几种木本果树DNA的有效提取
果树基因提取实验报告
一、实验目的1. 了解果树基因提取的一般原理和方法。
2. 掌握从果树组织中提取DNA的操作步骤。
3. 熟悉DNA提取过程中的质量控制与评估。
二、实验原理DNA是生物体内的遗传物质，具有稳定的结构和独特的功能。
提取果树DNA是为了后续的分子生物学研究，如基因克隆、基因表达分析等。
本实验采用常规的CTAB法进行果树DNA提取，该方法具有操作简便、提取效率高、DNA纯度较好的特点。
三、实验材料1. 果树叶片：选取成熟、无病虫害的叶片作为实验材料。
2. CTAB提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA、2% CTAB。
3. 95%乙醇：分析纯。
4. 70%乙醇：分析纯。
5. DNA分子量标准：50ng/μL。
6. 灭菌蒸馏水。
7. Eppendorf离心机。
8. 微量移液器。
四、实验步骤1. 样品制备：取新鲜果树叶片，用液氮迅速冷冻，然后用研钵和研杵进行研磨，直至叶片成粉末状。
2. DNA提取：a. 将研磨好的叶片粉末转移到1.5mL离心管中，加入600μL CTAB提取缓冲液；b. 65℃水浴30min，期间不时振荡；c. 取出离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分振荡混匀；d. 12,000r/min离心5min，取上清液；e. 加入等体积的95%乙醇，混匀，静置5min；f. 12,000r/min离心5min，弃去上清液；g. 用70%乙醇洗涤DNA沉淀，12,000r/min离心5min，弃去上清液；h. 将DNA沉淀晾干，用50μL灭菌蒸馏水溶解。
3. DNA纯度检测：取2μL DNA样品，加入2μL 1×Loading Buffer，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果：DNA样品在琼脂糖凝胶上呈现清晰、明亮的主带，说明DNA提取成功。
2. DNA纯度评估：通过比较DNA样品与DNA分子量标准的电泳条带，可以初步判断DNA纯度。
两种木本植物DNA提取方法的对比研究
两种木本植物ＤＮＡ提取方法的对比研究摘要：以红豆杉和银杏叶为材料，采用CTAB法和SDS法红豆杉和银杏基因组DNA的提取进行了研究，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测，将它们在 DNA产量、质量等方面的优缺点进行总结，所提取得到的基因组DNA中蛋白质、多糖、脂质、多酚以及RNA等去除较彻底，适于RAPD、ISSR、AFLP以及SSR分子标记等进一步分析研究。
也为进一步从基因组文库中克隆目的基因、木本植物DNA文库的建立等生物学研究打下基础。
关键词：木本植物；DNA；提取Abstract: Taxus and a ginkgo leaf as material, Using CTAB and SDS Taxus and ginkgo genomic DNA from the study, by UV spectrophotometer and agarose gel electrophoresis detection, contrast the quality and the advantages and disadvantages, The extracted genomic DNA proteins, polysaccharides, pigments, lipids, RNA and other polyphenol and removed thoroughly, It’s suitable for RAPD, ISSR, AFLP and SSR markers further analysis and study. For further from the genomic library cloned gene, DNA library of Xerophytes such as the establishment of laying a foundation for biological research.Key words:Xerophytes，DNA，ExtractionDNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。
月季ITS反应体系的优化
月季ITS反应体系的优化第28卷第6期2009年12月华中农业大学JournalofHuazhongAgriculturalUniversityV o【_28No.6Dec.2009,756～758月季lTS反应体系的优化张慧D唐开学邱显钦'蹇洪英王其刚张颢(云南农业大学园林园艺学院,昆明650201;云南省农业科学院花卉研究所,昆明650205)摘要以古老月季品种'玉玲珑'为试材,利用CTAB法对月季进行总DNA提取,对其PCR扩增条件中的主要因素进行了多梯度的优化,总反应体系为25L,其中引物浓度为0.4/~mol/I,M 浓度为2.0mmol/L,dNTP为0.2mmol/L,Taq酶用量为1.0U,DNA模板用量为70ng.利用该优化体系对部分月季品种和野生种进行PCR扩增和电泳检测,扩增条带清晰,结果稳定,测序结果理想,表明该体系适用于月季的ITS序列分析.关键词ITS;月季;优化中图法分类号S685.120.353文献标识码A文章编号1000—2421(2009)06—075603 月季(RosahybridaI.)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(RosaI.)植物,蔷薇属又分为Hulthemia,Hesperhodos,Platyrhodon和Eurosa等4个亚属,约有2OO多个种和变种,广泛分布于亚,欧,-IL:II~,北美等寒温带至亚热带地区l1].蔷薇属植物种类繁多,来源广泛,加上频繁的种内杂交,其种质资源复杂多样,使分类和鉴定工作难度加大l2..近年来,核糖体DNAITS序列已作为重要的分子性状用于种问的系统学研究.研究表明ITS在研究属内种问,属问关系都表现出较高的趋异率和信息位点百分率,为类群内部的系统重建提供了较好的支持[4].ITS是基于基因序列的分子标记, 基因组DNA的提取和纯化是整个工作的基础[6.]. 本试验对提取DNA的方法进行改良,同时对PCR 反应体系进行了优化,得到了稳定,高含量的PCR 扩增产物,旨在对蔷薇属植物来源的DNA模板扩增提供重要参考.1材料与方法1.1试验材料的采集与处理月季样品采自于云南省农业科学院花卉研究所资源圃,将新鲜叶片放人20℃冰箱备用.1.2方法1)DNA的提取.在总结前人对月季进行DNA提取的经验基础上,用改良的CTAB法l8.ll进行总DNA的提取,提取的DNA的质量和浓度采用琼脂糖胶电泳和紫外分光光度计测定,最后把样品稀释到20ng//xI.2)PCR扩增反应体系及程序.PCR扩增在PTC-100型DNA扩增仪上进行.所用引物序列为P4:5一TCCTCCGCTTATTGA TATGC一3;P5:5一GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG一3,Taq 酶,dNTP购自上海生T生物工程技术服务有限公司.反应体系为25L.反应程序为:第1阶段: 95℃,预变性,5min;1个循环;第2阶段:95℃,变性30S;55℃,退火3OS;72℃,延伸,1.5min;35个循环;第3个阶段:72℃后延伸10min;终止反应,4℃保存.3)ITS扩增片段的检测.扩增的PCR产物经1.0琼脂糖凝胶(含花青素)电泳检测,用全自动紫外与可见分析装置进行凝胶成像.2结果与分析2.1Mg浓度Mg.的浓度对PCR反应的特异性和扩增效率有很大影响,反应体系的Mg+用量是决定PCR扩增反应成败的关键因素之一.在25L反应体系中设6个Mg.浓度梯度:1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0mmol/I(图1).收稿日期:20081108;修回日期:20090622*国家自然科学基金项目(30660117),国家高技术研究发展计划项目(2006AA100109)和云南省科技计划项目(2006NG14)资助**通讯作者.E-mail:**********************.cn张慧,女,1984年生,云南农业大学园林园艺学院硕十研究生,昆明650201.E—mail:huihui一**************.cn第6期张慧等:月季ITS反应体系的优化图1不同Me..浓度的PcR扩增结果Fig1ElectrophoresisresultofdifferentMgconcentration泳道l～6:分别为Mg..浓度1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0mmol/LIanel～6:Mgconcentration:1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0mmol/[从图1可见,Mg计浓度在1.0～1.5mmol/L时扩增产物很少,Mg+浓度在2.0～2.5mmol/I时有特异性条带出现,且浓度在2.0mmol/I时扩增产物条带亮且清晰,在3.O～4.0mmol/L时扩增产物不清晰.试验结果表明,Mg浓度在2.0mmol/I时为宜.2.2dNTP浓度dNTP是提供扩增所需要的原料,设5个浓度梯度:1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mmol/I(图2).从图2可见,dNTP浓度在1.0,1.5,2.5,3.0mmol/I时扩增产物很少,在2.0mmol/L时'增条带亮且清晰.试验结果表明,2.0mmol/I的dNTP浓度可满足反应要求.图2不同dNTP浓度的POR扩增结果Fig2Electr0DhOresisresultofdifferentdNTPconcentration 泳道1～6:分别为dNTP浓度1.0,l_5,2.0,2.5,3.0mmol/I Iane1～61dNTPconcentrationl_01.5,2.0,2.5,3.0mmol/l 2.3Taq酶的用量PCR所需Taq酶的用量对反应有一定的影响.在25肚I反应体系中,设了5个Taq酶的用量梯度:0.25,0.5,1.0,1.5,2.0U(图3).从图3可见,Taq酶用量在0.5,1.0,1.5,2.0U时均有扩增产物条带出现,但Taq酶用量在0.5U时出现非特异性条带;当增大q酶用量为1.5～2.0U时扩增条带产物反而减少;而在1.0U时,扩增条带最清晰.故本试验选择1.0U为反应的Taq酶用量.图3不同Taq酶浓度的PCR扩增结果Fig3EIectr0Dh0resisresultofdifferentFaqDNA polymeraseamount泳道l～5分别为:Taq酶0.25,0.5,1.0,1.5,2.0ULane 1～5:TaqDNApolymeraseamount0.25,0.5,1.0,1.5,2.0U 2.4DNA模板用量DNA模板使用量也是影响PCR产物扩增的重要因素,DNA浓度过低产物的量少或无扩增产物;浓度过高会产生非特异性条带.在25I反应体系中选用8个DNA模板用量梯度:30,4O,5O,6O,70,80,90,100ng.从图4可见,DNA用量在3O～40ng时几乎无扩增产物,在5O～70ng时有条带,但在70ng时条带最清晰,DNA用量在8O～100ng时也几乎无扩增产物.因此,选用的模板DNA用量以70ng为宜.图4不同DNA模板用量的PCR扩增结果Fig4ElectrophoresisresultofdifferentDNAtemplateamount泳道l～9分别为:DNA模板用量30,40,50,6O,70,80,90,100rigI.anel～9:DNAtemplateamount30,40,50,60,70,80,90.100ng2.5优化条件组合的PCR扩增结果采用上述优化条件对10份月季材料进行PCR扩增,以检测该月季ITS反应体系的适用性.结果如图5所示,在750bp处10份材料均有一明亮的DNA带,与预期大小一致.这表明优化确立的ITS-PCR反应体系稳定可靠,可用于月季的ITS序列分析.3讨论PCR扩增条件中Mg浓度,Taq酶用量,dNTPs浓度和样品DNA模板用量等均会影响758华中农业大学第28卷l234567891oM图5不同月季品种和野生种的POR扩增结果Fig.5EIectroDhOresisresultofdifferent rosecultivarsandspecies泳道1～1O分别为:玉玲珑,青莲学士,绿萼,映El荷花,木香花,黄刺枚,香水月季,好莱坞,花车,糖果条Lane1～10:Rosa'Yulin glong'.Rosa'Qinglianxueshi'.Rosa'Viridiflora'.Rosa'Yingrihe—hua',R.banksiae,R.xanthina,R.odorats,Hollywood,Hanaguruma, CandyStripePCR扩增结果.其中,Mg.的浓度影响着TaqDNA聚合酶的反应活性;Mg的另一个作用是和DNA模板结合,屏蔽DNA分子表面的电荷,防止其由于相互凝集而沉淀.Taq酶用量过多会导致非特异性产物增加,用量过少会导致扩增产物量不足.dNTPs提供扩增所需原料,dNTPs浓度过高,可能造成非靶序列启动和延伸时核苷酸的错误掺人,还会抑制Taq酶的活性;浓度过低,则会影响扩增产量.DNA模板的用量也是影响PCR扩增的重要因素,DNA浓度过高或过低都会使PCR扩增无条带产生.因此对反应体系中各因子进行优化组合是决定PCR扩增反应成败的关键.参考文献[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志第三十七卷[M].北京:科学出版社,1985:360—455.[2]TIRRESAM,MIIIANT,CUBEROJI.Identilyingroseeul—tivarsusingrandomamplifiedpoiymorphicDNAmarkersEJ]. HortScience,1993,28(4):333—334.E37REYNDERS-ALOISIS,BOLLEREAUP.Characterizati0nof geneticdiversityingenusRosabyrandomlyamplifiedpolymor—phicDNA[J].ActaHortculturae,1996,424:253—259.r4]SCHWARBACHAE,RICKLEFSRE.Systematicaffinitiesof Rhiz0phoraceaeandintergenericrelationshipswithinRhizo—phoraceae,basedonchloroplastDNA,nuclearribosomalDNA, andmorphology[J].AmericanJournalofBotany,2000(87): 547564.[5]STANFORDAM,HARDENR,PARKScRPhylogenyandbio—gepgraphyofJugland(Juglandaeeae)basedonmatKandITS8e—quence_J].AmericanJournalofBotany,2000(87):872—882.[6]邹利波,黄升谋.月季总DNA提取方法的比较研究[J].安徽农学通报,2007,13(1):5758.[7]余晓丽,范喜梅,曾万勇,等.黄刺玫基因组DNA提取方法的研究『J].西北农业,2007,14(4):272274.[87张英,黄明辉,杨梦苏,等.植物基因组DNA提取方法学评析与验证[J].药品评价,2004,1(4):292298.[9]裴杰萍,端青.DNA提取方法的研究进展口].微生物学免疫学进展,2004,32(3):76—78.[1O]罗玉兰,张冬梅,杨娅.红刺玫DNA提取及SSR引物筛选[J].同林科技,2007(1):15-16.[11]运江,伊华林,庞晓明,等.几种木本果树DNA的有效提取_J].华中农业大学,2001,20(5):481—483.OptimizationofITS—PCRinRoseZHANGHui"TANGKai—xueQ1UXian-qine'JIANHong-yinge'WANGQi-gangeZHANGHao2 ("CollegeofLandscapeandHorticulture,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming65020 1,China;FlowerResearchInstitute,YunnanAcademyofAgriculturalSciences,Kunming650205,Ch ina)AbstractDNAofroseYulinglongwasextractedwithCIAB.PrincipalfactorsofPCRhaddiffe rentcon—centrationsandtheirvariationchangedtheresultofITS—PCRFactorsaffectingtheITSresultsofrosewere studiedandthebestreactionsystemofITS—PCRwgts:0.4umol/Lofeachprimer,2.0mmol/L+,0.2mmol/LofdNTPs,1.0UofTaqDNApolymeraseand70ngtemplateDNAin25ffLreactionsy ingabovePCRsystem,ITSfragmentsofsomerosecultivarsandspecieswereobtained.Thecleari tyandstabilityof amplificationindicatedthissystemwassuitableforanalyzingITSsequencesinroses. KeywordsITS:rose:optimization(责任编辑:杨锦莲)。
3种植物DNA提取法中多糖类物质去除效果的研究
3种植物DNA提取法中多糖类物质去除效果的研究高洪晓;杨凯;刘建斌【摘要】To find an efficient method for the removal of polysaccharide in plant DNA extract process, the CTAB, high salt and Chlorobenzene methods were used to extract the genome DNA of three Syringa plants. Agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometer methods were adopted to test the DNA quality, and the concentration changes of polysaccharid in the DNA extraction process were tested with anthraquinone hydrate-sulfuric. The result showed that the removal efficiency of polysaccharide in the three methods were similar. The highsalt method was safer and convenienter than the other two methods. The influence of polysaccharide in the high salt methods was removed in a special step. The result provided theoretical basis for the removal of polysaccharide in plant DNA extraction process.%为探明DNA提取过程中去除多糖的有效方法,以丁香属3种植物为材料,用3种DNA提取方法(普通CTAB法、氯苯法和高盐法)提取丁香属植物基因组DNA.对提取的DNA质量采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法进行检测,并采用蒽酮硫酸法测定DNA提取过程中多糖含量的变化.结果表明:3种方法的多糖去除率相近且都比较高.高盐法与前两种方法相比对人体和环境危害较小且操作简单,是最适合该属植物的DNA提取方法.该方法采用了专门的去除多糖的步骤,为DNA提取过程中多糖的去除提供了一定的理论依据.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2011(026)001【总页数】3页(P70-72)【关键词】多糖;DNA;高盐法【作者】高洪晓;杨凯;刘建斌【作者单位】北京农学院,园林学院,北京,102206;北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室,北京,102206;北京农学院,园林学院,北京,102206【正文语种】中文【中图分类】S685.26多糖作为植物细胞的结构组成物质和营养储存物质在植物细胞中大量存在[1]。
一种木本果树基因组DNA提取方法研究
收稿日期:1997201229①国家自然科学基金和浙江省自然科学基金资助项目一种木本果树基因组D NA 提取方法研究①陈大明 张上隆 金勇丰(浙江农业大学园艺系,杭州310029)摘 要 研究了一种可有效排除细胞内多酚类等杂质污染的简便、快捷、经济的果树基因组DNA 提取方法Λ其改良策略是:在细胞核被裂解前去除细胞质中的多酚类等杂质,防止多酚类物质被氧化,从而排除多酚类等杂质的干扰Λ利用这一方法提取的柑桔、枇杷、梨、苹果、湖北海棠、桃、樱桃等7种果树基因组DNA 均能被限制性内切酶完全消化,获得理想的Southern 杂交结果,也可作为PCR 模板应用,成功地进行特异性基因扩增和RA PD Λ关键词 木本果树;基因组DNA 制备;多酚类杂质中图分类 Q 523;Q 781;S 666;S 661Chen D am ing ;Z hang S hang long ;J in Y ongf eng (D ep art m ent of H orticu ltu re ,Z hej iang A g ricu l 2tu ral U niversity ,H ang z hou 310029,Ch ina )A m ethod for geno m ic D NA preparation of woody fruit crops 1Journal of Zhejiang A gricultural U 2niversity ,1997,23(6):621～624Abstract Extracti on of genom ic DNA from w oody fruit crop s has been modified based on the rice genom ic DNA extracti on p rocedure 1T he modificati on is to remove mo st of the cytop las m ic components p ri o r to lysis of the nuclei by SD S and to inh ibit the fo r m ati on of oxidized po lypheno lic compounds 1W ith the modified m ethod ,the genom ic DNA samp les p repared from citrus ,app le ,pear ,crabapp le ,peach ,cherry and loquat are suscep tible to digesti on w ith restricti on endonucleas 2es and ready to be used as temp lates fo r po lym erase chain reacti on (PCR )1Key words w oody fruit crop s ;genom ic DNA extracti on ;po lypheno lic compounds 制备能被限制性内切酶完全酶解并可用作PCR 模板的基因组DNA ,是开展果树分子生物学研究工作的基础Λ我们在开展果树分子生物学研究之初,采用常规的制备方法[1～4]未能取得成功Λ制备出的DNA 样品呈棕褐色,不易被内切酶所消化,也不能作为PCR 模板;进一步采用各种纯化方法如多次酚2氯仿抽提和Sepharo se 柱层析等处理,DNA 样品亦未达到所要求的质量水平Λ随基因组DNA 一起分离出的棕褐色物质,被认为是一种或几种被氧化的多酚类物质,它们与DNA 发生了不可逆的相互作用,影响基因组DNA 质量[5,6]Λ 本方法是在湖北海棠基因组DNA 提取过程中发展起来的,随后应用于梨、苹果和柑桔等6种果树,均获得了高质量的基因组DNA 样品Λ本方法主要建立在水稻基因组DNA 提取方法[1]的基础上,改良策略是:利用活细胞中由于细胞区室化多酚类以及其它浙江农业大学学报 23(6):621～624,1997 Journal of Zhejiang A gricultural U niversity 杂质与DNA相互隔离的特性,在裂解细胞核前去除细胞质中大多数生化成分,同时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰的目的Λ1 材料与方法111 材 料11111 植物材料 柑桔(温州蜜柑)、辽伏苹果、沙梨(绿云)、野生湖北海棠、大观1号桃、樱桃、大红袍枇杷实生苗等果树新梢茎尖上的幼叶Λ11112 主要试剂 提取缓冲液(014m o l L葡萄糖、3%可溶性PV P、10mm o l LΒ2巯基乙醇),裂解缓冲液(100mm o l L T ris1C l, pH810,20mm o l L ED TA,015m o l L N a2C l,115%SD S),氯仿2异戊醇2乙醇(80∶4∶16)溶液Λ112 方 法11211 基因组DNA提取 称取果树幼叶约1g,在陶瓷研钵中加液氮研磨成粉状后立即倒入2m l提取缓冲液,继续研磨至糊状,移入5m l离心管中,4℃下10000g离心10m inΛ弃去上清液后重新加入2m l提取缓冲液悬浮沉淀,以同样条件离心10m in,弃去上清液Λ用2m l经65℃预热的裂解缓冲液悬浮沉淀,在65℃水浴中温育30～60 m in,不时轻轻摇动Λ加入2m l氯仿2异戊醇2乙醇溶液,轻轻颠倒混匀,室温下静置10 m in,4℃下10000g离心10m in,小心地将上清液移入新的5m l离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀,室温放置15m in,此时出现絮状DNAΛ用玻棒钩出DNA絮团,在无菌滤纸上吸干,转入含015m l T E缓冲液的115m l离心管中Λ加入RN ase(无DN ase)酶液至终浓度为10Λg m l,37℃处理10m inΛ加入等体积的酚2氯仿溶液,轻轻混匀,在室温下静置10m in,4℃下12000g离心10m inΛ上清液移入新的离心管中,加入1 10体积的3m o l L N aA c(pH512)溶液,混匀后加入2倍体积的冰的100%乙醇,颠倒混匀,-20℃放置30m in,DNA形成絮状沉淀Λ钩出DNA絮团,在70%乙醇中漂洗,无菌滤纸上吸干,重新溶解于500Λl T E缓冲液中Λ-20℃保存Λ11212 电泳分析 取3Λl DNA样品在017%琼脂糖凝胶上电泳,溴化乙锭染色,紫外灯上观察和拍照Λ11213 紫外分光光度计分析 取15Λl DNA稀释20倍,在岛津UV2V IS R eco rding Sp ectrop ho tom eter上测定A260和A280值Λ11214 限制性内切酶酶切反应 20Λl反应系统中,DNA样品5Λg,限制性内切酶5单位Λ37℃,过夜Λ11215 Sou thern杂交 采用标准方法[4]Λ探针为本实验室从拟南芥菜中分离到的L FY基因3′端414bp片段,采用PCR法标记[7]Λ11216 PCR 桃A CC氧化酶基因特异性扩增,100Λl PCR反应体系(10mm o l L T ris,pH813,50mm o l L KC l,215mm o l L M gC l2)中,桃基因组DNA50ng,3′和5′端A CC氧化酶基因特异性引物各012Λm o l L,4种dN T P浓度各为200Λm o l L, 215单位T aq DNA聚合酶Λ热循环条件为94℃60s,57℃90s,72℃150s,共30轮循环ΛRA PD所用10聚体随机引物序列为5′2CCTCCTCCCT23′,25Λl反应体系中, DNA模板浓度为25ng,引物浓度012Λm o l LΛ热循环条件为94℃60s,38℃120 s,72℃120s,共45轮循环Λ2 结果与分析 本方法提取的7种果树基因组DNA均呈无色,大多数多酚类物质已被去除Λ从图1226浙江农业大学学报 23卷 可见,所提取的7种基因组DNA 片段大小大于30kb ,无大量降解情况,RNA 去除较为干净Λ紫外分光光度计分析结果表明,本方法的DNA 提取产量在250Λg g 鲜重叶片以上,A 260 A 280值在117左右(表1)Λ图1 7种果树基因组D NA 样品电泳分析F ig 11 A garo se gel electropho resis analysis of the ge 2nom ic DNA samp les from citrus (lane 2),ap 2p le (lane 3),pear (lane 4),crabapp le (lane 5),peach (lane 6),cherry (lane 7)and loquat (lane 8)1L ane 1is ΚDNA EcoR I +H ind III m arkers 1 7种果树基因组DNA 能被限制性内切酶完全消化Λ图2(A )为EcoR I 酶切结果,可见酶解完全Λ以拟南芥菜L F Y 基因3′端414bp 片段作为探针,获得了理想的Sou thern 杂交结果(图2之B ),进一步说明了限制性内切酶酶解的完全性Λ 以桃基因组DNA 作为模板,成功地从中扩增出了112kb 的A CC 氧化酶基因(图3之2)Λ7种果树基因组DNA 作为模板,用10聚体随机引物进行PCR (RA PD )获得了典型的RA PD 结果(图3之3～9)Λ图2 果树基因组D NA 的EcoR I 酶解产物电泳(A )和Southern 杂交结果(B )F ig 12 A 1EcoR I digesti on of the genom ic DNA sam 2p les from citrus (lane 2),app le (lane 3),pear (lane 4),crabapp le (lane 5),peach (lane 6),cherry (lane 7)and loquat (lane 8)1L ane 1isΚDNA EcoR I +H ind III m arkers 1B 1South 2ern blo t analysis of the genom ic DNA from pear ,app le ,crabapp le ,and citrus ,p robed w ith a clone of 414bp fragm ent at 3′ter m inus of the L F Y gene of A rabidop sis 1L ane 1～3,pear genom ic DNA samp le digested w ith BamHI ,EcoR I and H ind III ,respectively 1L ine 4～6,the genom ic DNA samp les from app le ,crabapp le and citrus digested w ith EcoR I 1表1 7种果树基因组D NA 样品的紫外分光光度计分析T able 1 A nalysis of the genom ic DNA samp les from the woody fruit crop s by UV spectropho tom eterDNA 样品DNA Samp les柑桔C itrus 苹果A pp le 梨Pear 湖北海棠C rabapp le 桃Peach 樱桃Cherry 枇杷L oquat A 26001781012530159101293013670129001224A 28001454011510134901176012140116801135A 260 A 28011720116751169311656117151172611659326 6期 陈大明 一种木本果树基因组DNA 提取方法研究图3 7种果树基因组D NA作为PCR模板F ig13 T he genom ic DNA samp les from the seven fruitcrop s are used as PCR temp lates successfully1L ane1,ΚDNA EcoR I+H ind III m arkers1L ane2,112kb fragm ents of the A CC oxidasegene from the peach genom ic DNA1L anes3～9,RA PD from the genom ic DNA extractedfrom citrus,app le,pear,crabapp le,peach,cherry,and loquat,respectively13 讨 论 叶片受伤后,其中的多酚类物质会很快地被氧化1因此,在提取前,叶片的处理十分关键Λ尽可能采用新鲜无损伤的幼叶进行提取Λ如不得不保存,则样品应贮存在液氮或-70℃冰箱中,且在与提取缓冲液接触前,慎防冰冻的样品融化Λ 在裂解细胞核以前,将细胞质中的杂质与细胞核分开,是排除多酚类等杂质污染的有效途径Λ通过调节提取液的渗透势,使之与细胞核内渗透势保持平衡,防止细胞核破裂,以获取较高的DNA得率Λ对于所研究的7种果树来说,提取缓冲液中含有014m o l L 葡萄糖较为合适,DNA得率均在250Λg g 叶片鲜重以上Λ可溶性PV P的用量可视杂质的多少而定Λ除Β2巯基乙醇外,在提取液中加入其它防氧化剂将会提高提取缓冲液的性能Λ 本方法无需昂贵的试剂和复杂、高费用的操作步骤,具有简便、快速、经济的特点,在一般实验室中均能应用Λ致 谢 主要工作在浙江农业大学生物技术研究所农业部植物病理和分子生物学重点开放实验室完成Λ何祖华副教授、许建平讲师给本实验提出了许多宝贵的建议,谨此致谢.参考文献1 卢扬江,郑康乐1提取水稻DNA的一种简易方法1中国水稻科学,1992,6(1):47～482 李希臣,雷勃钧,卢翠华等1高效的植物DNA提取方法1生物技术,1994,4(3):39～41 3 萧顺元,章文才1R FL P在柑桔遗传多态性研究上的应用1果树科学,1995,12(1):1～44 A usubel F M,B rent R,K ingston R E,et a l1 Sho rt p ro toco ls in mo lecular bi o logy13rd editi on1N ew Yo rk:John W iley&Sons,Inc1,1995 5 Couch J A,F ritz P J1Iso lati on of DNA from p lants h igh in po lypheno lics1P lant M o lecular B i2o logy R epo rter,1990,8(1):8～126 张立平,林伯年,沈德绪等1葡萄属植物染色体DNA的提取、纯化及R FL P鉴定1果树科学,1996,13(2):71～727 M ertz L M,R ash tch ian A1PCR radi oactive la2 belling system:A rap id m ethod fo r synthesis ofh igh specific activity DNA p robes1Focus,1994,16(2):45～48(责任编辑 杜玲玲) 426浙江农业大学学报 23卷 。
南方红豆杉基因组DNA纯化
南方红豆杉基因组DNA纯化摘要：以红豆杉叶为材料，采用CTAB法对红豆杉基因组DNA的进行提取，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。
将DNA产量、质量等方面进行总结，发现所提取得到的基因组DNA中蛋白质、多糖、色素、脂质、多酚以及RNA等去除较彻底。
所得产物可用于下一步的研究工作。
关键词：南方红豆杉；DNA；纯化Abstract : Taxus leaves genomic DNA were extracted by CTAB method and detected by UV spectrophotometer and agarose gel electrophoresis. Protein, amylose, pigment, lipid, polyphenol and RNA wiped off thoroughly and we got purify DNA sample that can be used in next research.Key words：Taxus chinensis，DNA，Purification红豆杉是红豆杉科 (Taxaceae)红豆杉属 (Taxus)植物的总称，在中国民间一般称“紫杉”[1]。
自然分布地域很窄、零星，年净生长量很低，80年代末90年代初以来，很多商人曾通过各种途径在资源相对集中的南岭山地高价收购其树皮，再加上本地区盲目性发掘，成千上万株遭到毁灭。
由于红豆杉植物属于世界珍贵稀有树种，资源稀少，且培育困难，故世界上对紫杉醇的需求较旺、货源紧缺。
紫杉醇有“植物黄金”之称，从红豆杉中提炼高纯度的紫杉醇，其价值是黄金的十余倍。
在未来15年至20年时间内，紫杉醇是治疗乳腺癌、子宫癌无可替代的药物。
红豆杉的提取物紫杉醇，紫杉醇是目前世界上治疗癌症的有效新药，尤其对女性乳腺癌和子宫癌有特效[2]。
所以对红豆杉基因组DNA的提取纯化工艺的研究具有重要的理论和应用意义，纯度是衡量红豆杉基因组DNA质量的一个重要标准。
智慧树知到《果树栽培学基础》章节测试答案
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一种从果树成熟叶片提取DNA的方法
一种从果树成熟叶片提取DNA的方法佟兆国;王富荣;章镇;赵剑波;张开春;闫国华;周宇;姜立杰【期刊名称】《果树学报》【年(卷),期】2008(25)1【摘要】针对果树成熟叶片富含多糖、多酚及其它次生代谢物质的特点,以8个果树树种的秋季成熟叶片为材料,采用改进的CTAB法对其基因组总DNA进行了提取,并对得到的DNA进行了电泳检测、含量测定和AFLP分析。
结果表明,该方法从8种果树的成熟叶片中均能提取出基因组总DNA,且DNA的纯度和完整性都较好,D260nm/D280nm的比值均在1.8～2.0之间,无降解现象,RNA去除干净,能被限制性内切酶完全消化;其AFLP分析(引物组合为EcoRI-TA/MseI-CTT,EcoRI-TT/MseI-CTT)条带清晰,多态性好,说明此方法提取的果树成熟叶片基因组总DNA 完全适于AFLP分析。
【总页数】4页(P122-125)【关键词】果树;DNA提取;成熟叶片【作者】佟兆国;王富荣;章镇;赵剑波;张开春;闫国华;周宇;姜立杰【作者单位】南京农业大学园艺学院,南京210095;湖北省农业科学院果树茶叶研究所,武汉430209;北京市农林科学院林业果树研究所,北京100093【正文语种】中文【中图分类】S66【相关文献】1.成熟石榴叶片DNA提取方法研究 [J], 赵丽华;王先磊2.毛白杨成熟叶片基因组DNA提取方法的比较研究 [J], 李继东;梁启伟;吴文娟;吕文君;陈红卿3.不同保存方法对石榴成熟叶片基因组DNA提取效果的影响 [J], 陈芸;高原青;王继莲;马刘峰4.顽拗植物澳洲坚果成熟叶片DNA提取方法比较 [J], 郭凌飞;邹明宏;曾辉;杜丽清;陆超忠5.一种提取果树叶片DNA的简便方法 [J], 房经贵;章镇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
五种银杏总DNA提取方法比较开题报告
五种银杏总DNA提取方法比较1.立题依据1.1 论文题目及研究领域1.1.1论文题目:五种银杏总DNA提取方法比较1.1.2研究领域:DNA提取1.2论文研究的理论意义及应用价值银杏(Ginkgo biloba L.)是我国珍贵的经济树种，果、叶、材等用途广泛，有着较高的经济价值，尤其是其药用价值更为突出[1-2]。
银杏也称白果树，为原产我国的活化石植物，雌雄异株。
由于其在科学上和经济上的意义而较多地被研究。
银杏目植物起源于距今三亿多年前的古生代石炭纪，而中生代侏罗纪是银杏目植物发展的全盛时期Ⅲ[3-4]。
根据化石研究资料和品种资源调查，地球上曾经出现的银杏目植物有共有20余属150多种，现仅存单科、单属、单种，即Ginkgo biloba L[5]。
银杏富含黄酮类化合物，具有抗衰老、提高免疫机能、防治心血管病的作用[6-7]。
银杏内酯具有显著的PAF拮抗作用，是公认的治疗气管炎、哮喘斥等多种炎症的新型治疗剂[8]。
随着生物技术迅速发展，探索银杏的基因资源和遗传基础常需提取其DNA。
由于银杏含有多种黄酮类、银杏内酯类、酚类等复杂成分，给银杏DNA的提取带来一定的难度[11-12]。
1.3目前研究的概况和发展趋势银杏是中国特有而丰富的经济植物资源。
利用银杏果叶的有效化学成分和特殊医药保健作用加工生产保健食品，药物和化妆品，正引起国内外研究、开发、生产单位的重视，各国众多企业竞相研制生产以银杏为原料的天然绿色产品，替代对人体健康有较大副作用的合成化学品，从而为中国的银杏资源的开发利用开辟了无比广阔的前景，迅速提高了银杏的利用价值及其对经济、社会和生态的影响，为社会创造了就业和财富，为人类带来了健康和长寿。
随着生物技术迅速发展，探索银杏的基因资源和遗传基础常需提取其DNA。
由于银杏含有多种黄酮类、银杏内酯类、酚类等复杂成分，给银杏DNA的提取带来一定的难度[11-12]。
我们就银杏DNA的提取方法及选材进行探索，旨在找出一种较佳的方法以获得高纯度、高完整度的银杏总DNA，为银杏分子生物学的研究提供参考。
植物DNA提取方法总结
植物DNA的提取分离技术摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法：CTAB法、SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法关键词：植物DNA 提取方法研究进展市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12]，其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。
由于不同植物的材料组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。
目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。
他们在探索新方法的同时，也针对不同的植物，在传统的提取方法上进行着一些新的改良。
1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的一种。
它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。
1.1方法及原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
1.2 CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP 充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离。
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
福清市大力引进推广台湾优质水果
样品中的蛋白质、多糖等物质得到较彻底的去除。 综合紫外分析测定和电泳分析的结果 ， 表明本 研究中所提取的柑桔基因组 Ｄ Ａ样品纯净，结构完 Ｎ 整，浓度 达 到 ０３５ ｇ ，完 全 可 满 足 如 Ｐ Ｒ ． ￣／ ｌ ４ Ｃ、 ＲＰ Ａ Ｄ分析等后续研 究 的需要 。
酚类物质及 Ｒ Ａ污染。 Ｎ
表 １ 柑桔基因组的 Ｄ Ａ纯度和浓度 Ｎ
的实验结果 。多糖 的去除一般是利用高盐缓冲条件 下 ，Ｄ Ａ在 乙醇或 异 丙 醇 中优 先 沉 淀 的特 性 ，以 Ｎ
达到分离 目的¨ 。Ｊ 。本研 究 在 Ｄ Ａ粗提液 中加入 Ｎ
适量高浓度 Ｎ Ａ 和无水 乙醇沉淀 Ｄ Ａ，可以有效 ａｃ Ｎ 地去除多糖 的干扰。 本研究试用的柑桔基 因组 Ｄ Ａ提取方法所需材 Ｎ
究 的前 提 。多年生木 本果 树 的细胞 中含有 多种 次生
福清市大力 引进推广 台湾优质水果
今年以来，福清市采 取优 惠政策 ，大 力推进 台湾农 民
ｓ ｃｈ ｒｄ ｓ ｒｍ ｐａ ｔ ｅ ｏ ｃ ａ ｃ ａｉｅ ｆ ｏ ｌｎ ｇ ｎ ｍｉ ＤＮＡ． Ｂｏｅ ｄ ａ ｋ， １ ９ ｉｆｅ ｂｃ ９ ２， １ ３
（） ５ １ ： ２—５ ４
［ ］Ｐ ｂｒ １ ｅ ａ ｏ ｉ ａｏ Ｃ Ａ Ｎ ｔｃ ｏ ｔ ｏ ７ ｒ ｅｋ Ｓ ｔ １ ｄ ｃｔｎｏ ａ Ｔ ＢＤ Ａｅ ｒ ｔｎ ｒ ｏ ｌ ｏ ｉ ， ．Ｍ ｆ ｉ ｆ ｉ ｘａ ｉ ｐ ｃ ｏ
ＤＤ
２
料少 ， 无需昂贵的试剂， 操作简便 ，经济快速 ， 一般 实验室中均能应用，是一种值得借鉴的方法，尤其在 处理材料稀少或处理大量样品时， 具有明显优势。 参 考文 献
安徽桑树品种全基因组DNA提取方法研究
0引言中国是蚕桑生产的发源地，拥有极其丰富的桑树种质资源。
随着分子生物学技术的快速发展，从分子水平上对桑树种质资源的遗传变异进行研究已成为桑树分子生物学研究热点之一。
向仲怀等[1]运用RAPD 技术构建了桑属9个种的DNA 指纹图谱，对桑属的植物分类进行了开创性的研究，开辟了中国分子标记技术研究桑树种质的先例。
基因组DNA 的提取是进行分子标记技术研究的关键步骤之一，高质量基因组DNA 的获取是进行桑树生物学方面研究的基础。
由于桑树是多年生木本植物，组织细胞含有大量的多糖、多酚、酯类等复杂次生代谢产物，因而要从中提取高质量的DNA 有较大困难[2-5]。
本实验采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法对安徽特色桑树品种的嫩叶进行DNA 的提取，在实验过程中，优化了DNA 提取程序，获得了高得率、高纯度的DNA ，能成功地应用于后续的分子生物学反应。
旨在为桑树基因组DNA 的研究提供理论与技术参考，也为进一步深入开展其亲缘关系分析、基因组比较、遗传多样性分析等分子生物学研究提供一定的基础资料。
1材料与方法1.1实验材料选取5种安徽桑树地方品种（样本采自安徽省农业科学院蚕桑研究所桑树品种选育中心）。
以桑嫩叶基金项目：安徽省农科院院长青年创新基金“安徽省地方桑树种质资源ITS 序列及进化分析研究”(15B0634)；国家蚕桑产业技术体系合肥综合试验站“现代农业产业技术体系建设专项”(CARS-22-SYZ09)；安徽省农科院创新团队项目“多功能生态桑树品种的选育与利用”(11C0610)。
第一作者简介：王钰婷，女，1985年出生，安徽岳西人，助理研究员，硕士，研究方向：分子遗传学。
通信地址：230061安徽省合肥市蜀山区霍山路15号安徽省农业科学院蚕桑研究所，Tel ：0551-********，E-mail ：wyt@ 。
通讯作者：汪泰初，男，1970年出生，安徽池州人，研究员，硕士，研究方向：桑树栽培育种。
提取植物dna的方法及其原理
提取植物dna的方法及其原理嘿，朋友们！今天咱就来聊聊提取植物 DNA 这档子事儿。
你说这植物 DNA 啊，就像是植物的小秘密宝库，藏着好多好多关于它们的信息呢！要提取植物 DNA，首先得准备好一些工具和材料。
就好像你要去挖宝藏，得有把趁手的铲子不是？咱得有新鲜的植物样本呀，这可是关键。
然后呢，还得有一些化学试剂，就像打开宝藏大门的钥匙。
那具体咋操作呢？第一步，把植物样本好好处理一下，就跟给它洗个澡似的，把杂质啥的都去掉。
然后呢，把它放到一个合适的容器里，加入那些神奇的化学试剂。
这时候啊，就好像给植物来了一场奇妙的化学反应之旅。
这原理呢，其实也不难理解。
植物细胞就像一个个小房子，DNA就住在里面。
那些化学试剂呢，就负责把房子的墙壁啊啥的打破，让DNA 能跑出来。
这就好比你要从一个坚固的城堡里把宝贝取出来，得动点小脑筋，用点小技巧才行。
接下来，经过一系列的操作，DNA 就慢慢浮现出来啦！哇，你能想象那种感觉吗？就好像你找到了藏在深处的宝贝一样惊喜。
你想想看，通过提取植物 DNA，我们能知道好多植物的秘密呢！比如它们的遗传信息，这就像是植物的“家族谱”。
我们可以了解它们是怎么一代代传承下来的，多有意思啊！而且哦，这提取植物DNA 可不只是在实验室里玩玩的。
在农业上，这可是大有用处呢！可以帮助农民伯伯们培育出更好的品种，让庄稼长得更壮，收成更多。
这不就像是给农业加了一把助力的小火箭嘛！在医学上也有它的用武之地呢！说不定能通过研究植物 DNA 找到一些治病的新方法。
哎呀呀，这可真是太神奇啦！总之呢，提取植物 DNA 就像是打开了一扇通往植物神秘世界的大门。
让我们能更深入地了解这些绿色小伙伴们。
朋友们，不妨自己也动手试试，去探索一下植物 DNA 的奇妙世界吧！怎么样，是不是很心动呀？别犹豫啦，赶紧行动起来吧！。
3种木材DNA提取方法比较研究
基金项目：安徽省国际科技合作计划项目（1704e1002226）；安徽省自然科学基金项目（1908085QC111）。 作者简介：余敏（1985—），男，河南信阳人，讲师，研究方向：木材 DNA 识别。 *通讯作者 收稿日期：2021-01-08
6
安徽农学通报，Anhui Agri，Sci，Bull，2021，27（03）
3 种木材 DNA 提取方法比较研究
余 敏 魏宇创 张 浩 刘盛全*
（安徽农业大学林学与园林学院，安徽合肥 230036“；林木材质改良与高效利用”国家林业和草原局重点实验室，安徽合肥 230036）
摘 要：以微凹黄檀木材标本为研究对象，分别采用 BATB 法、PTB 法和 SDS 法对微凹黄檀不同部位木材进行
DNA 提取试验，并扩增 DNA 条形码序列 ITS2、t檀木材
DNA 提取和 DNA 条形码序列扩增的影响。结果表明：采用 BATB 法从微凹黄檀木材心、边材组织中提取的
DNA 浓度以及 DNA 条形码扩增效率均要高于其他 2 种方法，说明 BATB 法更适合从长期存储木材中提取
1 材料与方法
1.1 试验材料 微凹黄檀木材标本来自安徽农业大学木 材标本馆。由于木材组织疏松多孔，运输和储存过程中 易被其他外源植物组织污染，因此在进行木材DNA提取 试验操作之前，需用无菌刀片去除木材表面部分，并将试 样切成小片放置在全自动冷冻研磨仪（Retsch CryoMill） 中研磨成木粉，避免木材组织在研磨过程中因温度过高 造成DNA二次降解。 1.2 试验方法 1.2.1 木材DNA提取 分别采用BATB法、SDS法和PTB 法对微凹黄檀标本心、边材进行提取。BATB法：向500mg 木 粉 中 加 入 4.5mL BoTab buffer、225μL DTT（1mol / L）、 90μL蛋白酶K（20mg/mL），涡旋混匀；55℃水浴5h，期间颠 倒混匀；加入4.5mL氯仿∶异戊醇（24∶1），涡旋混匀；用旋 转混匀仪室温下混匀10min；12000rpm，4℃离心15min；用 5mL枪头小心吸取上层水相到新50mL离心管中，加入等 体积氯仿∶异戊醇（24∶1），上下颠倒混匀；12000r，4℃离心 5min；移取上层水相，加入2.5倍体积的醋酸钠（3mol/mL，
水杉木材DNA提取及条形码分子鉴定
取 液 （ ． ｌＬ Ｔ ｉ ＨＣ （ Ｈ８ Ｏ 、． ５ｍｏ／ ＤＴ （ Ｈ８ Ｏ 、． ｌＬ Ｎａ １１５ Ｓ Ｓ ； 盐 Ｏ １ｍｏ／ ｒ — １ ｐ ． ） ０ ０ ｌＩ Ｅ Ａ ｐ ． ） ０ ５ｍｏ／ Ｃ 、． Ｄ ） 高 ｓ 低 ｐ 法 缓 冲 液 （ ． ｌＩ Ａｃ ０ ０ ｌＬ Ｅ Ａ （ Ｈ８ ０ 、 ． ｌＬ Ｎａ １２ ５ Ｐ 、 Ｈ ０ １ｍｏ／ Ｎａ 、 ． ５ｍｏ／ ＤＴ ｐ ． ） ０ ５ｍｏ／ Ｃ 、 ． ＶＰ ３
③加 等体积 的苯 酚 ， 下颠倒 混匀 ， ４ｏ ８０ ０ｒｒｉ 上 于 ０ ／ ｎ离心 ６ｍｉ ， Ｃ， ａ ｎ 回收上 相． ④加 等体 积 的苯 酚 ， 下颠 倒混匀 ， ４℃ ， ０ ／ ｎ离心 ６ｍｉ ， 上 于 ７５ ０ｒｍｉ ｎ 回收上 相． ⑤加等体积 的氯仿／ 异戊醇 （ ｖ ２ １ ， 颠倒混匀 ， ４℃ ， ００ｒｍｉ Ｗ ４： ）上下 于 ７ ０ ／ ｎ离心 ６ｍ ｎ 回收上相 ． ｉ，
言木材射线细胞 、 木薄壁细胞等都是生活细胞 ， 从理论上讲提取 Ｄ Ａ是完全可 以进行的， 由于木材 Ｎ 但
种类不同， 所含次生代谢干扰物质不 同， 以能成功有效提取 Ｄ Ａ 片段 ， 所 Ｎ 也非易事． 选择我国特有树种
水杉 作 材料 ， 一是 因为 该物 种 已有一 些分 子水 平工 作 ， 方便 我们进 行 分子 比对 ， 是还 有一 些炭 化木 、 可 二
度较 边 材 中的分 子片段 长度 要短 ． 于生 活树 木 的次 生 木质 部 而 言 ， ＮＡ 在 边材 或 心 材 中 的提 取 相对 对 Ｄ 来说 都 是 比较 容 易 的 ， 但是 ， 于 已砍伐 加 工 的木材 进 行 ＤＮＡ 提取 相 对 就 较 困难 ， 对 已加 工 的木 材 多 数 情况 下 树皮 和边 材部分 已经失 去 ， 所利 用 的往 往是 心 材 部分 ， 而 所 含 的 Ｄ 故 ＮＡ 含 量 很 少． 虽然 通 常所
木本植物基因组DNA提取及鉴定
第26卷 第5期 植 物 研 究2006年 9月Vol .26 No .5 BULLETI N OF BOT AN I CAL RESE ARCH Sep., 2006基金项目:黑龙江省博士后科研基金项目和东北林业大学科研启动基金项目资助第一作者简介:王军(1966—),男,博士,教授,主要从事植物资源研究。
3 通讯作者收稿日期:2005-10-08木本植物基因组DNA 提取及鉴定王 军 杨传平3 刘桂丰(东北林业大学林学院,哈尔滨 150040)摘 要 采用改良后的CT AB 法,对山葡萄、软枣猕猴桃、蒙古栎、核桃楸、西伯利亚红松和偃松基因组DNA 进行提取。
结果表明,所提基因组DNA 分子量与λDNA (48kb )接近,其紫外吸收比在1166～1189之间。
第3次和第4次上清提取的DNA 质量优于第1次和第2次。
从提取产量看,每克鲜重提取DNA 量最小为15μg ・g -1(核桃楸第4次上清),最高的为272μg ・g -1(山葡萄第3次上清)。
西伯利亚红松和偃松第1次和第2次上清基本未提出DNA,第3次和第4次上清中得到了较高质量的DNA 。
经酶切鉴定和PCR 扩增,所提的基因组DNA 可以用于进一步研究。
关键词 木本植物;基因组DNA;提取Extracti on of genom i c D NA from woody pl an ts and it ’s i den ti f i ca ti onWANG Jun Y ANG Chuan 2Ping 3 L I U Gui 2Feng(College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040)Abstract Genom ic DNA was extracted fr om leaves of V itis am urensis,A ctin idia arguta,Q uercus m on 2golica,Juglans m andshurica and needles of P inus sibirica,P inus pum ila by the method of modifiedCT AB.The is olated geno m ic DNA length was si m ilar t o λDNA (48kb )and is suitable f or both PCR a mp lificati on and digesti on with restricti on endonucleases .The abs orbance rati on (A 260/A 280)ranged 1166～1.89.The quality of DNA extracted fr om third and fourth ti m es sus pensi on was better than fr omfirst and second ti m es sus pensi on .The yields of DNA ranged fr om 15μg ・g -1fresh mass (fr om f ourth ti m e sus pensi on J.m andshuric )t o 272μg ・g-1fresh mass (fr om third ti m e sus pensi on of V.am uren 2sis ).A lthough fr om first and second ti m es sus pensi on of P .pum ila and P .sibirica wasn ’t is olated genom 2ic DNA,but fr om third and fourth ti m es sus pensi on was obtained high quality genom ic DNA.The ge 2nom ic DNA can be used f or next analysis via identificati on of PCR and digesti on with restricti on endonu 2cleases .Key words woody p lants;geno m ic DNA;extracti on 随着DNA 分子标记技术和重组DNA 技术的发展,制备较完整、纯度较高的基因组DNA 日益显得重要。
一种木本植物RNA和DNA的简捷提取方法
一种木本植物RNA和DNA的简捷提取方法摘要：将尾叶按(Eucalyptus urophylla)叶片在液氮中研磨成粉，先用含山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白、聚乙二醇和亚精胺的提取缓冲液使总核酸沉淀，同时去除了大部分次生代谢物质。
然后用山梨醇、月桂酰肌氨酸钠进一步裂解细胞，释放核酸。
再用CTAB与核酸结合成复合物溶于高盐溶液。
用氯仿／异戊醇除蛋白质后，离心得含总核酸的上清液。
运用钙盐分步沉淀法，先在上清液中加入1／10体积的10％氯化钙溶液，使DNA与Ca2+结合成DNA钙盐。
向溶液中加入1／5体积的乙醇，使DNA钙盐形成沉淀析出，离心得DNA后，再增大乙醇浓度使RNA钙盐沉淀。
得到的DNA和RNA用非变性琼脂糖凝胶进行质量检测，可得完整的RNA和DNA条带。
此法经济、快捷，可同时得到DNA 和RNA。
关键词：木本植物；RNA；DNA；非变性琼脂糖电泳木本植物的组织中含有较多的多糖及单宁、酚、醌、原花色素类物质等次生代谢物质。
这些物质严重影响木本植物RNA和DNA提取效率，甚至造成提取失败而成功提取高质量的RNA和DNA是进行分子生物学研究的必要前提，如Nofthera杂交分析、cDNA文库构建、RT—PCR、Southern杂交分析等实验都需要高质量的RNA或DNA。
常用于植物RNA或DNA提取的方法有异硫氰酸胍法、热硼酸法、CTAB法、SDS法等。
这些方法对于某些植物的核酸提取是有效的，但对另外一些植物来说，却并不一定是好的方法。
对于木本植物而言。
由于其次生代谢物质含量丰富，这些物质的化学性质又与核酸相似，所以提取过程中，次生代谢物质会严重干扰核酸的提取，影响核酸的得率及质量，甚至导致提取失败。
目前，常规的核酸提p提取缓冲液：50 mmol／L Tris(pH值8.0)、35mmol ／L山梨醇、5 mmol／L EDTA、10％(W／V)聚乙二醇4000、5％(W／V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.2％(W／V)亚精胺和0.1％(W／V)牛血清白蛋白。
从落叶果树韧皮部提取DNA
从落叶果树韧皮部提取DNA杨英军;耿森;李爱江【期刊名称】《分子植物育种》【年(卷),期】2006(0)S2【摘要】目前关于落叶木本果树DNA提取的材料多数为植物的叶片,叶片具有试材广泛、容易研磨、DNA产量高、质量好等优点,但也会受到季节、病虫害的影响且不耐贮藏。
落叶果树枝条具有取材容易、DNA含量丰富的特点而适合在休眠季节用于提取DNA,进而加速果树分子生物学研究进程。
本研究探讨了CTAB法、SDS法对休眠季节不同时期取材的葡萄、桃、樱桃、杏、苹果、银杏、柿子、枣8种落叶果树的一年生枝条DNA提取效果。
结果表明:除葡萄外其他多数材料在整个休眠时期均能提出高质量的DNA,所提DNA电泳带纹清晰、亮度高,DNA产率高、质量优,可用于有关分子生物学的后续试验(RAPD分析);再DNA提取方法方面,从DNA产量和质量上来看,SDS法总体上要优于CTAB法。
最后对提取中出现中存在过多的酚类、多糖和其他次生物质去除方法进行了讨论。
【总页数】5页(P142-146)【关键词】落叶果树;韧皮部;DNA提取【作者】杨英军;耿森;李爱江【作者单位】河南科技大学林学院;河南科技大学食品与生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】S66【相关文献】1.落叶果树韧皮部提取DNA的方法研究 [J], 杨英军;李学强;张军科2.适于AFLP分析用的桃韧皮部DNA提取方法 [J], 王富荣;何华平;赵剑波;龚林忠;王会良3.苹果树木质部及韧皮部组织基因组DNA的提取及质量检测 [J], 刘钰娇;杨金凤;赵璐;王亚南;胡同乐;王树桐;曹克强4.一种果梅休眠枝韧皮部DNA提取方法 [J], 王飞;沈玉英;佟兆国;高志红;章镇5.苹果树木质部及韧皮部组织基因组DNA的提取及质量检测 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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研究简报几种木本果树DNA 的有效提取3程运江 伊华林 庞晓明 郭文武 邓秀新(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉430070)An efficient method for genomic D NA extraction from w oody fruit plantsCheng Y unjiang Y i Hualin Pang X iaoming G uo Wenwu Deng X iuxin(Huazhong Agricultural Univer sity ,Wuhan ,430070,China )关键词 DNA 提取;水饱和乙醚;多糖;木本果树K ey w ords DNA extraction ,water saturated ether ,polysaccharides ,w oody fruit plants中图法分类号 S 666.101 提取高质量的DNA 是有效开展分子生物学研究的前提。
多糖污染是木本植物DNA 提取中最常遇到的问题。
多糖污染的DNA 呈粘稠的胶状,不但给实验操作带来不便,更重要的是多糖对反应体系中的酶活性产生抑制作用,严重影响分子生物学研究的下游工作[1～3]。
很多多年生木本果树,即使其幼嫩组织多糖的含量也明显高于大田作物,所以,常规的DNA 提取方法因不能有效除去多糖而在木本果树应用中受到限制。
经典的CsCl 梯度离心能有效除去柑桔等木本果树的多糖而得到高纯度的DNA ,但由于梯度离心设备昂贵,涉及E B ,操作不便,且DNA 得率很低(10～40μg/g ),因而应用范围也受到限制。
本研究报道的是华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室总结出的一种适合于柑桔等富含多糖的木本果树的DNA 提取方法。
1 材料与方法1.1 材 料试验材料包括:夏橙(Citrus sinensis )、枳壳(Pon 2cirus trifoliate )、金柑(Fortunella crassifolia )、体细胞杂种[红桔(Citrus reticulata )+枳壳]等柑桔类植物的1a 生叶片或愈伤组织,及柚子(Citrus grandis )和枇杷(Eriobotrya japonica )的老叶等。
1.2 方 法1)DNA 的提取。
参照Dellaporta 等[4],Saghai 2Maroof 等[5]的方法。
为克服多糖对DNA 纯度的干扰,本研究对其进行了改良。
取4～5g 叶片或愈伤组织加入适量液氮研碎后,转入预冷的50ml 离心管,加入20ml CT AB DNA 提取缓冲液,摇匀后65℃水浴45min ,加入10ml 氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻混匀,离心。
上清液转入另一50ml 离心管。
加入2/3体积冷冻的异丙醇,充分混匀,静置,将析出的白色絮状DNA 沉淀转入10ml 离心管,加入3ml 70%的乙醇漂洗2～3次(1～2h/次)。
弃乙醇,风干DNA 沉淀,加入2ml TE 缓冲液,待DNA 沉淀充分溶解后,加入15μl RNaseA (10mg/ml ),37℃温浴4～5h 。
加入2ml 苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),充分混匀,离心,吸上清液于另一10ml 的离心管中。
加入0.8ml 5m ol/L NaCl 和3ml 水饱和乙醚,充分混匀,离心,取下清液,加入3ml 冷的异丙醇沉淀DNA ,用70%的乙醇漂洗DNA 沉淀2～3次(3～4h/次),于乙醇中长期保存,或风干后,溶于适量TE 缓冲液收稿日期:2001Ο04Ο183国家自然科学基金(NSFC )和国际科学基金(IFS )资助程运江,男,1973年生,华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室博士生.武汉430070第20卷第5期2001年 10月华 中 农 业 大 学 学 报Journal of Huazhong Agricultural University V ol.20 N o.5Oct.2001,481～483中。
2)DNA的检测。
①取DNA原液15μl稀释至3.0ml,用UVΟ1601型紫外分光光度计测定260nm 及280nm的吸光值。
②将DNA原液适当稀释后,用1×T BE,0.8%琼脂糖凝胶2V/cm电泳10h进行质量检测。
③向一定量的DNA中加入限制性内切酶HindⅢ或EcoRⅠ至4～5U/μg DNA,37℃消化过夜,用0.5×T BE,0.8%琼脂糖凝胶1.5V/cm电泳10h进行检测。
2 结果与分析用经典的DNA提取方法,不论是S DS法[4]还是CT AB法[5],提取田间材料的DNA都很难获得满意的结果。
所得到的DNA呈粘稠的透明胶状物,在TE中很难溶解,测定A260/A280普遍低于1.5,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测时发现胶状物聚集在点样孔,形成亮带,而且PCR扩增或限制性酶切操作困难。
而本研究对柑桔、枇杷等富含多糖的果树作物近500份样品进行试验,得到的DNA沉淀呈乳白色,透明胶状物明显减少,加TE易溶解,粘度降低;经纯度测定A260/A280均达到1.7～1.9,电泳检测点样孔亮度明显弱,且主带明显。
经PCR扩增或RF LP分析均能获得理想带型,且背景清晰。
说明此方法确实能有效降低多糖对DNA的污染,获得高纯度的DNA。
用柑桔的田间材料提取DNA时,苯酚/氯仿纯化DNA,经乙醇沉淀后几乎全是粘稠透明的胶状物,极难溶于TE,即使经长时间溶解,粘稠的溶液也很难用移液枪吸取,电泳检测时,胶状物总是聚集于点样孔,这与Fang等[1],P orebski等[2]报道的多糖污染DNA的状况完全一致;经UVΟ1601型紫外分光光度计检测,发现270nm处有很强的吸收峰,严重干扰紫外吸收的测定,与T esniere等[3]用苯酚法和胍法提取葡萄果实RNA时所提到的未知化合物凝聚成不溶性复合物,并且这种未知化合物在270nm处有强吸收峰完全一致。
而我们发现在未用苯酚处理前,在260nm处有明显的吸收峰,270nm处没有吸收峰,但经苯酚/氯仿处理后,田间柑桔材料270nm 处普遍出现吸收峰,而260nm的峰却消失,材料越老,该现象越明显,但对于室内组培材料(愈伤组织或试管苗)则该现象不明显。
由此我们可以推测,吸收峰的改变与多糖和酚的结合可能有关。
在DNA 分离过程中,水饱和乙醚能有效除去DNA溶液中残图1 方法改进后与改进前提取总DNA的电泳检测Fig.1 Comparisons of genomic DNA purifiedwith two different methods1～3为水饱和乙醚/NaCl纯化,5～7为苯酚/氯仿纯化。
试验材料:1～3和5～7均分别为枇杷,柚子,枳壳(分子量参照物为λDNA/HindⅢ)lanes1to3:water saturated ether/NaCl purified,lanes5to7:phenol/chloroform extracted.materials:Lanes1to3and lanes5to7standing for loquat,pummelo,trifoliate orange respectively.(DNA markerisλDNA/HindⅢ)图2 总DNA的EcoRⅠ酶切的电泳检测Fig.2 E lectrophore sis of EcoRⅠdige sted genomic DNA 1～3为水饱和乙醚/NaCl纯化,5～7为苯酚/氯仿纯化。
试验材料同图1lanes1to3:water saturated/NaCl purified,lanes5to7:phenol/chloroform extracted.materials as Fig.1留的苯酚、氯仿等有机溶剂[6]。
经水饱和乙醚处理一次后270nm的吸收峰全部消失,在260nm处恢复正常的吸收峰。
然而,经水饱和乙醚处理后,有机相与水相之间形成粘稠的界面。
加入高浓度的Na2 Cl的界面韧性增加,除去界面,再用异丙醇沉淀, DNA均以白色絮状析出。
经70%的乙醇多次洗脱,除去残留的盐分,经测定A260/A280的比值均能达到284 华中农业大学学报第20卷 1.7～1.9之间,DNA的得率在40～200μg/g,其纯度完全能达到RF LP、AF LP、C APS、SSR、RAPD分析的要求。
而界面呈透明胶状物,很难溶于TE,由此推测,它可能是析出的多糖。
3 讨 论近年国外有一些去除植物DNA中多糖的相关报道。
Dellaporta等[4]认为,加入高浓度的K Ac有利于除去多糖,Fang等[1]认为在1.0～2.5m ol/L NaCl 的高盐TE中,用无水乙醇沉淀DNA能除去多糖。
M ller等[7]报道,在S DS和CT AB2种去污剂存在时,将提取缓冲液中的NaCl浓度提高至1.4m ol/L 可除去多糖。
Sue P orebski等[8]在沉淀粗提DNA时,将NaCl的浓度提高至2.5m ol/L以除去多糖。
所有这些报道都是利用在高盐缓冲条件下,在乙醇或异丙醇中DNA优先沉淀的性质,达到DNA与多糖分离的目的,但对于多糖含量过高的材料,总有部分多糖随DNA沉淀而造成污染。
应用本研究报道的方法,先用乙醚和NaCl将大部分多糖除去,再沉淀DNA便可大大提高去除多糖的效率。
即使衰老叶片(如:红桔+枳壳的体细胞杂种和枇杷的老叶),用此方法对进行DNA的分离,也能获得高质量的DNA。
油菜等作物用此方法进行DNA提取也能有效降低多糖的污染,说明该方法对于其它富含多糖的植物的DNA提取也是适用的。
参 考 文 献1 Fang G,Hammar S,G rumet R.A quick and inexpensive method for re2 m oving polysaccharides from plant genom ic DNA.Biofeedback,1992,13(1):52～542 Proberki S L,Bailey G,Baum R B.M odification of a CT AB DNA extrac2 tion protocol for plant containing high polysaccharide and polyphenol com2 ponents.Plant M ol Rep,1997,12:8～153 T esniere C,Vayda M E.M ethod for the is olation of high quality RNA from grape berry tissues without contam inating tannins or carbohydrates.Plant M ol Biol Rep,1991,9:242～2514 Dellaporta S L,W ood J,Hicks JB.A plant DNA m inipreparation:ver2 sionⅡ.Plant Biol Rep,1983,1(4):19～215 Saghai2M aroof M A,S oliman K M,Jorgensen R A,et al.Ribos omal DNA spacer2length polym orphisms in barley:M endelian inheritance, chrom os omal location and population dynam ics.Proc Natl Acad Sci US A, 1984,81:8014～80186 Ausubel F.Current Protocols in M olecular Biology,NY:John wiley& S ons.Inc,19967 M ller E M,Bahnweg G,Sandermann H,et al.A sim ple and efficient protocol for is olation of high m olecular weight DNA from filamentous fun2 gi,fruit bodies,and in fected plant tissues.Nucleic Acids Research, 1992,20(22):6115～61168 P orebski S,Bailey L G,Bernard R.M odification of a CT AB DNA extrac2 tion protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol com ponents.Plant M olecular Biology Reporter,1997,15(1):8～15(责任编辑:张志钰)384 第4期程运江等:几种木本果树DNA的有效提取 。