检验方法验证

29
可以接受的标准 — 薄膜过滤法
1、重现性良好
- 三批不同批次的样品/产品 - 三名不同的微生物检验人员
2、验证数据合理有效（微生物的回收率）
- 阴性对照：没有污染事件发生。 - 样品组： B = A + 30% （ 偏差≤ 30%）
3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符
30
薄膜过滤法优化更新方法：
2
美国FDA分析方法验证指南：
“分析方法验证” 分析方法验证是论证某一分析方法适用于 其用途的过程，分析方法的验证过程是从 申请者有计划地系统性收集验证资料以支 持分析方法开始的。
3
验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法， 如果样品（药品）中有一定数量的微生物 存在，那么采用此法可以使得样品（药品） 中的微生物得以检出。 - 充分验证样品（药品）本身对微生物生长 的影响。
17
检测限设定依据：
- 微生物计数原则 - 限度 / 标准 - 数理统计方法学的要求
18
恢复试验的原则
- 消除样品的抑菌性 - 样品的处理方法和检验方法不 应影响样品中微生物的生长
19
如何消抑菌活性
- 稀释法 - 中和法 - 离心法 - 薄膜过滤法 - 组合运用
20
计数方法验证（平板法）
样品组：
选定一个方法 确定检测限 设计验证方案
15
样品的选择：
合格的样品 - 按照正常取样方法取样的样品
- 符合限度标准的样品
16
检测限：样品中细菌被检出的最低量。
平板法：
细菌 ≤ 100 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 ≤ 100 cfu/ml
薄膜过滤法：
细菌 ≤ 50 cfu/ml 霉菌 + 酵母菌 ≤ 50 cfu/ml
26
优化更新步骤：
消除抑菌活性。 稀释样品时，应确认检测限（检验限度） 低于或等于标准。 不同的细菌，一个好的结果可以从不同 的稀释度中检测出，最高的稀释度将被 用于日常的监测中。
27
平板法优化更新方法：
稀释样品：1/10 增加培养基量 延长培养时间 添加抗活性剂
1/50 1/100
28
计数方法验证（薄膜过滤法）
39
不可以接受的标准 （无效试验）
1、样品检验
- 与可接受的标准不符 结论：重新设计试验步骤
2、阳性对照
- 与可接受的标准不符 结论：重新试验
3、阳性菌计数
- 与标准不符 结论：重新开设大肠杆菌的恢复试验，制作新的 菌悬液直到符合规定。
40
优化控制菌验证步骤：
扩大增菌液的体积
100ml 200ml 300ml 400ml 500ml
固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml
11
微生物计数方法验证菌种选择原则
普遍性
- G+、 G-、 -杆菌（长、短杆菌） -球菌 -真菌（丝状真菌、酵母菌）
特殊性
- 从环境中分离出来的常见杂菌 - 从样品中分离出来的常见杂菌
12
微生物计数方法验证用菌株：
42
失败的验证 （无效试验）
1、样品中有些成分是固有的抑菌成分 2、参考防腐剂的实验/验证数据 3、参考样品中各成分的理化性质
43
验证结果
根据验证结果，判断是否符合验证的标准。 －符合 按验证的方法和条件继续进行药品的微生物 限度检查； －不符合 重新设计验证方案，再进行验证，直至验 证结果全部符合验证方案。
2、蛋白胨对照组和菌种组测试结果一致，表明：
- 中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。
3、空白样品组测试结果阴性，表明：
- 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。
38
可以接受的标准
1、样品检验 - 增菌液经培养后明显浑浊 - 分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落 2、阳性对照 - 增菌液经培养后必须是浑浊的 - 分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落 3、阳性菌计数 - 菌悬液的计数结果应该 < 25 cfu/ml
ATCC编号
ATCC 8739 ATCC 6538 ATCC9027 ATCC11437 ATCC6633 ATCC10231 ATCC16404
培养条件
32 +2.5℃ 32 +2.5℃ 32 +2.5℃ 32 +2.5℃ 22 +2.5℃ 22 +2.5℃ 22 +2.5℃
14
计数方法验证步骤
延长增菌液的培养时间 采用薄膜过滤法 加入活性试剂
41
控制菌检验方法验证（薄膜过滤法）
（以大肠杆菌为例）
加10ml 稀释液到薄膜过滤器中，加湿过滤器。 加100ml 样品增菌液到薄膜过滤器中。 加0.1ml、5X102 cfu/ml大肠杆菌悬液到薄膜过滤 器中并用稀释液冲洗，这样，薄膜上就应该 有50 cfu个菌落出现。
48
方法验证的关键点（3）
为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做 10倍梯度稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换 灭菌吸管。操作时，将灭菌吸管插入原液中，将菌液 充分混匀，吸取菌液，贴于试管内壁调整液量至刻度， 将菌液移入下一级的稀释管中，移入时，吸管应接触 试管内壁并靠近液面（勿接触液面），缓慢地沿管壁 放出全部菌液，然后，将吸管放入消毒液中。再取一 支灭菌吸管同法往下稀释。
样品溶液（1/10）9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
计数A
稀释剂对照组：
蛋白胨稀释液 9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
计数B （阴性对照）
菌种组：
104 102
计数C （阳性对照）
空白样品组：
计数D
21
结果判断依据：
1、样品组和稀释剂对照组微生物计数结果吻合，表明：
- 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。
2、稀释剂对照组和菌种组微生物计数结果吻合，表明：
- 中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。
3、空白样品组测试结果阴性，表明：
- 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。
22
可以接受的标准 — 平板法
培养条件
营养肉汤培养基
30-35℃ 18-24h
改良马丁培养基
20-25℃ 18-24h
改良马丁斜面培养基
20-25℃ 5-7天
13
微生物计数方法验证用菌株：
USP24版 菌株名称
大肠埃希氏菌(Escherichia coli) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 铜绿假单胞菌(Staphylococcus aureus) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) 白色年珠菌(Candida albicans) 黑曲霉菌(Candida albicans)
（3）具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)
46
方法验证的关键点（1）
对于同一份培养物，采用相同的测定方法 ，不同的实验人员的测定结果的可能有很大 的误差，甚至达到50%。所以，在操作过程 中，应特别注意能造成误差的各个环节。
47
方法验证的关键点（2）
当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时， 应尽量使菌苔成单个菌体充分分散于稀释液 中，一般将菌苔与微量稀释液先在管壁上混 匀。对于那些不易制成均匀菌悬液的菌苔 （如枯草芽孢杆菌），一般采用液体培养物 制备菌悬液。若液体培养物产生菌膜，取菌 液时应避免取出菌膜，一般应取培养管中部 的均匀菌悬液。
44
验证报告的形成
1、全部验证工作必须按照批准的验证方 案进行。 2、验证方案批准后，可以进一步再修订， 但必须在验证报告上注明。 3、验证结束后，应该同时出具验证数据 记录和验证报告。 4、最终样品稀释度及方法必须在SOP中 说明。
45
采用薄膜过滤法的供试品
（1）水溶液 （2）可溶于水的固体制剂 （3）ß-内酰胺类抗生素 非水溶性制剂 （1）可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂 （2）无菌气（喷）雾剂 装有药物的注射器
1、重现性良好 - 三批不同批次的样品/产品 - 三名不同的微生物检验人员 2、验证数据合理有效（微生物的回收率） - 阴性对照：无污染事件发生 - 样品组（ 回收率）： A = C ± 30% （ 偏差≤ 30%） 3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符
23
计数方法的验证-各国药典结果判断标准
恢复试验
- 微生物方法验证的实质就是评价和考察 微生物恢复试验（恢复生长）的可信度。 - 恢复试验就是确认某一检验方法，它可 以使加入其一）计数方法验证 （二）控制菌检验方法验证
8
微生物限度检验方法验证 （一）
计数方法验证
9
供试液制备（ 中国药典2005版）
样品组：
样品溶液（1/10）10ml 5x 102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 过滤
计数A
蛋白胨对照组：
蛋白胨稀释液 10ml 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 过滤
计数B （阴性对照）
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 过滤
计数C （阳性对照）
空白样品组：
过滤
计数D
2、阳性对照：
样品组的试验数据与检测限不符。（微生物的回收率过 高或过低）结论：样品组的试验结果无效。 重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。
25
不可以接受的标准：
3、样品组：
- 三人三次的试验结果应该与检测限相符。
- 第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的试验 证实。 - 任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程有缺 陷，验证需重新进行。