反向遗传技术在口蹄疫病毒基因组结构和功能研究中的应用
【动科前沿】口蹄疫检测技术新进展
【动科前沿】⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫诊断检测技术正在不断改进和创新，已从细胞培养、⾎清学诊断技术扩展到分⼦⽣物学诊断技术领域。
这些新技术不仅敏感、特异、⽽且简便、快速、经济、⾼通量化。
⼀、病原学检测技术1新的敏感细胞系因⽜甲状腺原代细胞和羔⽺原代细胞在⽣产上存在问题，尤其是很少进⾏⼝蹄疫诊断的实验室及因⼝蹄疫呈地⽅流⾏性的地区，很难得到⼝蹄疫阴性的动物。
⽽现有的细胞系对⼝蹄疫敏感性存在局限性，因此，研究者对⼝蹄疫毒更加敏感的细胞系的进⾏了研究。
Brehm等建⽴了⾼敏感⼭⽺胎⼉细胞系，结果表明，在分离7个⾎清型的⼝蹄疫病毒更加敏感。
并且该细胞还可以分离猪⽔泡病毒和⽔疱性⼝炎病毒。
LaRocco(2013)年将αv亚基和β6亚基同时导⼊到⽜肾细胞系中构建稳定表达细胞系LFBK-αvβ6,结果表明β6亚基⾄少在100代可以稳定表达，且增强了对⼝蹄疫病毒的易感性。
2分⼦⽣物学诊断技术2.1环介导转录等温扩增技术⼝蹄疫的传统诊断⽅法是由特异性病毒抗原的酶联免疫吸附试验检测所介导的，通过观察细胞培养中的病变效应。
另外，常规反转录聚合酶式反应和实时定量聚合酶式反应⽤来补充⼝蹄疫病毒感染的最初诊断⽅法。
然⽽，这些检测⽅法⽐较费⼒，并且需要昂贵的试验室设备。
为解决这些问题，Yamazaki等⼈建⽴了⼀个简单、快速和实⽤的反转录的环介导等温扩增⽅法鉴定动物及其产物中的⼝蹄疫病毒。
反转录环介导等温扩增⽅法⾸先是由Notomi等⼈报道的，并且成功应⽤于许多病毒的检测，李健等利⽤环介导等温扩增技术建⽴了⼝蹄疫快速检测⽅法，同时评价了该⽅法的灵敏性和特异性。
该检测⽅法检测体系具有极⾼的特异性，只能检测到⽬标病毒，与其他类病毒物较差反应，灵敏性较⾼。
2.2实时荧光定量反转录聚合酶链式反应荧光实时定量聚合酶链式反应就是通过对聚合酶链式反应扩增反应中的每⼀个循环产物荧光信号的实时监测，从⽽实现对起始模板定量及定性分析。
反向遗传学让疫苗研发更高效
新科技反向遗传学让疫苗研发更高效文/谢开飞通讯员欧阳桂莲在现代遗传学中，反向遗传学被认为是一 种不可或缺的工具，它彻底改变了人们对病毒发病机制和疫苗研发的认识。
近曰，一项来自38中国科技财富丨2020年第6期瑞士的研究使用这一工具，依靠已知新冠病毒 基因序列，在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。
新科技研究人员认为，快速构建出活的新冠病毒，可以成为向卫生部门和实验室提供传染性 病毒毒株的替代方法，从而争取时间对疫情暴 发做出快速反应。
该研究中所用的反向遗传学 技术是什么？在生物科技领域有哪些应用？这 种重建病毒的最新研究如何改变对疫苗研发的 认识？由里及表开辟疫苗研发新思路“一直以来，科学家们研究相关基因的功 能，都是通过杂交等手段，观察表型性状的变 化，从而研究遗传基因的存在与变化，这种由表 及里的研究方法称为正向遗传学。
”厦门大学国 家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心副教 授裎通告诉记者，如在医学领域，可以观察临床 病人病理组织和正常组织的不同表现，从而探究 产生这种表现变化的内在原因。
随着分子遗传学及相关实验技术的发展，科研人员已经能够有目的地对D N A进行重组或 者定点突变。
于是，在现代遗传学中，就出现了 另一条由里及表的认知路线。
研究人员直接从生 物自身基因出发，通过对特定基因进行敲除、定 点突变等人工操作后，观察突变体表型与性状变 化，从而反推基因功能。
由于该路线与正向遗传 学正好相反，所以这个新的遗传学分支被称为 反向遗传学，包括基因剔除技术、基因改造等 研究。
相较于正向遗传学来说，反向遗传学有其独 特的优势。
此前，美国哈佛一麻省理工博德研究所科学 家塞克•凯斯利森及其同事，就采用反向遗传学 方法，对〗0503个生活在巴基斯坦的人基因编码 区进行测序分析，识别出了约50000个突变。
这 种反向推定的技术路线，相当于高效收集了正向 敲除1317个基因找到的结果，相较于传统正向 遗传方法，极大地提高了效率。
口蹄疫专项培训--口蹄疫病毒流行病学调查与监测,疫苗及应用相关知识
（四）细胞培养
•
在疫苗生产种，是抗原获得满意效价机会完全取决于细胞的形态及生长状况 是否良好，细胞培养是疫苗生产中国十分重要的环节。疫苗生产中的BHK-21 细胞的培养主要有转瓶培养和悬浮细胞培养两种技术。 转瓶培养一般分为五个时期：游离期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期 悬浮细胞培养：悬浮细胞培养需要特殊的生物反应器，细胞附着于生物反应 器中的载体上生长，动物细胞的外层是质膜，脆性大，所选的反应器应务必 减小剪切力以降低对细胞的伤害。悬浮细胞培养过程中，最根本的是使细胞 的培养条件达到最优化，尽可能消除或减轻环境对细胞的影响，维持细胞存 活力和高效表达，同时又要充分考虑细胞表达产物的后续钝化。
（三）培养液和血清
• 培养液和血清作为重要的生产用原材料，其质量好坏直接影晌口蹄疫疫
苗的质量。对培养液和血清最基本的要求是没有污染，因此在使用前0 该进行过滤除菌。对于血清，除控制污染外还应注意：1.血清应从无疫 国家和地区引进；2.血清每批次都应检验外源病毒。血清中含有大量的 蛋白质．持别是其中的口蹄疫病毒抗体会影响病毒生长，蛋白质如果进 人疫苗当中则会在使用时产生不良反应。国外常使用8％的PEG沉淀血 清中的蛋白，研究表明．经过PEG处理的血清在悬浮培养BHK-21细胞中 仍能正常使用，不会影晌细胞生长。
•
• • •
（七）病毒灭活
• 甲醛曾是口蹄疫疫苗生产中应用最为广泛的灭活剂，研究发现病毒中的
水解乳蛋白等物质能抑制甲醛的灭活作用。自20世纪80年代以来，多 数疫苗厂家改用乙烯亚胺类衍生物作为灭活剂。先后投入的有AEI及BEA 这两种物质主要作用于核酸，对蛋白质抗原保持较好，但毒性较大，但 后来研究人员对BEA进行了改进即为BEI，其作用与BEA 相同，但毒性较 小，现在被广泛使用。
评估一个反向遗传学方法构建的转基因口蹄疫病毒疫苗
这 个 研 究 结 果 表 ｎ 西 圣保 罗 州 流 产 的 胎 猪 中 Ｐ Ｖ 月巴 Ｃ ２的 感 染 频 率 相 低 （ ０ ％ ） Ｃ ２与 其 它 病 原共 感 染 导 致 繁 殖 １ ． ，Ｐ Ｖ ７ 障碍 非 常 普 遍 。Ｐ Ｖ Ｃ ２衣壳 蛋 氩基 酸 修 饰 特 与 母 猪 流 产 相
，
啊 Ｐ Ｒ 枪 测 细 小 病 毒 （ Ｐ 、钩 端 螺 旋 体 和 布 鲁 氏 菌 Ｃ Ｐ Ｖ）
病 Ｐ Ｖ ｌ Ｃ ２ ８个样 品 巾被 榆 测 到 （ 出率 为 １ ．％ ） 柃 ０ ７ 。分 别 榆 测 到 ２、１ 、和 Ｏ个样 品 为 猪 细 小 病 毒 （ Ｐ 、布 氏杆 菌 Ｏ Ｐ ￣） 和 钩 端 螺 旋 体 阳性 。对 ｌ １个 Ｐ Ｖ Ｃ ２株 测 序 判 定 是 ２ ａ型 （ ＝ ｎ
ｍｅ ｍｂｒ ｎ ｏｅ ｎ ｇ ｎｅ ｆｐ ｒ ｉ ｅ ｅ ｄｅ ｃ ｄ ａ ｒ ａ ｖ ｒ ｓ ｓｉｏ ａ ｅ ｐｒ ｔｉ ｅ ｓｏ ｏ ｃ ｎ ｐｉ ｍｉ ｉ ｒｈｅ ｉｕ ｅ ｓ —
ｌｅ ｎ Ｃ ｉａ ＶｒｓＧ ｎｓ ２ １ ｙ １ ．ｆ ｐ ｂ ａ ｅｄ ｏ ａ ｄ ｉ ｈｎ ． ｉ ｅｅ ， ０ ２ Ｍａ ５ ｕ ｈａ ｆ ｔ ｕ Ｅ
ｐｉｔ ｒ ］ ｎ
括 繁殖 障 碍 。 这 个 研 究 的 目的 是 鉴 别 巴 西 圣保 罗 州 繁 殖 障 碍
猪 的 Ｐ Ｖ２亚 ，调 企 与 其 它传 染性 病 原 共 感 染 的 情 况 。 Ｃ
美 国 北 部地 区猪 弓形 虫病 高 发
食 人 未 煮 熟 的 含 有 弓形 虫 的 猪 肉是 弓 形 虫 传 播 的 重 要 途
径 。 在过 去 的 ２ 年 ．美 国采 用 封 闭 饲 养 模 式 生 产 的猪 肉 弓形 Ｏ 虫 的 感 染 率 降 低 了 ，然 而 户 外 养 殖 猪 的 感 染 率 比 较 高 消 费 者 需 求 “ 机 产 品 ” “ 有 、 人道 主 义 ” 和 “ 由 ” 已 导致 越 来 越 ｌ ｆ
应用新城疫病毒反向遗传操作系统—构建NP、P表达质粒的开题报告
应用新城疫病毒反向遗传操作系统—构建NP、P表达质粒
的开题报告
一、研究背景
随着生物技术的不断发展，反向遗传技术被广泛应用于基因功能研究和药物开发等领域。
反向遗传技术通过向细胞内导入外源性RNA分子，从而靶向抑制或增强目标基因的表达。
由于其高效、特异性和可逆性等优势，反向遗传技术成为基因靶点研究和药物筛选的重要手段。
近年来，病毒反向遗传操作系统（VIGOs）在基因功能研究中得到广泛应用。
病毒反向遗传系统通过利用病毒作为载体，将外源性RNA大量导入宿主细胞内，从而实现目标基因的特异性抑制或增强。
尤其是新城疫病毒反向遗传系统，以其高效性和可靠性等优点，成为研究者进行基因敲除、基因过表达等反向遗传技术的重要选择。
二、研究目的
本研究旨在利用新城疫病毒反向遗传操作系统，构建NP、P表达质粒，探究其在基因表达调控中的作用机制。
三、研究内容
1. 构建NP、P表达质粒
本研究将利用分子生物学技术，构建含有NP和P基因的表达质粒。
NP和P是新城疫病毒RNA复制和转录过程中所必需的两个蛋白质，可以通过反向遗传技术与靶向基因进行特异性相互作用，实现靶向的基因敲除或过表达等功能。
2. 转染表达质粒并验证其表达
通过将NP、P表达质粒转染入目标细胞系，以Western blot、RT-qPCR等技术手段检测其表达情况。
3. 探究NP、P在基因表达调控中的作用机制
通过不同方法如基因敲除、基因过表达等技术手段探究NP、P在基因表达调控中的作用机制。
四、研究意义
本研究可以为基因功能研究提供新的手段和工具，例如基因敲除、基因过表达等技术，为今后的药物筛选和基因治疗等领域提供新的思路和方向。
反向遗传技术与猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗
46
18年04期.indd 46
2018/4/13 星期五 下午 12:28:57
2018 年第 4 期 特科学别用关药注
对该流行毒分离株也开展了疫苗种毒驯化筛选工作，但 队利用制苗种毒拯救框架对 O 型 Mya-98 病毒进行了
都因病毒产量低、免疫效力差而没有成功。
改造和提升。再通过 L、5'UTR 和 P12A 等基因修饰，
2C) 和 P3(3A、3B、3C 和 3D)。3′U TR 长约 92 nt。 “一类新兽药注册证书（证号 ：（2017）新兽药证字 56
Poly(A) 尾巴长约 100 nt。
号）。中农威特生物科技股份有限公司已于 2018 年 2 月
疫苗研发团队通过全基因信息解读发现，A 型 Sea- 23 日获得了猪口蹄疫 O 型、A 型二价灭活疫苗（Re-O/
特科学别用关药注 2018 年第 4 期
反向遗传技术与 猪口蹄疫 O 型、A 型二价灭活疫苗
李永霞 / 中农威特生物科技股份有限公司
反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传 学的认知路线为由表及里，是从生物体自身的性状、表 型出发到它的遗传物质来研究生命的发生和发展规律。 而反向遗传学则与经典遗传学恰恰相反，是一条由里及 表的认知路线，其首先是获得生物体基因组的全部序列， 然后对靶基因有目的地进行加工和修饰，如基因插入、 基因缺失、基因置换及定点突变等，再按组成顺序构建 含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命 活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以确定 这些变化对表型性状的直接影响，与之相关的技术为反 向遗传技术。
反向遗传技术现已成功应用于禽流感、新城疫、口 蹄疫等畜禽重大疫病的疫苗研究中，除口蹄疫疫苗外具 有代表性的产品有三例 ：一是重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1 亚型，Re-1 株 )，2005 年获得一类新兽药注册证 书（（2005）新兽药证字 3 号）；二是利用新城疫 LaSota 弱毒疫苗反向遗传系统，构建表达不同 H5 高致病力禽 流感病毒 HA 抗原的重组病毒，成功研制禽流感、新城
反向遗传学在植物研究中的应用
反向遗传学在植物研究中的应用作者：闫晓丹来源：《中国果菜》 2010年第3期摘要:反向遗传学是直接从遗传物质入手来研究生命现象与规律的, 其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。
本文就反向遗传学在植物研究中的应用进行了评述, 并对其前景进行了阐述。
关键词：反向遗传学技术；反向遗传学1、反向遗传学及其技术介绍反向遗传学（reverse genetics）是相对于正向（经典）遗传学而提出的。
经典遗传学的系统研究是从孟德尔的豌豆花实验开始的，就是通过研究生物的表型、性状来推测其遗传物质组成、分布与传递规律等，从而研究生命过程的发生与发展规律的。
即正向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行为，如控制突变性状的基因数目及其在染色体上的位置以及突变性状在后代中的传递规律等。
反向遗传学则是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论与技术，通过核苷酸序列的突变、缺失、插入等手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应。
即反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来研究基因的生物学功能，阐述生物生命发生的本质现象与规律，如生物的繁殖复制机制、病毒的致病机制等。
而与反向遗传学操作相关的各种技术统称为反向遗传学技术（r e v e r s e g e n e t i c sapproach），包括RNA 干扰（RNA interference,RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是D N A 重组技术应用范围的扩展与延伸。
随着基因组序列测定技术的日渐成熟，反向遗传学技术的应用将越来越广泛。
目前反向遗传学技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，且在病毒研究方面已经显示出了巨大的作用，尤其是R N A 病毒的研究方面。
2、反向遗传学的应用2.1 用于拯救病毒或创造新型病毒根据一些病毒的有关的已知核酸序列，采用反向遗传学操作技术可以构建出“人为设计”的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列为基因组的新型病毒，这给获得高免疫原性的低致病力毒株来制造疫苗提供了一个全新的途径。
反向遗传操作技术在流感病毒中的应用研究
反向遗传操作技术在流感病毒中的应用研究【摘要】反向遗传操作技术（reverse genetics， RG）是近年来比较热门的一门技术，该技术可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造，然后通过拯救病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果，从而可以对病毒基因组表达调控机制、病毒致病的分子机理等进行研究. 我们通过对近年来国外有关文献的回顾，希望能够正确看待病毒拯救技术的利弊，注意生物安全性，希望能够为防治可能发生的流感病毒流散和传播提供新的思路.【关键词】流感病毒疫苗反向遗传技术0引言20 世纪人类历史上发生过4 次流感的大流行，对人类健康和生命安全都造成了严重危害. 最近，H5N1高致病性禽流感病毒全世界范围内的肆虐，又引起了世人广泛的恐慌. 疫苗的应用是主要控制和预防这种疾病的手段.但是因为抗原漂移和抗原转变，流感病毒的抗原不断发生变异，这就需要我们安全、稳定、快速的再形成新的疫苗株. 利用反向遗传操作技术，使产生流感病毒完全从克隆的质粒DNA通过8质粒系统，或者改进的少于8质粒系统［1］，再共转染合适的细胞从而快速的得到基因修饰的疫苗候选株. 流感防治的前景在于反向遗传操作技术在研制更有效的流感疫苗中的应用，及对其基因功能的研究.1禽流感病毒与人流感病毒的关系及感染人的机制禽流感病毒和人流感病毒都属于流感病毒，只是因为病毒感染的宿主专一性不同而作相应的命名，A， B， C这3型流感病毒中，A型可感染人和禽类，感染禽类的称为禽流感病毒，感染人的称为人流感病毒，而影响宿主专一性的主要因素是病毒的M基因、NP基因和PB2基因等. 禽流感病毒感染人之前，一般需先通过中间宿主完成适应性转变或实现抗原转变，但目前已报道有三类禽流感病毒毒株H5N1， H7N7和H9N2能直接感染人［2］. 其中，只有H5N1可使人发生严重疾病，另外两种病毒的感染不会造成人的严重疾病［3］. 禽流感感染人类机制多数学者认为，一方面与禽流感结合受体的改变有关，使病毒HA蛋白基因发生突变，主要是从NeuAca2、3Gal受体结合型向NeuAca2， 6Gal受体结合型改变; 这种受体结合的改变是禽流感感染人类的关键步骤; 另一方面，与禽流感自身核蛋白结构的改变有关，像H3亚型的禽流感226位的谷胺酰氨突变成亮氨酸后和人类受体的结合能力就将增强［4］. 流感病毒感染人的体细胞后必须进行有效复制，才能对人体造成损害. 禽流感不能在人的体细胞内进行有效复制，这主要是与病毒的核蛋白(PB1， PB2， PA， NP) 有关，其中PB2 的组成起决定性作用.由于流感病毒基因组是8节段负义的RNA，其基因组不具有感染性，各个RNA 片段必须与聚合酶蛋白（PB2， PB1， PA）及核蛋白(NP)结合在一起形成核糖核蛋白复合物RNPs才有活性. 病毒感染的第一步是与宿主细胞表面的特异性受体HA结合，通过融膜进入细胞后，释放出RNPs，RNPs进入细胞核才开始病毒基因组的复制和转录，每个RNA片段单独组成一个转录单位，转录出mRNA和互补RNA （cRNA），mRNA翻译合成病毒蛋白，cRNA复制生成病毒负链子代RNA，进而在细胞浆中组装成完整的病毒粒子. HA 在病毒吸附及穿膜过程中以及决定病毒的致病力方面也均起着相当关键的作用，它能否被裂解为HA1和HA2 两部分是病毒感染细胞的先决条件，也是决定病毒致病力的主要因素. 通过核苷酸序列分析表明，毒力突变株要么在HA 裂解位点附近丢失糖基化位点，要么在HA 裂解位点后面获得一个额外的精氨酸. 如HA易于被切割，则毒株具有较高的致病性;反之，则致病力较低［5］. 研究表明HA 可以诱导机体产生中和抗体，是禽流感中最重要的保护性抗原，而且还可以刺激机体产生细胞毒性T 淋巴细胞反应. HA 切割位点的结构是影响其切割性的主要原因，包括位点插入处有多个碱性氨基酸，还有切割位点附近糖基化位点的缺失等，均能使HA 对蛋白切割酶的敏感性增强，从而使病毒致病性提高. 人和禽H5NI流感病毒相比，人H5N1流感病毒的NA柄有19个，从而导致酶活力下降，这种短茎特点是其病毒毒力的决定因素之一［6］. 香港H5N l 毒株中PB2 的第627 位氨基酸产生了由赖氨酸(Lys) 型向谷氨酸(Glu) 型的转化，促使病毒核蛋白的合成，使病毒在体内能有效地进行复制，导致这种转化的机制可能与组成PB2 的第199 位氨基酸丝氨酸(Ser) 的突变有关［7］. 另外，在病毒的进化过程中，同型A IV 在不同进化种系间发生了基因重组. 这种突变和重组也是决定病毒毒力的因素之一.2以质粒为基础的反向遗传操作技术在流感中的应用及其发展反向遗传学是近年来比较热门的一门技术，自1978年第1例RNA病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来，各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展，这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展. 流感病毒是负链RNA病毒，基因组是支离破碎的. 2006��01据《自然》杂志报道一项电子显微镜研究显示：每个正在发育的流感病毒粒子含有一个遗传材料组成的中心杆，这个中心杆被外围的杆所包围. 这种高水平的组织可能是决定该病毒感染周期的一个因素，而感染周期可能是新的抗病毒药物的一个作用目标. 而且更主要的是明确了流感内部的结构将加速发展基因递送和表达的效率［7］，从而也为提高病毒拯救效率奠定理论基础. 最初研究人员通过纯化RNPs蛋白，来获得流感病毒；1989年，研究人员通过辅助病毒，获得了流感病毒；1999年，Fodor首次通过12质粒系统拯救出流感病毒； 2005年Hoffmann等［8］建立了使用双向转录表达载体的8质粒系统，在同一个模板（载体上）实现vRNA的转录和病毒蛋白的表达. 在这种表达载体中，把编码vRNA的cDNA正向克隆至polⅡ启动子（从人巨细胞瘤病毒CMV启动子衍化而来）和终止序列（牛生长激素poly（A）信号aⅡBGH）之间，在此表达盒之间还反向插入了人polⅠ启动子（PⅠh）和鼠polⅠ终止序列（tⅠ）. 8个基因片段cDNA分别克隆后转染真核细胞，在同一个模板上由polⅠ控制合成负链vRNA，由polⅡ控制合成正链mRNA并表达蛋白质. 但由于使用同一个模板获得蛋白表达和vRNA合成，又会减小系统的“弹性”，例如，在病毒蛋白和基因传递的研究中，缺少一个或多个片段或者某个（些）片段中存在致死性突变时，就不可能产生病毒样粒子（virus��like particles，VLP）. 然而，适合于生产人类疫苗的细胞系(如Vero细胞)不能够进行高效转染. 为了解决这些问题，Neumann创建了一套少于以PHW2000为载体的经典的8个质粒反基因系统. 在此系统中减少了用于产生病毒的质粒. 八个用于病毒合成的RNA聚合酶I转录盒与一个允许插入大片段外源基因的的PTM克隆载体结合. 同样，两个编码红细胞凝集素和神经氨酸苷酶片段的载体盒和六个编码其他蛋白质的载体盒结合. 另外，将用于表达聚合酶亚基的三个RNA聚合酶II 载体盒和编码NP蛋白载体盒结合. 通过分别组合这些载体盒，显著降低了病毒繁殖所需要的质粒数量，分别形成了3， 4质粒的系统. 生产甲型流感病毒的效率较传统的12质粒系统更高［1］，并且在新一代的细胞培养流感疫苗，此新系统更适合于生产流感病毒疫苗. A型流感病毒不断的发生变异，尤其是已有的研究发现，出现的高致病性人禽流感病毒具有高度变异的特点，需要及时更换疫苗株来确保有效疫苗的制备. RG技术的兴起，开辟了高致病性人禽流感疫苗快速制备新纪元. 通过RG技术快速制备适合中国使用的高致病性人禽流感疫苗株，建立高效拯救流感病毒的技术平台和全面系统的评价体系，从而鉴定合格的疫苗株和血清标准品送WHO确认，为高致病性人禽流感疫苗的制备奠定基础，同时也为应对流感大流行做好技术储备.3前景展望反向遗传操作技术发展至今天，载体的选择已经不是什么困难的事情了，关键还在于构建的策略和思路. 随着基因组学和蛋白质组学技术的发展和应用，利用生物信息学技术对微生物基因组序列进行分析，在不需要培养病原体的情况下，从大量的抗原中筛选出研制疫苗的侯选抗原.相对于传统疫苗学，它减少了鉴定疫苗抗原所需的时间和花费，并能提供新的解决方案，对研究新型疫苗也有重要的参考价值［9］. 在拯救技术的日益发展成熟的基础下，反向遗传系统在RNA 病毒功能基因组的研究上也将担当无可替代的作用. 如流感M2蛋白胞浆尾被删去5个或10个氨基酸残基后，就会失去拯救流感病毒的能力；敲除NS2的病毒样颗粒能用作疫苗的载体去表达外源蛋白，可以将其开发为一种复制子载体，以转移外源基因等，都需要通过构造突变或缺失这些序列的人工病毒来阐明其具体功能. 应用RNA 病毒反向遗传系统重现病毒的生活周期和感染模式，对阐明病毒的起源、致病机制和免疫交叉保护提供一种切实可行的方法. 将来可结合感染性克隆对病毒起源和致病性进行调查，开展病毒拯救的机制研究. 直到现在，RNA 病毒的感染性克隆是如何模拟野生病毒感染的具体机理还没有被系统阐明. 另外，尽管多种疫苗已经开发出来且实验室证明其有效的保护作用，但禽流感的发生却没有被消除，这就需要从病毒反向遗传系统延伸到模式生物基因组背景下的“病毒�菜拗鞣�向遗传系统”，从而揭示禽流感跨宿主的改变机制是什么，也为预测人类可能流感大流行的病毒株提供依据. 当然也要正确看待病毒拯救技术的利弊，注意生物安全性，防止可能发生的病毒的流散和传播.参考文献［1］ Neumann G， Fujii K， Kino Y， et al. An improved reverse genetics system for influenza A virus generation and its implications for vaccine production ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2005，102(46):16825-16829.［2］ Shortridge KF， Peiris JS， Guan Y. The next influenza pandemic: lessons from Hong Kong ［J］. J Appl Microbiol， 2003，94 Suppl:70S-79S.［3］ Baigent SJ， McCauley JW. Influenza type A in humans，mammals and birds: determinants of virus virulence，host��range and interspecies transmission ［J］. Bioessays， 2003，25(7):657-671.［4］ Sawada T， Hashimoto T， Nakano H， et al. Why does avianinfluenza A virus hemagglutinin bind to avian receptor stronger than to human receptor? Ab initio fragment molecular orbital studies ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006，351(1):40-43.［5］ Salomon R， Franks J， Govorkova EA， et al. The polymerase complex genes contribute to the high virulence of the human H5N1 influenza virus isolate A/Vietnam/1203/04［J］. J Exp Med， 2006，203(3):689-697.［6］ Li X， Fang F， Song Y， et al. Essential sequence of influenza neuraminidase DNA to provide protection against lethal viral infection ［J］. DNA Cell Biol， 2006，25(4):197-205.［7］ Noda T， Sagara H， Yen A， et al. Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles ［J］. Nature， 2006，439(7075):490-492.［8］ Hoffmann E， Neumann G， Kawaoka Y， et al. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2000，97(11):6108-6113.［9］ Obenauer JC， Denson J， Mehta PK， et al. Large��scale sequence analysis of avian influenza isolates ［J］. Science， 2006，311(5767):1576-1580.。
逆向遗传学在基因研究中的应用
逆向遗传学在基因研究中的应用基因是构成生命体的基本遗传单位，其对人类的健康和疾病具有重要影响。
随着科技的不断进步，基因研究已成为当前科学界的一个热门领域。
逆向遗传学是一种新兴的基因技术，近年来在基因研究中得到广泛应用。
逆向遗传学是一种用来研究基因功能的技术，其核心思想是通过改变基因、蛋白质或细胞的表达，并观察其对生命体的影响来推断这些生物体系统的结构和功能。
逆向遗传学可以用于研究许多与基因有关的问题，包括研究癌症、心血管疾病、遗传性疾病等。
在逆向遗传学中，基因编辑技术是一项关键技术。
基因编辑技术是指通过人为方式改变基因序列或基因活性的技术，它可以精确地编辑和修饰细胞DNA的序列，并可在生物体中表达出这种编辑后的DNA序列，用于研究不同基因的作用和哪些基因对生命体的发育和维生产生影响。
在基因编辑技术的发展过程中，CRISPR/Cas9技术是最为成熟的技术之一。
除了基因编辑技术外，还有RNA干扰（RNAi）技术，这种技术是一种具有高特异性、灵活性的基因敲除技术。
通过RNAi技术，我们可以选择性地抑制一个甚至多个基因的表达，从而研究基因从表达到功能的整个过程，从而更加全面地了解基因的功能机制。
逆向遗传学中的微生物技术也是应用十分广泛的一种技术。
微生物是一种单细胞生物，可以通过改变其基因来研究与生物和环境相关的问题。
举例而言，当研究心血管疾病时，我们可以通过对微生物的基因进行研究，来了解发生心血管疾病的机制。
逆向遗传学技术除了可以应用于研究疾病相关的基因功能外，还可以用于研究基因序列和编码蛋白分子的结构和功能。
这种技术在研究基因蛋白和基因反应物时具有很大的价值。
逆向遗传学技术也可以应用于对人类强迫进化和人类自然进化的研究，从而更加深入地了解人类基因的变异程度、演化历程以及随着文化、地理等环境的改变而发生的变化。
总之，逆向遗传学技术在基因研究中的应用是多方面的。
随着逆向遗传学技术的飞速发展，我们相信这种技术将会得到更多的应用，成为基因研究中不可或缺的技术手段。
逆向遗传学的应用
逆向遗传学的应用在现代科技的不断进步下，人类对遗传学研究的深入挖掘，已经不仅仅停留在基础研究阶段，而是开始向着开发生物技术和医疗技术等实用领域推进。
逆向遗传学是一种在研究基因表达方面的方法，它可以用来研究许多生物过程以及人类疾病的发病机制。
本文将探讨逆向遗传学在生物技术和医疗领域中的应用。
一、基因表达调控逆向遗传学对于解决基因表达调控的研究中，具有不可或缺的重要性。
在研究生物过程中，探索基因是否被转录调控到合适的程度，是否在特定的组织或细胞中被表达出来，以及它们在细胞和生物中扮演的角色，成为了逆向遗传学的研究内容之一。
逆向遗传学还可以被用来研究某些基因突变可能引起的疾病，并指导治疗方法的制定。
二、基因诊断逆向遗传学的应用在诊断医学方面也极其广泛。
临床实践中，基因诊断已经成为一种非常重要的诊断方法。
通过分析基因表达的异常研究材料，逆向遗传学可以检测基因变异的问题。
类似的，通过逆向遗传学的研究，医生可以找出导致癌症等疾病的基因突变，并给出针对性的治疗方案。
逆向遗传学也可以通过分析基因和蛋白质的相互作用来得到疾病的解释和治疗方法。
三、基因治疗逆向遗传学在基因治疗技术中也被证明可以产生重要的效果。
基因治疗是一种治疗疾病的方法，它通过高效率的方式将修复过程中失去的蛋白质或基因注入到患者体内，以帮助他们重新恢复，或使他们的基因表达水平得到控制。
这些基因被改变或缺失的人，可以通过逆向遗传学方法进行基因修复，将有可能解决一些不可治愈的疾病，如血色病、囊性纤维化等，为众多患者带来福音。
四、生物科技逆向遗传学在生物科技方面也产生了广泛的应用。
直接检测蛋白组是一种通过逆向遗传学来研究生物体内多个蛋白质之间相互作用的方法。
这种方法还可以扩展到全细胞水平，帮助我们了解生物体系中精细的调控过程。
另外，逆向遗传学也可以帮助工程师设计新的生物技术，以创造更好的医疗成果，或者利用高级生产工具来生产新的药物，但也需要避免对生态造成危害。
牛口蹄疫新型疫苗与传统疫苗免疫效
2 试验方案与步骤
（1）试验动物。选取37头3月龄以上的健康及非结 构蛋白阴性牛，其中口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位 缺失标记灭活疫苗试验组25头，口蹄疫O型、A型二价 灭活疫苗对照组7头，空白对照组5头。
（2）试验步骤。①安全检验：注射后观察10 d， 10 d内免疫动物无异常，判定实验产品安全。②免疫方 案：肌肉注射2 mL/头，首免后28 d进行二免，二免后 14 d进行三免。③免疫后定期检测。选用疫苗免疫后， 拟定首免后28 d采血，以后每14 d采集血样，用口蹄 疫病毒非结构蛋白3ABC单抗阻断ELISA抗体检测试剂 盒，同时测定病毒非结构蛋白抗体。用口蹄疫液相阻断 ELISA抗体检测试剂盒检测免疫抗体。
目前使用传统的灭活疫苗，免疫效力最优，但因纯
化不完全，免疫后，以检测病毒非结构蛋白抗体为金标 准的鉴别技术，难以精准区别免疫和野毒感染动物，即 使应用改进的纯化技术，也不能完全清除与灭活病毒大 小相同的非结构蛋白复合物，多次免疫后，仍能检测到 病毒非结构蛋白抗体。口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表 位缺失标记灭活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株）属此类疫 苗。该疫苗是利用基因缺失和病毒拯救等反向遗传技 术，分别缺失FMDVO型和A型毒株的3B基因的优势表 位，并重新拯救3B蛋白表位缺失病毒O/rV-1株和A/rV-2
5.山东省肥城市孙伯镇畜牧兽医站，山东 泰安 271600）
摘要：牛口蹄疫具有较高的热性与传染性，会对牛羊的身体造成严重的危害。在当前阶段，牛口蹄疫没有特效的药物治疗 方式，主要通过疫苗进行疾病的防治。在科学技术快速发展的背景下，牛口蹄疫的疫苗研发工作也融入各类先进的科学技 术，使口蹄疫疫苗的研发质量不断提升，呈现出了口蹄疫新型疫苗。为了解牛口蹄疫新型疫苗与传统疫苗免疫效果差异， 针对2种口蹄疫疫苗进行分析。 关键词：牛口蹄疫；新型疫苗；传统疫苗；免疫效果 中图分类号：S858.23 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.05.006
口蹄疫病毒反向遗传学研究进展
口蹄疫病毒反向遗传学研究进展白兴文;李平花;刘在新;刘湘涛;谢庆阁【期刊名称】《微生物学通报》【年(卷),期】2009(036)001【摘要】反向遗传学操作技术在口蹄疫病毒(FMDV)病原学基础研究领域的应用,使得人们能够在基因组整体水平上研究病毒基因的功能.得益于反向遗传学系统的不断完善和发展,目前人们对FMDV分子病原学也有了更加深入的认识和理解.本文结合实验室在FMDV反向遗传学方向上所开展的探索性研究工作,综述了国内外利用反向遗传学操作技术在研究FMDV分子致病机制、病毒毒力与变异的关系,病毒复制的影响因素、新型FMD基因疫苗的研制等领域所取得的进展,展望FMDV反向遗传学研究新动向.【总页数】7页(P106-112)【作者】白兴文;李平花;刘在新;刘湘涛;谢庆阁【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃,兰州,730046【正文语种】中文【中图分类】R5【相关文献】1.反向遗传学技术及其在口蹄疫病毒研究中的应用 [J], 祝秀梅;慕洪涛;黄安仓;黄银君;卫广森2.评估一个反向遗传学方法构建的转基因口蹄疫病毒疫苗 [J], 王蕾（编译）3.反向遗传学技术在麻疹病毒属病毒中的研究进展 [J], 石晓玲; 和伟程; 潘晓梅; 田永强; 柏家林4.猪流行性腹泻病毒反向遗传学及其研究进展 [J], 陆颖;速雪丽;杜琛;王若木;钟莲;陈樱;韦祖樟;黄伟坚;欧阳康5.反向遗传学技术在PRRSV基础与应用领域中的研究进展 [J], 祝徐航;胡灵子;牟泓晔;宋厚辉;王晓杜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
口蹄疫病毒基因组结构及功能
链核 酸酶证实其 ＿级结构有 ４个环 （ ｔｍ —ｏｐ） 二 Ｓｅ ｌ ｏ 结构域 。其 ３ 端有非常保守的 Ｕ ＵＣ基序 ， Ｕ 由易变的嘧啶富集区和 ＡＵ Ｇ 组成 ，这个元件被认为是真正的 ＩＥ 。翻译起始 因子 ｅ ４ ＲＳ ｌ Ｇ、 Ｆ ｅＦ Ａ和 ｅ ４ Ｉ４ ｌ Ｂ等和核糖体亚基在翻译起始时都与 Ｉ Ｅ Ｆ Ｒ Ｓ的 ３ 端结合 。张显升等对 ８株 Ｆ Ｖ ＩＥ ＭＤ Ｓ的序列进行了比较结果 Ｒ 表明 ：Ｉ Ｅ Ｒ Ｓ区段 较为保守 。二级结构 分析表明 ，Ｆ ＭＤＶ Ｉ Ｅ Ｒ Ｓ 至少有 ３种二级结 构，无论 ＩＥ Ｒ Ｓ二级结构如何不同 ，单链区 大部分核苷酸序列或基序相同 ， 茎环柄部核苷酸对维持二级 结 构的空间构象具有十分重要的作用 ，环 中或单链区序列（ 基序） 在 维持其功能方面具有很重要的作用 。
面。
２ 基 因组 结构特点
・
Ｆ Ｖ基因组是 单股正链 Ｒ Ａ，呈线状，全长约 ８５ ｂ ＭＤ Ｎ ． ， ｋ 由 ５ 端非编码区、 开放阅读框（ Ｆ 、 ０Ｒ ）３ 端非编码区和 Ｐ ｌ（ ｏｙＡ） 组成。５ 端非编 码区含有 ｓ片段、ｐ ｌ ｃ 、功能未知 区和内 ｏｙ ） （
构蛋白各 ６ 个分子组成。装配过程中的Ｙ－ （ ｓ和 １Ｓ颗 ０ ／ ￣ ７ ） ４ ５
粒均由 １ Ｂ（ ０ 、 Ｃ和 １ ３三种蛋 白质构成 。口蹄疫病毒裂 Ａ ＶＰ ） １ Ｄ 解时产生 的 １ Ｓ的蛋白亚单位 由 １ ２ Ａ、１ Ｃ和 ｌ Ｄ三种蛋 白质各 ５个分子组 成。１个蛋 白亚单位构成病毒粒子二十面体的—个
部核糖体进入位点等 。Ｏ Ｆ由 Ｌ基 因、Ｐ 结构蛋白基因 、Ｐ 、 Ｒ ｌ ２
并对小鼠和牛的致病力大大降低。 由此可见 ，Ｍ Ｖ 的 Ｐ ｌＣ ＦＤ ｏ （） ｙ
口蹄疫病毒反向遗传技术研究进展
口蹄疫病毒反向遗传技术研究进展任方;易忠;郭会玲;魏玉荣;马文戈;黄炯【摘要】Foot-and-mouth disease(FMD)is an infectious disease caused by foot-and-mouth disease virus (FMDV).Office International Des Epizooties (OIE)has listed foot-and-mouth disease as the first disease of the most important animal epidemic diseases.If FMD breaks out,it shall seriously affect the develop-ment of animal husbandry,and the national economy.But now,we still have the blind spot for the foot-and-mouth disease virus's understanding.There are many insufficiencies for the foot-and-mouth disease vaccine.The rapid development of viral reverse genetics technology has provided one new and effective technical method for the research of the foot-and-mouth disease virus structure and the research of the new vaccine and biological preparations.This article reviewed the domestic and foreign research of FMDV mo-lecular pathogenic mechanism and the new FMD vaccine preparation by reverse genetics technology,at last prospected the new trend of foot-and-mouth disease virus reverse genetics.%口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的传染病之首，其暴发会严重影响畜牧业发展、人民生活以及国民经济。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
反向遗传技术在口蹄疫病毒基因组结构和功能研究中的应用张亚科，高学军东北农业大学动物医学院，哈尔滨（150030）E-mail：yakezhang20030711@摘 要：反向遗传技术已广泛应用于RNA病毒的基因组结构和功能的研究。
本文综述了反向遗传技术的研究进展,并讨论它在口蹄疫病毒研究中的应用。
关键词：反向遗传技术，口蹄疫病毒，基因组结构和功能1.引言口蹄疫病毒( Foot-and-mouth disease virus ,FMDV) 引发的偶蹄动物口蹄疫是一种急性、热性、高度接触感染的传染病, 该病被世界动物组织(OIE) 列为1类传染病之首[1]。
自从1897年德国学者证实FMD是由一种比细菌小的滤过性传染因子引起的，至今人类对该病毒的研究有近百年的历史，虽取得一定进展，但仍无法有效控制口蹄疫在全球的肆虐。
FMDV分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3 和Asial七个血清型，型间无交叉保护反应[2 ]。
该病毒基因组为单股正链RNA，病毒粒子呈正二十面体的球形结构。
衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4各60个分子组成，RNA分子位于衣壳内，约有8500个核苷酸（nt）。
基因组的5’端共价连接一种特殊的小蛋白 VPg（3B），紧接着是约1300 nts的5’非编码区，依次是S片段、聚胞嘧啶区[Poly(C)]和内部核糖体进入位点（IRES）。
3’端带有Poly（A）尾，其上游约100 nt是3’非编码区。
基因组中部是一大的开放阅读框，编码病毒多聚蛋白。
多聚蛋白经3级裂解后，形成3~4种结构蛋白（VP0或VP4，VP2，VP3 ，VP1）和8~9种非结构蛋白（Lab，Lb，2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D[3]）。
本文从病毒拯救技术，基因组结构和功能的研究等方面，对国内外FMDV反向遗传现状作一综述，并分析该领域存在的问题和未来研究方向。
2.FMDV拯救系统概述2.1反向遗传系统概述反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作,为RNA 病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。
自1978年第一例RNA病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来,各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展。
该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA聚合酶启动子，通过体外转录过程再次得到病毒RNA，然后将该转录物RNA转染哺乳动物细胞拯救活病毒。
由于这种被拯救的病毒来自全长cDNA分子,因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造, 然后通过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的效果,从而达到对病毒因组表达调控机制,病毒致病的分子机理等进行研究的目的,甚至还可以得到减毒毒株，开发新型疫苗。
目前利用该技术已成功获得脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、烟草花叶病毒、芜菁黄色花叶病毒、登革病毒等的感染性分子克隆。
这种技术在正链RNA病毒研究领域中已经发展到高潮，为研究病毒基因组结构和功能、致病机制和病毒宿主细胞之间相互作用提供了技术平台[4，5]。
目前，拯救FMDV主要运用两个系统。
2.2 体外转录拯救系统体外转录技术是利用外源RNA聚合酶在体外将基因组cDNA拷贝转录成基因组RNA，由于正链RNA病毒基因组本身具有感染性，所以用基因组RNA去转染细胞就有可能产生病毒粒子.体外转录要求先在基因组cDNA拷贝两个末端进行修饰，5'端添加一段外源启动子的核心序列，其目的使RNA聚合酶在体外正确起始，3'端需要有一段终止子序列或者类似的终止结构，使RNA聚合酶在合成全基因组RNA后可以正确被终止.影响拯救成败因素：1．体外转录物的长度体外转录物的长度应与真实病毒基因组RNA 的长度接近，在5′或3′端多出非病毒核苷酸对病毒的拯救成败或效率有重要影响。
一般来说，5′端延伸极大地降低感染力，而3′端延伸则易于容忍。
造成5′端延伸的原因是:在PCR 扩增病毒5′端cDNA 序列时，5′引物前面连上T7 启动子，使其融合到病毒序列的5′端，所得的病毒cDNA 再插入载体中。
启动子和病毒cDNA 之间通常插入1～2 个G，形成最适的启动子一致序列，以增强转录效率，这使5′延伸似乎无法避免。
2. 转录物的3′端正确终止可在全长cDNA的3’末端加上一个特异的限制性酶切位点，在体外转录时先将重组质粒线性化，再进行转录过，可使转录正确终止。
为产生准确的3′端，一个重要突破是发展了带有自我剪切功能的核酶序列的载体，这样转录出的RNA具有准确的3′端。
对于转录物的3′端，终止位置常取决于体外转录前的单酶切位点，但可以通过插入有自我剪切能力的核酶序列(如HDV 的δ核酶) 来避免病毒RNA的3′端延伸。
3. 帽子结构(m7 Gppp G) 帽子结构对病毒RNA 转录物有最适感染力是必要的，可能由于它能有效启始RNA 的翻译和抵抗宿主细胞核酸酶，从而增加了转录物的稳定性。
许多RNA 病毒在其基因组5′端常带有病毒基因组连结蛋白(VPg) 而不是帽子结构，体外转录物的加帽可模拟VPg ，在一定程度上部分或全部补偿VPg 的损失。
1990年，Zibert A等人[6]运用该系统在世界上首次成功拯救了FMDV，开创了该病毒分子水平研究的新局面。
当时克隆基因组采用的是“先分段扩增再拼接全长”的传统方法。
其构建的全长5’端带有SP6启动子核心序列，由SP6 RNA聚合酶识别，体外转录系统生成cRNA. cRNA转染BHK-21 cells而获得拯救病毒。
2004年，刘光清等[7]在Zibert A等人基础上，在其构建全长5’端加有T7启动子，用体外转录试剂盒转录成cRNA，再用脂质体转染法将cRNA 导入BHK-21 cells从而拯救出OH/CHA/99株。
2.3 基于T7 RNA聚合酶的体内转录拯救系统即机械导入含有病毒cDNA的表达质粒，使之在体内由内源T7RNA聚合酶进行转录与复制得到具有感染性的转录物。
关于体内生成感染性RNAs的机理目前尚不清楚，推测是cDNA 运输到细胞核，在核内被DNA依赖性RNA聚合酶转录成RNAs。
这一途径得到的RNA感染性克隆具有以下优点：1.所获得的感染性RNA比较稳定，不易降解，且可以在体内大量复制；2.避免了体外转录过程，对那些在体外难以获得高产量感染性RNA的病毒来说是一种理想的方法；3.不需要价格昂贵的试剂，如帽子结构类似物、体外转录系统等即可得到感染性RNAs；4.病毒基因组的表达很大程度上不再依赖于病毒的复制过程，这一点对研究那些不能在细胞复制的突变体病毒RNAs所表达的蛋白质及其定位很有用。
对于口蹄疫病毒敏感细胞系BHK-21，该细胞能够稳定表达T7 RNA聚合酶，运用该细胞拯救病毒，不需要共转染能够提供T7 RNA聚合酶的VV或FPV 更加方便可靠。
E.Rieder等[8]于1996年应用该方法拯救出病毒。
3.反向遗传技术在口蹄疫病病毒结构和功能中的研究现状3.1 L蛋白酶是重要的毒力决定因子。
L蛋白酶由5’末端的ORF编码，在7种不同血清型的口蹄疫病毒中，它是有两个AUG起始密码子，分别编码Lab和Lb。
L蛋白酶通过切割eIF4G，抑制IFN-α/β mRNA 的翻译过程，降低IFN-α/β蛋白的产量，进而导致野毒在宿主细胞内迅速增殖，而缺陷L蛋白酶的FMDV 在细胞上生长得很差，因为宿主细胞中有IFN-α/β的正常生长反应存在。
利用反向遗传技术Almeida Mr等[9] 构建了一种缺失了前导蛋白酶序列的嵌合病毒，含有A12 株的基因组序列及O1株的核衣壳蛋白编码序列，这种杂种病毒毒力较弱，但在猪体中仍能检测到毒性。
Chinsangaram J 等[10 ]利用反向遗传技术，在FMDV A12 株感染性分子克隆的基础上，构建了一种缺失了前导蛋白酶编码序列的病毒，将该病毒分别作为活疫苗和化学灭活苗接种动物，并观察其效应。
结果表明，作为活苗接种动物以后，动物不表现临床症状，没有散毒的危险，能刺激机体产生中和性抗体，并为动物提供部分保护。
化学灭活苗接种动物也能产生高水平的中和性抗体，能保护动物免受野毒的侵袭。
3.2 3A决定宿主嗜性3A蛋白是FMDV的一种非结构蛋白(nonstruetural protein，NSP) 。
3A在复制起始时与宿主细胞成分相互作用，并诱发细胞内膜增生，这是病毒RNA复制的一个条件，并可作为宿主细胞受小RNA病毒感染的标志[11]。
3A可能在宿主特异性和病毒毒力方面起决定作用，3A基因发生的变异与宿主动物或细胞对病毒的选择优势相关［12，13］。
研究还发现，3A 经乳鼠、鸡胚、鸭胚、细胞培养传代后，3A 基因可发生不同程度的缺失。
张显升等认为3A的特征性变化可能与病毒的表型变化相关 [14]。
Beard CW等[15]对台湾分离株O/YUN/TAW/97和一株对牛致病的毒株进行重组，结果显示3A蛋白存在一处10个氨基酸长度的缺失及一系列氨基酸残基的替换，从而导致在牛源细胞上不能增殖，不引起牛的口蹄疫，但在猪源细胞上能够生长增殖且产生很高滴度。
Knowles NJ等[16]进行流行病学调查，经序列分析，发现3A蛋白在93～102或133～143氨基酸缺失及附近氨基酸替换则会导致口蹄疫病毒宿主范围的变化，而且这种病毒类型早在1970年分离的毒株中（O/HKN/21/70）就存在。
我国李平花等[17]以猪源FMDV OLZ/02株的感染性cDNA克隆为技术平台，用牛源的China 99株的3A基因替换OLZ/02株的3A基因，构建口蹄疫型内嵌合病毒，进一步研究3A基因对宿主嗜性的作用。
3.3 Poly（A）决定病毒复制能力Poly（A）尾在基因组复制方面起着重要作用。
Poly(A)与3’NCR 共价相连，可能是病毒有效复制或翻译所必需的结构[18]。
Barry等[19]研究了O型FMDV Poly(A)长度与感染性的关系，研究表明，O型FMDV Poly (A )的长度与病毒感染性之间的关系很小或没有相关性。
到目前为止,国内外关于Poly (A) 尾巴的报道较少,其具体功能仍不清楚。
3. 4 VP1和Poly（C）与病毒的毒力有关VP1 蛋白大部分暴露在病毒的表面,是决定病毒抗原性的主要成分。
VP1的第141 位～160 位和200 位～213 位氨基酸残基是FMDV的主要抗原区,能诱导动物产生中和抗体,也是抗原性的高变区[20]。
世界上许多国家在FMD分子流行病学调查中,都是利用VP1 基因核苷酸序列测定和分析,并比较核苷酸同源性,作为FMD流行的疫源分析理论依据。
Ward. G 等[21]在构建感染性cDNA 分子的基础上,通过缺失移去VP1 蛋白的细胞吸附序列,构建一种重组质粒,并转染敏感细胞,有VP1 蛋白的产生,接种猪,猪不表现任何临床症状,但是能产生中和性抗体,用强毒攻击免疫动物,结果20%的猪得到保护。