主要有两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。

1．2 蛋白质样品的提取方法1．2．1 水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液是提取蛋白质最常用的溶剂。

通常用量是原材料体积的1—5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。

提取的温度要视有效成分性质而定，一般在低温(5℃以下)下操作。

另外，蛋白质和酶是两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH值范围内。

一般来说，在避免极端pH值的前提下，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。

此外，稀浓度可促进蛋白质盐溶，并且盐离子与蛋白质部分结合，能够保护蛋白质不易变性。

因此可在提取液中加少量NaC1等中性盐，一般以0．15 mol／L浓度为宜。

1．2．2 有机溶剂提取法一些和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶都不溶于水、稀盐溶液、稀酸或碱，可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，具有一定的亲水性和较强的亲脂性，并且不会残留在产品中，容易蒸发除去，密度低，与沉淀物质的密度差大，便于离心分离。

但不足的是用有机溶剂来提取蛋白质比用盐析法更容易引起蛋白质变性。

蛋白的分离纯化详细讲解

变性和复性
• 原理：蛋白质在一定的理化条件下失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性.当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性.
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白
二、蛋白质的分离纯化
分离纯化流程
原材料的获取
预处理（沉淀）
纯化
细胞破碎
研磨超声渗透压酶 ……
• 将上述作用体系的一方连接到层析基质上,使之固定化,就有可能分离纯化专一作用tag <6-8 Histidine>镍离子-6
个组蛋白 T7-tag <MASMTGGQQMG> HSV-tag <QPELAPEDPED> S-tag <KETAAKFERQHMDS> VSV-G-tag <TTDIEMNRLGK> HA-tag <YPYDVPDYA>
一、蛋白质的分离纯化概述
与蛋白质分离纯化相关的理化特
• 分子大小
性
• 分子形状
哪些技术、原理
• 带电特性
• 溶解特性
• 与配体特异性结合不同
• 吸附性质
• 变性和复性
分子大小重点
• 大小：蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目.
• 常用方法 • 透析 • 超滤 • 凝胶过滤 • 离心
离蛋白质混合物最强大的技术,也是蛋白质组学研究的重要技术.
• 基本步骤：第一相等电聚焦后,在等电聚焦的垂直的方向进行第二
相SDS-PAGE.
双向凝胶电泳的原理：第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDSPAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开.

蛋白质的提取和纯化

蛋白质的提取与纯化徐卫 10食工（1）班 20100803122一，蛋白质的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

提取的温度要视有效成份性质而定。

一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。

但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。

为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。

2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。

同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。

升浓度为宜。

缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

但必须在低温下操作。

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理分离纯化蛋白质是生物化学和分子生物学研究中的重要步骤。

蛋白质的分离与纯化可以使我们更好地理解蛋白质的结构和功能，并为进一步的研究提供可靠的蛋白质样本。

下面将介绍一些常见的蛋白质分离和纯化方法及其原理。

1.存活细胞提取法：这种方法是从细胞中提取蛋白质。

先将细胞破碎，然后通过离心等手段去除细胞碎片和细胞器，留下蛋白质溶液。

使用该方法分离的蛋白质包括细胞质蛋白、细胞膜蛋白等。

2.柱层析法：柱层析法是一种广泛应用的蛋白质分离方法。

它主要依据蛋白质的性质（如分子质量、电荷、亲水性等）在各种填料（如离子交换、凝胶透析、亲和层析等）上的差异进行选择性分离。

原理是根据蛋白质与填料之间的相互作用，通过溶液通过填料层析柱时，不同蛋白质以不同速率在填料间扩散，并在填料内发生各种相互作用，从而实现蛋白质的分离。

该方法可同时分离多个蛋白质，并制备高纯度的蛋白质。

3.电泳法：电泳法是根据蛋白质在电场中的迁移速率、电荷性质和分子大小等特征进行分离的方法。

常见的电泳方法包括SDS-、等电聚焦电泳、二维电泳等。

其中，SDS-是最常用的蛋白质分离方法之一，它通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变成带负电荷的复合物，继而在电场作用下，按照蛋白质的分子质量大小进行分离。

4.超滤法：超滤法是根据不同分子量的蛋白质在超滤膜上的渗透性差异进行分离。

超滤分离可以根据孔隙的大小将不同分子量的蛋白质阻滞，有效地去除较小分子量的杂质，得到目标蛋白质的高纯度。

5.亲和层析法：亲和层析法是通过目标蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离的方法。

配体可以是特定的抗体、金属离子、凝胶颗粒等。

原理是通过将配体共价结合到固定相上，然后将蛋白质样品溶液通过，使目标蛋白质与配体发生特异性结合，其他非特异性结合的蛋白质被洗脱，最后目标蛋白质被洗出。

6.上下层析法：上下层析法是一种根据沉降速度差异进行分离的方法。

利用离心过程中不同蛋白质溶液中蛋白质的不同沉降速度将蛋白质分离。

蛋白质的分离纯化和鉴定

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本章主要内容
氨基酸肽蛋白质的结构、重要性质、结构
与功能关系和蛋白质的分离纯化
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三聚氰胺
结构用途：广泛应用于木材、塑料、涂料、造
纸、纺织、皮革、电气、医药等行业根据美国食物及药物管理局的标准，三聚
氰胺可容忍摄入量为每日0.63毫克/公斤体重假蛋白原理：蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的分子中含氮量为66％左右。通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。
超滤法
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四、纯化
1、离子交换层析 2、凝胶过滤原理：根据蛋白质分子大小的不同进行分离介质特点：内部多孔的网状结构常用的凝胶：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、
琼脂糖凝胶优点：分离条件温和，不影响样品的生物活性；
样品损失小，回收率高。
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习题
指出下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱（蛋白质分离范围从5000到400000）时的洗脱顺序。肌红蛋白：16900；过氧化氢酶：247500；细胞色素C：13370；肌球蛋白：524800；胰凝乳蛋白酶原：23240；血清清蛋白：68500。
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3、疏水作用层析原理：利用蛋白质表面的非极性基团和介质上
的疏水基团间的疏水作用来分离蛋白质的层析方法。介质：以琼脂糖为母体，偶联上非极性基团。如苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。洗脱：高离子强度增加疏水作用。高浓度硫酸铵存在下将蛋白质吸附在介质上，然后逐渐降低硫酸铵的浓度进行洗脱。
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通用的蛋白质测试方法凯氏定氮法是通过测出含氮量来估算蛋白质含量因此添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高从而使劣质食品通过食品检验机构的测试

提取蛋白质的具体步骤

提取蛋白质的具体步骤
提取蛋白质是生物学研究中常见的实验操作，下面将介绍一种常用的蛋白质提取方法。

我们需要准备样品。

样品可以是细胞、组织或血清等，根据实验需要选择相应的样品。

第一步是细胞破碎。

将样品加入破碎缓冲液中，用超声波或高压细胞破碎机进行破碎，使细胞膜破裂释放细胞内的蛋白质。

第二步是离心。

将破碎后的混合液进行离心，以分离出蛋白质。

离心条件可以根据实验需要进行调整，一般为12000转/分钟，离心时间为15分钟。

第三步是蛋白质沉淀。

将上一步得到的上清液转移至新的离心管中，加入沉淀剂（如三氯醋酸或酒精等），使蛋白质沉淀。

沉淀剂的添加量要根据实验需要进行调整，一般为上清液体积的1/4。

第四步是离心沉淀。

将蛋白质沉淀进行离心，以分离出蛋白质。

离心条件与前面相同。

第五步是去除上清液。

将上清液倒掉，保留蛋白质沉淀。

第六步是蛋白质溶解。

将蛋白质沉淀加入蛋白质溶解缓冲液中，通过振荡或轻微加热使蛋白质完全溶解。

第七步是蛋白质浓缩。

可以利用浓缩管或离心浓缩器对蛋白质溶液进行浓缩，使蛋白质浓度增加。

第八步是蛋白质纯化。

根据实验需要选择相应的蛋白质纯化方法，常见的有离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

将纯化后的蛋白质用适当的缓冲液储存或直接用于后续实验。

通过以上步骤，我们可以从样品中提取到目标蛋白质。

这是一种常用的蛋白质提取方法，可以根据实验需要进行相应的优化和改进。