Agela液相色谱技术介绍色谱柱使用

2
4
6
8
10
12
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Atlantis T3 pH5.8
1.704 2.502
2.821 3.470
7.732
13.715
8 min
14
min
VWD1A, 波长=254nm(水溶维生素2\选择性测试30度低PH\ODS-AQ_000001.D) mAU
800
2.870
700
600
500
-R -OH -O- H+
目标物A、B
反相作用 氢键作用 弱离子交换作用
固定相
反相作用 氢键作用 弱离子交换作用
流动相
甲醇 /乙腈
水
缓冲盐溶液
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pH对分离的重要影响
10
O
9
RCOH
8
7
6
k’ 5
4
调节ph值对样品的 分离非常有效
3
2 1
0 2
pH = pK
4
6
pH
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弱碱
2.754
2.424
400
300
200
1.697
100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
YMC ODS-AQ pH2.6
7.734
VWD1A, 波长=254nm(水溶维生素2\选择性测试30度低PH\菲罗门_000003.D) mAU
800
2.617
700
600
2.159
500
2.511
400
300
200
1.487
α =1.50
•容量因子（k）对分离度（R）的影响
R
n 4



1



1
k
k

k tR' tM
容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大 延长。因此，k的最佳范围是1<k<20。
改变容量因子的方法有： •减小柱死体积 •改变柱温 •改变流动相的配比 •梯度洗脱
VWD1A, 波长=254nm(XBP-C18-2\选择性30摄氏度\2607_000001.D) mAU
500
1.774 2.8342.550
7.237 10.963
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
10
12
MP C18(2) pH5.8
8
min
VWD1A, 波长=254nm(水溶维生素2\选择性测试30度低PH\亚特兰蒂斯_000002.D) mAU
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双层表面处理技术
减低硅胶表面硅羟基的活性 第13页/共49页
中等pH下良好的分离能力
色谱柱：C18，5μm，4.6×250mm， 样品：吗啡、可待因，脱氢吗啡的分离，流动相:乙腈-25 mM乙酸钠缓冲液（ pH 3.5）= 10：90，
色谱柱A，硅羟基pH=3.5
流动相pH=3.5，未能抑制硅羟基的活性 二次保留严重
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碱性化合物阿米替林在不同pH下保留时间的变化
.1764 .2549
.2867 .3559
.7558
VWD1A,波长=254nm(水溶维生素2\选择性测试30度低PH\2708_000001.D) mAU
800
700
600 500
400
300 200 100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
MP C18(2) pH2.6
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Atlantis T3 pH2.6
VWD1A, 波长=254nm(XBP-C18-2\选择性30摄氏度\WATERS-亚特兰蒂斯_02.D) mAU
500
2.543 2.884
400
300
200
7.901
1.728
100
14
min
0
0
色谱分离基本方程
HPLC柱的 “色品”表达
式
R
n 4


wk.baidu.com

1



1
k
k

提高分离度R，需要分别增大n，α，k值
n：柱效，易受柱长、填料粒径的影响 α：选择性，易受流动相和固定相影响； k：保留因子，受固定相和流动相的影响
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•柱效（n）对分离度（R）的影响
物理因素 化学因素
6
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硅胶制作工艺
Aggregation
Polymerization
堆砌法硅胶 Innoval、UHP、Bonshell 优点：高机械强度，耐污染 共聚法硅胶 Venusil、Durashell 优点：分离效果佳
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硅胶基质反相色谱分离三要素
疏水部分（链烃和芳香烃） 羟基、氨基 离子化基团
弱酸
O RCO
8
色谱柱固定相稳定性
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Agela 色谱柱最佳pH适用范围
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中等pH下使用 C18
Venusil MP C18 (2), 孔径110Å 特点：亲水性、通用性、 良好分离能力
100
0
8
min
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Hydro RP pH2.6
VWD1A, 波长=254nm(XBP-C18-2\选择性30摄氏度\ODS-AQ_000001.D) mAU
500
VWD1A, 波长=254nm(XBP-C18-2\选择性30摄氏度\菲罗门_000002.D) mAU
500
16.459 1.505
2.5672.191 9.468
1.729 2.8322.474
7.922
400
400
300
300
200
200
100
100
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
min
0
YMC ODS-AQ pH5.8
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α k' N 如何控制分辨率?
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影响色谱柱性能的因素
色谱柱与色谱填料的特性
1、 柱填料 • 硅胶纯度 • 粒径（及粒径分布） • 比表面积 • 孔径
2、 色谱柱的构型 • 色谱柱直径 • 色谱柱长度
3、 固定相 • 键合类型 • 残余硅羟基的影响 • 反相键合相的保留行为 • 键合硅胶的稳定性
“高富帅”
以上两张谱图k, α值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它 们具有不同的分离度。
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•分离选择性（α）对分离度（R）的影响


tR' 2 tR' 1
α =1.04
α =1.35
改变分离选择性α的方法
• 改变固定相 • 改变流动相pH值 • 改用不同的流动相 • 改变柱温
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Venusil MP C18（2），硅羟基pH=5.2
流动相pH=3.5，能充分抑制硅羟基的活性 抑制了二次保留效应
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100%水流动相的兼容性
样品：尿苷 色谱柱：4.6*150mm,5μm 流动相：100%水 流速：1mL/min 温度：30℃