蛋白质组学研究的有效工具——双向电泳鉴定技术
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向电泳技术的原理及应用
双向电泳技术的原理及应用1. 原理双向电泳技术是一种分离和鉴定蛋白质的常用方法。
它结合了凝胶电泳和电泳移动的优势，可以在同一实验中实现更高的分辨率和更好的分离效果。
双向电泳的原理基于两个关键因素：分子大小和电荷。
在实验中，蛋白质样品首先沿一个方向进行电泳。
由于蛋白质的不同大小和电荷，它们会在凝胶中形成不同的带状图案。
然后，凝胶会旋转90度，使蛋白质在垂直方向上进行电泳。
这样一来，蛋白质会在另一个方向上发生分离。
双向电泳的核心是双向凝胶，其结构类似于二维网络。
在第一个方向上，凝胶中的蛋白质会形成一维图案，而在第二个方向上，蛋白质会形成另一维图案。
通过对这两个图案的分析，可以得到更为准确的蛋白质信息。
2. 应用2.1 蛋白质分离和纯化双向电泳技术在蛋白质分离和纯化中有着广泛的应用。
由于双向电泳可以提供更高的分辨率，可以分离和鉴定更多的蛋白质。
这在研究蛋白质结构和功能以及疾病诊断中具有重要意义。
2.2 蛋白质组学研究双向电泳技术在蛋白质组学研究中发挥着重要作用。
通过双向电泳，可以分离出复杂样品中的蛋白质，并获得其质量和电荷信息。
这些信息可以用于鉴定蛋白质和研究其功能。
2.3 药物研发双向电泳技术在药物研发中也有广泛的应用。
通过双向电泳，可以分离和鉴定药物的靶点，进一步了解药物与蛋白质的相互作用机制。
这对于药物设计和优化具有重要意义。
2.4 分子生物学研究双向电泳技术在分子生物学研究中有着重要的应用。
通过双向电泳，可以鉴定蛋白质的表达变化，从而了解基因表达调控机制。
这对于研究细胞功能和疾病发生机制具有重要意义。
2.5 环境监测双向电泳技术在环境监测中也有着广泛的应用。
通过双向电泳，可以分离和鉴定环境中的污染物，从而评估环境质量和污染程度。
这对于环境保护和治理具有重要意义。
3. 优缺点3.1 优点•分辨率高：双向电泳可以提供更高的分辨率，可以分离和鉴定更多的蛋白质。
•信息丰富：双向电泳可以获得蛋白质的质量和电荷信息，有助于了解蛋白质的结构和功能。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
双向电泳技术原理及其应用
¹双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。
关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库;减法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)022*******随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而生。
双向电泳(tw o 2dimensional electrophoresis,22D E)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广泛关注。
1 双向电泳的基本原理首先根据蛋白质等电点不同在pH 梯度胶中等电聚焦(isoelec tric f ocusing,IEF)将其分离,然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAG E)第二次分离。
根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE 分为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统称为IS O 2D A L T 。
其主要缺点是pH 梯度不稳定,重复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines 共聚,形成具有pH 梯度的凝胶,这种系统称为IPG 2D AL T 系统,该系统pH 梯度稳定,不依赖于外加电场,基本上克服了ISO 2D AL T 的主要缺点,无论是重复性和上样量均优于I SO 2D AL T;第三种是非平衡pH 梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis,NEPhG E),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术，用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。
首先，将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。
凝胶是一种聚合物网状结构，可以限制分子的运动，将其分离。
常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
第一步是水平电泳。
在水平电泳阶段，一个方向的电场施加在凝胶中，使得带电分子向着相应的电极方向移动。
这个方向通常被称为水平方向，因为它从一个电极移动到另一个电极。
在水平电泳过程中，由于分子的大小和电荷不同，它们将以不同的速度在凝胶中运动。
大分子移动缓慢，小分子移动快速。
这样，分子根据大小按照一定的顺序移动，导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。
这个方向通常被称为水平电泳通道。
第二步是垂直电泳。
在水平电泳结束后，垂直电场被施加在凝胶中，使分子以另一个方向移动。
这个方向通常被称为垂直电泳通道。
在垂直电泳过程中，分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上（正电流）或向下（负电流）。
正电流将使分子向上移动，而负电流将使分子向下移动。
这样，分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。
最终，两个方向的电泳都完成后，在凝胶上会形成一个类似网格的结构，其中分子被分离成不同的带状。
这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来，从而确定分离出的分子的位置。
总结起来，双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。
通过水平电泳和垂直电泳，分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状，从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。
双向电泳和质谱技术
双向电泳和质谱技术双向电泳和质谱技术是两种广泛应用于生物化学和生物物理学领域的分析方法。
它们通过不同的原理和技术手段，可以对生物分子进行定性和定量的分析。
本文将介绍双向电泳和质谱技术的基本原理、应用领域以及发展前景。
一、双向电泳双向电泳是一种常用的蛋白质分析方法，它通过电泳将蛋白质在两个正交方向上进行分离，从而实现高分辨率的分析。
其基本原理是利用蛋白质在电场中的电荷、大小和形状等特性，通过在两个方向上施加电场，不断地移动蛋白质分子，使其在凝胶中分散开来，最终实现完全的分离。
双向电泳技术在生物化学和生物物理学领域中有着广泛的应用。
它可以用于研究蛋白质的组成和结构，探索蛋白质相互作用的机制，寻找新的蛋白质标记和药物靶点等。
双向电泳技术的主要优点是分离效果好、分析速度快、灵敏度高。
然而，该技术也存在一些局限性，比如在分离过程中可能出现混叠现象，对样品要求较高等。
二、质谱技术质谱技术是一种以测定生物样品中质量与荷电比（m/z）为基础的分析方法，它可以对样品中的化合物进行分析和鉴定。
质谱技术的基本原理是将样品中的化合物通过电离技术转化为带电离子，然后根据离子在磁场中受到的作用力大小，测量离子的质量和荷电比，从而确定分子的质量。
根据质谱仪的不同类型和检测模式，质谱技术可以分为质谱仪、质谱成像、质谱图谱等多种形式。
质谱技术在生物化学和生物物理学领域中扮演着重要的角色。
它可以用于寻找新的生物标记物、研究代谢产品的组成、药物的代谢途径以及蛋白质的翻译后修饰等。
同时，质谱技术还可以与其他分析方法进行联用，如液相色谱联用质谱、气相色谱联用质谱等，以增强分析的灵敏度和分辨率。
三、双向电泳与质谱技术的结合双向电泳和质谱技术在生物科学研究中常常被结合使用，以实现更全面、深入的分析。
双向电泳可以将蛋白质分子进行高效的分离，而质谱技术可以对分离得到的蛋白质进行质量测定和结构鉴定。
通过双向电泳与质谱技术的结合，可以在一定程度上弥补两种方法的局限性，提高分析结果的准确性和可靠性。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤：双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。
它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质，并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。
以下是一般的双向电泳操作步骤：1.确保准备充足的电泳装置，包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。
2.准备样品：将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理，包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。
将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。
3.将样品加载到电泳槽中：在准备好的电泳缓冲液中加入样品，然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。
注意，为了保持电泳稳定性，在样品孔加载样品后，要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。
4.进行等电点电泳：将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中，并在两侧分别连接正负极。
设置合适的电流和电压，开始进行等电点电泳。
在等电点电泳过程中，蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。
5.停止等电点电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为2-3小时。
等电点电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
6.水平电泳：停止等电点电泳后，将样品塘从上清洗掉，并用水平电泳缓冲液进行冲洗。
然后，在两侧连接正负极，设置合适的电流和电压，开始水平电泳。
在水平电泳过程中，蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。
7.停止水平电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为4-5小时。
水平电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
8.染色和图像采集：将分离完毕的样品进行染色，常用的染色方法包括银染和荧光染色。
然后，使用图像采集系统获取电泳图像，可根据需要调整采集参数。
9.数据分析和解释：通过对电泳图像的分析，包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等，将分离出来的蛋白质鉴定和定位。
10. 验证和验证：对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。
蛋白质组学研究中双向电泳技术的应用
胶中或膜上切取这些 目标蛋 白质作鉴定。现在绝 大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成 的。
丙烯 酰胺 共 价聚 合而 成 ＩＧ胶 条 ，其 优势 主要 Ｐ 有 ［ ：ｐ ６ Ｈ梯度稳定 ，聚焦准确 ，精度高 ，梯度分 ］ 辨率可 达 ００ １Ｈ ． ｐ ；无 阴极漂移及碱性蛋 白丢失 ０
在主要和通用的一向等电聚焦方式［ 。 引
２ ３ 第二 向 电泳 ．
寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式 （ ￣ ｔｓ ｘｔ
—
ｔｍｌ—ｔｎｌｍ ｄ ｅ ｒｓ ｌ ）的方 法 ｏ ｒ ａ ｉ ａｙ ｏｉ ｄｆｍ ，ｅ＇ ａ ｏ ｌ ｉ ｆ ｏ Ｍｓ
第二向是十二烷基磺酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶
泳 ，进 行染 色 。 目前 实 验 室 最 常用 的显 色 方 法 是
第一向是等点聚焦电泳 ，根据一 向等 电聚焦
方 式 的不 同 ，可 将 双 向 电泳 分 为 ３种 系统 ： （ ） １
ＩＯ—Ｄ Ｌ （ｓ Ｓ ＡＴ ｉ ｏ—ｅ ｃ ｉ ｆ ｕｉ ｆｌ ｅ 锄 ・ ｌ ｔｃ ｏ ｓ ｇ ｌｗ ｄ ｂ ｅ ｒ ｃ ｎ ｏｏ ｔ ｎ ｉ ｒｓｅｔｍｏ ｕａｎｓ ｘｒ ｓｄ ａ ｏｓ 系 ｉ ｗｔ ｅｐｃｔ ｌ ｌ ａｓｅｐｅ ｅｉ ｄｌ ｎ ） ｏ ｈ ｏ ｅ ｎ ｃ ｓ ｎ ｔ
（ｎ ｎ — ｅ ｕ ｉｒ ｍ ｐ ｇａｉ ｔ ｅ ｃ ｏｈｒｓ ， ｏ ｑ ｉｂｉ ｌ ｕ Ｈ ｒ ｅ ｌ ｔｐｏ ｉ ｄｎ ｅｒ ｅｓ
Ｎ Ｐ Ｇ ）系 统 ，主 要 用 于 分 离 碱 性 蛋 白质 ，但 ＥＨ Ｅ 如果 聚焦 达到 平 衡 状 态 ，碱 性 蛋 白会 离 开 凝胶 基
概 念 出现之前 ，免 疫印迹 法就 已得 到广 泛 的应 用 。
方法与生物质谱技术 的不断进步，以及两者有效 的结合 ，使研究人员能够更加有效地分离蛋 白质
蛋白质的双向电泳
分子量 提取的总蛋 白溶液 小 通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同 位置从而实现蛋白质的双向分离
2DE图谱
硝酸银染色图谱 考马斯亮蓝染色图谱
双向电泳（DIGE）示意图
样品1： Cy3标记 将标记的 样品混合 样品2： Cy5标记
双向电泳分离
荧光扫描仪扫描ຫໍສະໝຸດ 图像重叠分析蛋白质双向电泳
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动 态变化的一门科学 研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的 定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据 这些研究最终确定它们的功能
技术流程
提出 生物学问题 实验组和对照组 样品制备 凝胶图像分析
双向电泳(2DE/DIGE)
胶条平衡
等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳 之前需进行胶条平衡，以便于被分离 的蛋白质与SDS充分结合，保证SDSPAGE电泳的顺利进行 步骤：一般采用两步平衡法，用含 SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液 先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT 后再平衡一次
SDS-PAGE电泳
使得蛋白质按照分子量的大小不同而 分离，与普通SDS-PAGE相似 在双向电泳系统中无需浓缩胶，因为 第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓 缩
DIGE图谱
样品制备
双向电泳的最关键步骤之一
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质， 尽可能简单的操作步骤，注意防止样品 提取过程中的各种化学修饰，去除样品 中核酸、盐离子等干扰物质。
等电聚焦
通过10000V高压使得蛋白质按照其等电 点特性进行聚焦 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、 低压维持 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平 和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性， 在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢 失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品 类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度 来确定。
双向电泳的应用和原理
双向电泳的应用和原理应用双向电泳是一种常用的生物分析技术，常用于蛋白质分析和DNA分析等领域。
以下是双向电泳的一些主要应用：1.蛋白质分析：双向电泳被广泛用于蛋白质分析。
通过将样品中的蛋白质分离成不同的带，可以进一步研究蛋白质的结构和功能。
2.DNA测序：双向电泳也可以用于DNA测序。
通过将DNA片段分离成不同的带，可以确定DNA的序列。
3.肿瘤标记物检测：双向电泳可以用于检测肿瘤标记物，从而帮助早期诊断和治疗。
4.药物筛选：双向电泳可以用于筛选新药物的研究。
通过比较不同试验条件下的蛋白质表达，可以确定新药物的作用机制。
5.疾病研究：双向电泳可以用于研究不同疾病的发生机制和治疗靶点。
通过比较患者样本和正常对照的蛋白质表达，可以发现与疾病相关的蛋白质变化。
原理双向电泳是将电泳技术应用于两个方向的分离，以实现更高分辨率的分析。
以下是双向电泳的基本原理：1.等位点电泳：双向电泳始于等位点电泳（IEF），即根据蛋白质的等电点将其分离成不同的带。
蛋白质在直流电场下会在电极之间移动，直到达到与环境中的离子浓度相等的位置。
这样，蛋白质就能被固定在凝胶中的特定位置。
2.SDS-PAGE：随后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质按照其分子量进一步分离。
在SDS-PAGE中，SDS（十二烷基硫酸钠）会使蛋白质带负电荷，从而使蛋白质按照其分子量在电场下移动。
3.双向电泳：在双向电泳中，IEF和SDS-PAGE两个步骤结合在一起。
首先，将样品在一维的IEF凝胶中进行等位点电泳分离。
然后，将等位点电泳的凝胶旋转90度，将其置于SDS-PAGE凝胶上。
这样，样品就可以在两个方向上进行电泳分离。
4.分析结果：双向电泳结束后，可以通过染色或质谱分析等方法来可视化和分析分离的蛋白质带。
比较不同样品的带的强度和位置可以得出有关蛋白质表达和组成的信息。
双向电泳的原理和应用使其成为生物学和生物医学研究中不可或缺的工具。
双向电泳的基本原理
双向电泳的基本原理
双向电泳是蛋白质组学研究中最重要的技术，在蛋白质组学研究中发挥了重要作用。
其基本原理是：样品中含有两种或两种以上不同分子量的蛋白质，它们的分子量分布不同，在加有等电聚焦（IEF）等电聚焦缓冲液的一台凝胶电泳仪（如UMEACO）上，蛋白质分子按其大小和分子量进行分离，并可在不同的pH 范围内进行电泳。
由于等电聚焦缓冲液具有强的选择性，不同分子量的蛋白质在同一胶上得到分离，经凝胶染色后在垂直于凝胶的方向上能显示出清晰的条带。
蛋白质分子量大的向小的方向移动，分子量小的向大的方向移动。
每一条带就是一个独立的分子。
双向电泳技术可以大大缩短实验时间、降低实验成本、提高分析效率。
例如：已知蛋白序列为a/b/c，对某一蛋白进行研究，只需分离出a/b/c三条带，再经双向电泳技术分离后即可得到含有三条带的蛋白质条带。
双向电泳技术是蛋白质组学研究中最重要的技术之一，其基本原理是：将样品制备成胶后，在垂直于凝胶电泳方向上将蛋白进行分离。
—— 1 —1 —。
双向电泳技术研究进展
双向电泳技术研究进展摘要：双向电泳(two dimensional electrophoresis , 2-DE)技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段，是蛋白质组学研究的三大核心技术之一。
本文主要从双向电泳技术的发展，主要操作步骤及其面临的主要挑战等方面对改技术的研究进展进行综述。
关键词：双向电泳；研究1.双向电泳技术的发展蛋白质双向电泳源于1975年O,Farrell. Klose.Scheele 对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究。
它首先根据样品中蛋白质等电点不同进行等电聚焦(IEF)作为第l向，然后再按照蛋白质分子量大小不同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)作为第2向，经染色后可以在凝胶上得到大量的蛋白质点，从而得到样品的蛋白质表达图谱。
根据双向电泳中第l向等电聚焦方法的不同，双向电泳主要分为2个主要类型，ISO-DALT(等电点一道尔顿)IPG．DALT ( 固相pH梯度一道尔顿)双向电泳。
1.1 ISO-DALT双向电泳技术传统的ISO-DALT双向电泳中，首先将载体两性电解质添加在丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的DH值梯度，两性电解质以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中。
通常采用圆柱状电泳，IEF凝胶制备在圆柱型玻璃管中，可以将样品加在未凝固的凝胶溶液中，也可在凝胶凝固后在玻璃管顶端加样，然后进行等电聚焦，通常在50～100V电压下聚焦1～2 h，让样品进入IEF胶条，然后在200 ～400V或更高电压下进行聚焦，直到电流接近零时为止。
等电聚焦结束后取下凝胶柱，向玻璃管中凝胶与管壁间注水，将凝胶条吹出，用缓冲液平衡凝胶条，主要目的是充分打断多肽链间及多肽链内部的二硫键并使其与SDS充分结合，然后将胶条用琼脂包埋于第2向电泳的凝胶板中，进行第2向SDS-PAGE，SDS-PAGE 可以使用均一的分离胶浓度，也可采用不连续梯度胶或者连续梯度胶。
双向电泳的原理和应用
双向电泳的原理和应用1. 原理双向电泳（Bidirectional Electrophoresis）是一种常用的电泳技术，可以有效分离和分析复杂样品中的蛋白质和核酸。
其原理是基于物质在电场中的带电性质和不同分子的迁移速度差异。
双向电泳采用两个电场分别作用于样品，一个在水平方向，另一个在垂直方向。
这两个电场的方向相反，使得样品分子在两个方向上均受到电场力的作用。
在水平方向上，电场力使得样品分子在凝胶中做两个方向的扩散；在垂直方向上，电荷的作用力使得样品分子沿凝胶向电极方向迁移。
通过双向电泳，样品分子在水平和垂直方向上的运动会发生偏移，从而实现蛋白质和核酸的分离。
根据分子的大小、形状和电荷等特性，不同的分子在双向电泳中会有不同的迁移速度，从而形成不同的带状图案。
这些图案可以被进一步分析和检测。
2. 应用双向电泳在生物科学研究和生物医学应用中具有广泛的应用，主要体现在以下几个方面：2.1 蛋白质分析双向电泳是蛋白质分析的一种重要方法。
通过双向电泳，可以将混合蛋白质样品进行分离，从而得到各自独立的蛋白质条带。
根据蛋白质条带的位置和数量可以推测样品中不同蛋白质的类型和相对含量。
这对于研究蛋白质的功能和相互作用非常有帮助。
2.2 新药开发双向电泳可以用于筛选和分析药物作用的靶向蛋白质。
通过比较药物处理前后的双向电泳图案，可以确定哪些蛋白质与药物有关。
这对于新药的开发和评估起到了重要的作用。
2.3 基因分析双向电泳也可以用于基因分析。
通过将DNA样品置于双向电泳中，可以将DNA的不同片段分离和检测。
这对于研究基因的结构、功能和突变等起到了关键作用。
2.4 生物标记物检测在临床诊断中，双向电泳可以用于检测特定蛋白质标记物，如肿瘤标志物。
通过分析血液或组织中的蛋白质条带，可以辅助诊断和评估疾病的发展和治疗效果。
结论双向电泳以其独特的分离原理和广泛的应用领域，在生物科学研究和生物医学领域发挥着越来越重要的作用。
它在蛋白质分析、新药开发、基因分析和生物标记物检测等方面具有广阔的应用前景。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
双向电泳的原理及步骤
双向电泳的原理及步骤
双向电泳是一种分离蛋白质的方法，基于蛋白质在电场中的电荷和大小的不同进行分离。
以下是双向电泳的原理及步骤：
原理：
双向电泳是将蛋白质样品首先进行等电聚焦，然后再进行垂直于等电聚焦方向的SDS-PAGE电泳，从而获得更高的分离效率。
等电聚焦可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离，而SDS-PAGE电泳可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
通过这两个步骤的组合，可以更加准确地分离出蛋白质。
步骤：
1. 等电聚焦：将蛋白质样品加入到等电聚焦电极中，该电极包含有一系列等电点缓冲液。
在等电聚焦过程中，电极会产生一个电场，该电场会将带有不同电荷的蛋白质分子朝向不同方向移动，最终在等电点处停留。
这样可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离。
2. SDS-PAGE电泳：在等电聚焦完成后，将电极旋转90度，使其与等电聚焦电极垂直。
然后将电极中的蛋白质样品注入到SDS-PAGE凝胶中，并进行电泳。
在SDS-PAGE电泳中，蛋白质会在电场中移动，但由于SDS的存在，蛋白质会被完全线性化。
这样可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
3. 结果分析：通过电泳分离，可以得到一系列不同的蛋白质带，每个带代表一个蛋白质。
通过比对蛋白质带的大小和位置，可以鉴定蛋白质的分子量和等电点，从而确定蛋白质的特征。
双向电泳的原理
双向电泳的原理双向电泳是一种用于分离和分析蛋白质和核酸的技术。
它通过两个方向上的电场来实现分离，是一种高效的电泳技术。
双向电泳的原理涉及到凝胶电泳和两个方向上的电场，下面将详细介绍双向电泳的原理。
首先，双向电泳使用凝胶作为分离介质。
凝胶电泳是一种利用凝胶作为分离介质的电泳技术，通过凝胶孔隙的大小和形状来实现对分子的分离。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等。
在双向电泳中，凝胶可以根据需要调整孔隙大小和形状，以实现对不同大小和电荷的分子的分离。
其次，双向电泳使用两个方向上的电场。
在双向电泳中，样品在水平方向上进行电泳分离，然后在垂直方向上进行电泳分离。
这样可以使得样品在两个方向上都得到有效的分离，提高了分离效率和分辨率。
通过在两个方向上施加不同的电场，可以实现对样品的双向分离。
双向电泳的原理是基于分子的大小和电荷来实现分离。
在水平方向上，分子根据大小被分离，较小的分子移动得更快，较大的分子移动得更慢。
在垂直方向上，分子根据电荷被分离，带正电荷的分子向一个方向移动，带负电荷的分子向另一个方向移动。
通过这种方式，可以实现对复杂混合物中不同分子的高效分离。
双向电泳在生物学和生物化学领域有着广泛的应用。
它可以用于分离和鉴定复杂混合物中的蛋白质和核酸，对于研究细胞信号转导、蛋白质相互作用、基因表达调控等具有重要意义。
双向电泳的原理和技术不断得到改进和完善，使得其在生命科学研究中发挥着越来越重要的作用。
总之，双向电泳是一种基于凝胶电泳和双向电场的分离技术，利用分子的大小和电荷来实现高效的分离。
它在生物学和生物化学领域有着广泛的应用前景，为研究复杂混合物中的蛋白质和核酸提供了重要的技术支持。
随着技术的不断进步，双向电泳将会发挥越来越重要的作用，为生命科学研究带来新的突破和进展。
双向电泳法的名词解释
双向电泳法的名词解释双向电泳法（Two-dimensional gel electrophoresis）是一种常见的蛋白质分离和分析技术。
它结合了等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），用于在蛋白质混合物中高分辨率地分离出各种蛋白质成分。
在双向电泳法中，第一维度的等电聚焦电泳通过蛋白质的等电点移动来分离它们。
等电聚焦电泳是一种基于蛋白质的等电点（pI）的分离方法。
每种蛋白质都有不同的等电点，即在特定pH下带有零净电荷的点。
通过调整环境的pH值，蛋白质被聚焦在模板上，并在电场的作用下沿着pH递增或递减的梯度进行分离。
第二维度的聚丙烯酰胺凝胶电泳通过分子量大小来分离蛋白质。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种基于蛋白质的分子量的分离方法。
在凝胶中，较大的蛋白质相对较慢地通过凝胶网络，而较小的蛋白质相对较快地通过凝胶网络。
通过在凝胶中施加电场，蛋白质被推动并根据其分子量大小移动到不同的位置。
通过将两个维度的分离结果相互对应，双向电泳法可以在一个凝胶上实现高分辨率的蛋白质分离。
这种技术可以用于解析复杂的蛋白质混合物，从而帮助研究者发现和鉴定各种蛋白质，并了解它们在生物学过程中的功能和相互作用。
双向电泳法在生物学研究中具有广泛的应用。
例如，在蛋白质组学研究中，双向电泳法被用于寻找蛋白质组中的生物标志物，这些生物标志物可以作为某种疾病的诊断指标。
此外，双向电泳法还可用于研究细胞的生长、发育和疾病过程中蛋白质表达的变化，以及探索蛋白质相互作用和信号传导网络等方面。
值得注意的是，双向电泳法也存在一些限制和挑战。
由于样品复杂性和蛋白质的动态范围，该技术的动态范围较窄。
此外，蛋白质样品的预处理和凝胶电泳的条件设置等也会影响结果的准确性和可重复性。
因此，在使用双向电泳法进行蛋白质分析时，需要修正和标准化的方法和实验流程。
双向电泳和质谱技术
双向电泳和质谱技术双向电泳和质谱技术是生物分析领域中常用的两种先进技术手段，它们在蛋白质分析、基因测序和疾病诊断等方面发挥着重要作用。
本文将重点介绍双向电泳和质谱技术的原理、应用及未来发展趋势。
1. 双向电泳技术双向电泳是一种利用电场在两个方向同时进行电泳分离的方法。
在垂直电泳的基础上，通过在水平方向引入一个交叉的电场，使得分子在两个方向上同时受到电场的作用，从而实现更加细致的分离和分析。
双向电泳技术可以有效地应对复杂样品的分析需求，提高分离效率和分辨率，广泛用于蛋白质组学和基因组学领域。
2. 质谱技术质谱技术是一种通过测定分子的质荷比来识别、定量和分析化合物的方法。
质谱技术主要包括质谱仪器、样品制备和数据分析三个方面。
通过质谱技术可以快速准确地鉴定生物样品中的蛋白质、代谢产物和小分子化合物，为生物医学研究和临床诊断提供重要帮助。
3. 双向电泳和质谱技术的应用双向电泳和质谱技术在生物学研究和医学诊断中有着广泛的应用。
在蛋白质组学研究中，双向电泳可以帮助科学家分析蛋白质的组成和结构，揭示蛋白质的功能与调控机制；而质谱技术则可以通过蛋白质质谱鉴定和定量，解析复杂生物系统中的蛋白质交互作用和信号传导通路。
在疾病诊断中，质谱技术可以通过检测患者生物标志物的质谱图谱，诊断疾病类型和病情进展，为个体化治疗提供指导。
4. 双向电泳和质谱技术的未来发展随着科学技术的不断进步，双向电泳和质谱技术也在不断优化和完善。
双向电泳技术不断提高分离效率和分辨率，以适应更加复杂样品的分析需求；质谱技术在仪器性能、数据处理和生物信息学分析方面得到了进一步提升，为生物学研究和医学诊断带来更多可能性。
未来，双向电泳和质谱技术将继续发展壮大，成为生命科学研究和临床医学应用的重要工具之一。
总结双向电泳和质谱技术作为生物分析领域的重要手段，为生命科学领域的研究和应用提供了有力支持。
通过深入了解双向电泳和质谱技术的原理和应用，我们可以更好地利用这两种技术手段，推动生物学研究的进步和医学诊断的发展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
进行二 次 电泳 的过程 ． 首先在 第 一 向电泳 中根 据
蛋 白质所 带 电荷 的性质 进 行 等点 聚 焦 （Ｅ ） 等 ＩＦ ，
２ 双 向 电泳 的 主 要技 术 步 骤
２ １ 样 品制备 ．
点聚焦 时 由于各 种蛋 白等 电点 的不 同 ， 高 电压 在 场 的作用 下 ， 白质 在 ｐ 梯 度 胶 中移 动 ， 到 蛋 Ｈ 直
３ 攀 枝 花市 食 品与 药 品 监督 管 理 局 ，四 川 攀 枝 花 ．
［ 摘
要 ］ 当今 生命科 学研 究的热 门领域 蛋 白质 组 学研 究 中 ， 向电泳技 术是 分 离检 测 细胞 、 在 双
细胞 系、 器官和组织的 总蛋 白质组 的最有 效的方法． 双向 电泳技术是根据蛋 白质等 电点和分子 量 两个相互独立 的参数 ， 在相互垂直 的两个方 向进行 二 次 电泳 的过 程 ， 主要 步骤 包括 样品 制备 、 其
质． 目前 ＩＧ—Ｄ Ｌ Ｐ Ａ Ｔ已 经取 代 其 他 两 者 成 为 等
点聚焦 的主要 手段 ． 的优势 在 于 ：Ｈ 梯度 稳 它 ｐ
定， 聚焦 准确 ， 度高 ； 阴极 漂移 及碱 性 蛋 白丢 精 无 失的现象 ； 白上 样 量 大 ， 以提 高低 丰 度 成分 蛋 可
蛋 白几乎是 不 可 能 的． 根据 实验 要 求 的 不 同 ， 可 按各 种属性 将蛋 白分别 提取 ， 比如 Ｍｏ ｏ ｌｙ等 用 ｌ ３种 分别 适 合 溶 解 高 、 、 亲 水 性 蛋 白质 的裂 中 低
［ 收稿 日期 ］０ ０— ８—１ ２１ ０ ５
的提取 ， 可在样 ຫໍສະໝຸດ 中加入蛋 白酶抑制 剂 以 防蛋 白
质 水解 ， 在样 本 处理 中尽 量 富集 低 丰度 蛋 白 ， 并 采用 灵 敏度较 高 的银 染或荧 光染 色．
２ ２ 电泳 （Ｅ ／ Ｄ Ｐ Ｇ ． Ｉ Ｆ Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ） 电泳 包 括 ＩＦ ＩＧ 胶 条 的 平 衡 和 Ｓ Ｓ一 Ｅ 、Ｐ Ｄ
少 蛋 白扩散 ； 直 电泳 则 可 同 时跑 多 块 胶 ， 垂 有
１ 双 向电 泳 的原 理 和 方 法
双 向电泳 技 术 是 根据 蛋 白质 等 电点 和分 子 量两个 相互独 立 的参 数 ， 在相 互 垂直 的两 个方 向
利 于应用 计算机 割点 并进行 平行 差异 分析 ， 大 大 提高 效率 ． 现在 国 内大 多数实 验室 所用 的都 是垂
解 液分 步提取 大肠 杆菌蛋 白质 ． 于低 丰度 蛋 白 对
的分 辨 效 果 ； 品 中盐 的干 扰 少 ， 边 缘 效 应 ； 样 无 ｐ 梯 度和分 离 结 果 的重 复 性 好． 二 向 Ｓ Ｓ～ Ｈ 第 Ｄ
ＰＧ Ａ Ｅ电泳只有 垂直 和水 平 两种 形 式 ， 平 电泳 水 可 防止凝胶 在染 色过程 中变形 ， 因为凝 胶厚度 减 小（ 可至 ０ ５ｍ ， ． ｍ） 获得 的蛋 白点 的分辨率 较高 ， 而且 可 以应 用较高 电压 ， 短 了 电泳 时 间从 而减 缩
液成 分 同时溶 解 并提 取 所 有 不 同来 源 的样 本 的
进 行第二 次分离 ． 第一 向等点 聚焦有 ３种常 见 的方法 ： 固相 非
的 ＩＯ—Ｄ Ｌ 、 相 的 ＩＧ—Ｄ Ｌ Ｓ ＡＴ固 Ｐ Ａ Ｔ和 非平 衡 的 Ｎ ＰＧ ． 中 Ｎ Ｐ Ｇ Ｅｈ Ｅ 其 Ｅ ｈ Ｅ主 要 用 于分 离 碱 性 蛋 白
电泳、 凝胶 染 色和 图像分析． 本文就双 向电泳的步骤 、 术特 点、 陷和发展前 景进行 简述． 技 缺
［ 关键词 ］ 白质 组 学 ， 蛋 双向 电泳 ；等点聚 焦 ［ 中图分 类号 ］ ８ ［ Ｑ １ 文献标 志码 ］ ［ Ａ 文章 编号 ］６ ３— ０ ２ ２ １ ） ５— ０ ６— ３ １７ ８ １ （０ ０ ０ ０ ６ ０
取 得不 同 的 位 置 ； 后 再 根 据 蛋 白分 子 量 的 不 然 同 ， Ｓ Ｓ一烯 酰 胺 凝胶 电泳 （ Ｄ 在 Ｄ Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ 中 Ａ Ｅ）
样 品制 备是 双 向电泳 的关 键 ， 主要 包括 蛋 白 溶解 、 变性 、 原等 步骤 ， 还 去除盐 离 子 、 色素 、 酚类 和核酸 等非 蛋 白物质 ， 以保 证 顺 利 电泳 ． 本 预 样 处 理 的重点在 于 提 高 难溶 蛋 白 的溶解 度 以及 去 除看家 基 因的表 达 产 物对 低 丰 度 蛋 白的掩 盖 作 用． 现在 已有 提取 不 同组 份 蛋 白的试 剂 盒 ， 高 提 了样 品处理 效率 和重 复性 ， 蛋 白质 的种 类及 特 但 性千 差万 别 ， 以要 想 用 一 种 “ 准 ” 样本 溶 所 标 的
０ｃ．． ２ ０ ｔ ０１
Ｖ０． ９ Ｎｏ ５ Ｊ２ ．
蛋 白质 组 学研 究 的有 效 工具 — — 双 向 电泳 鉴定 技 术
张
（． １ 攀枝 花 学 院 生 物与 化 学 工 程 学 院 ，四 川 攀 枝 花
颖 ， 杨
舸
６ ７０ １００； ６ ７０ １００）
６ ７０ ２ 攀 枝 花 学 院 生物 与 化 工 研 究 所 ，四 川 攀 枝 花 １００； ．
２１ ００年 １ ０月 第２ ９卷 第 ５期
重 庆 文 理 学 院学 报 （ 自然科 学 版 ）
Ｊｕｎ ｏ ｈ ｎ ｑｎ ｎｖ￣ｉ ｆ ｒ ｎ ｃｅ ｃ ｓ（ ａｕａ Ｓ ｉ ｃ ｄｔ ｎ ｏ ｒ￣ ｆ ｏ ｇ ｉ Ｕ ｉｅ ｔ ｏ ｔ ａ ｄＳ ｉ ｅ Ｎ ｔｒ ｃｅ ｅＥ ｉｏ ） Ｃ ｇ ｙ Ａ ｓ ｎ ｌ ｎ ｉ
［ 作者简介］ 张颖（ ９ １ ， ， 庆永 川人 ， １ ８ 一） 女 重 讲师 ， 士研究生 ， 硕 主要从 事微生物学方面的研究
ＰＧ Ａ Ｅ三个 主要 步骤 ． 了保 证 良好 的 电 泳 重 复 为 性， 目前 一般 实验室 Ｉ Ｆ通 常都 使 用 商业 化 的 预 Ｅ