实验三、细胞色素C的制备
细胞色素C的制备及测定
实验三吸附法制备细胞色素C 粗品一、实验目的1．学习细胞色素C 的理化性质及其生物学功能。
2．掌握制备细胞色素C 的原理。
3．掌握制备细胞色素C 的操作技术。
二、实验原理细胞色素C（cytochrome,Cyt）是呼吸链的一个重要组成成份。
是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b 和细胞色素aa3 之间，细胞色素C 的作用是在生物氧化过程中传递电子。
细胞色素C 分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000 道尔顿。
它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。
细胞色素C 分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C 制成还原型的，氧化型细胞色素C 在408nm、530nm 有最大吸收峰，还原型细胞色素C 的最大吸收峰为415nm、520nm 和550nm，这一特性可用于细胞色素C 的含量测定。
由于细胞色素C 在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。
本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。
三、实验材料1. 实验器材绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；72l 型分光光度计；烧杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋2. 实验试剂⑴1M H2S04 溶液；1M NH40H 溶液；固体硫酸铵⑵25％硫酸铵溶液: 100m1 蒸馏水中含25 克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度⑶0.2％氯化钠溶液：称0.2 克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml.⑷10%乙酸钡试剂：称10 克乙酸钡, 溶于100ml 蒸馏水中。
⑸20％三氯醋酸溶液(6) 人造沸石(60～80 目)⑺联二亚硫酸钠(Na2S2O4·2H2O)3. 实验操作（1）细胞色素C 的制备①材料处理: 取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。
细胞色素C的制备
一、Cytc性质
细胞色素在线粒体内膜起电子传递作用，Cytc 在线粒体呼吸链上位于Cytb和细胞色素氧化酶之 间，是呼吸链重要组成部分。
每分子Cytc含有一个血红素和一条多肽链， Cytc中Lys含量较高，pI=10.7，含 Fe0.38%~0.43%，Mt=12000~13000。
Cytc分氧化型和还Байду номын сангаас型两种，氧化型呈深红色， 还原型呈桃红色。Cytc吸收峰：
氧化型 408nm，530nm 还原型 415nm，520nm，550nm。 在550nm，摩尔吸收系数 K1氧化型（0.9 ×104/mol）/cm K2还原型（2.77×104/mol）/cm
二、实验设计及流程
四、各项指标测定（第三天） （4课时）
1、 Cytc产量
Y1 (mg)＝E1(A)／K1×Mwt(12400)×3×V(最后量取离心 后）×1
Y2 (mg)＝E2(A)／K2×Mwt(12400)×3×V (最后量取离心 后）×1
Cytc产量(mg) ＝(Y1+ Y2)/2
产率=产量（mg）/心肌（kg）＞50（技术指标）
2、测定产品的分光光度吸收值
从400-580nm每隔10nm扫描一次，绘出吸收曲线（波长光密度值)
3、蛋白质量（mg）=（1.45×A280-0.740×A260）×V毫升 （若稀释需乘倍数）
纯度=产量/蛋白质量
蛋白浓度mg/mL= 1.45×A280-0.740×A260 ＞0.5
匀浆抽提→盐析除肌红蛋白、血红蛋白→选择性 变性沉淀→复性透析→测定产量、产率、纯度、 光吸收值
三、实验方法
1、提取除杂（4课时） 猪心（150g左右）→加入0.145mol/L TCA（150mL左右
细胞色素C的制备及测定
细胞色素C的制备及测定一．摘要本实验以猪心为原料提取细胞色素C，通过三氯乙酸溶液沉淀、硫酸铵粉末抽提和透析等一系列步骤制备得细胞色素C溶液，并利用消光法对其进行鉴定。
由实验可得，重量为166.6g心肌可得到38.0ml的细胞色素C溶液，其中蛋白质含量为0.71724mg/ml，细胞色素C产量为9.9023mg，产率为59.44mg/公斤；从实验中还可得，氧化型样品的最大吸收峰应在410毫微米、530毫微米。
还原型样品的最大吸收峰应在410毫微米、520毫微米及550毫微米。
二．关键词：细胞色素C、猪心、制备、测定正文1.前言细胞色素是包括多种能够传递电子或能够激活氧的含铁蛋白质的总称，是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素 C 是其中的一种【1】。
自然界中，细胞色素C 的含量与组织的活动强度成正比。
以哺乳动物的心肌、鸟类的胸肌和昆虫的翼肌含量最多，肝、肾次之，皮肤和肺中最少。
细胞色素 C 是一种重要的细胞呼吸激活剂，常作为组织缺氧治疗的急救用药和辅助用药，如 C O 中毒、安眠药中毒、初生婴儿窒息、严重休克期缺氧、麻醉前处理以及肺部疾患引起的呼吸困难、高山缺氧、各种脑部疾病引起的脑缺氧、各种心脏疾患的缺氧。
也用于脑血管障碍、中风后遗症、乙型脑炎后遗症等的治疗。
另外细胞色素 C 还能促进受损肝细胞的再生、骨髓造血机能修复以及显著减轻由放疗引起的白细胞减少症。
通常外源性细胞色素 C 不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素 C 便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的利用，最终在一定程度上恢复损伤的电子传递链【2-4】。
因文献中有关细胞色素C的研究鲜见，本实验采用猪心为原料对其进行研究。
2．实验部分2.1实验原理向心肌中加入三氯乙酸溶液，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则存留在三氯乙酸溶液中。
将硫酸铵粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白、血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C仍留于溶液中。
细胞色素c的制备与相对分子质量的测定
细胞色素c的制备与相对分子质量的测定中图分类号：Q摘要：在pH3.8下从猪心中提取细胞色素c；根据标准细胞色素c浓度和对应吸光度值曲线求得所提取的样品溶液的细胞色素c含量；并根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线求得细胞色素c的相对分子质量。
并讨论了实验中人造沸石重新利用的方法和可能影响提取结果纯度的因素及改进方法。
关键词：细胞色素c；人造沸石；吸光度；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳前言：细胞色素是一类含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中。
细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。
细胞色C (cytochrome c) 是细胞色素一种。
它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。
细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。
细胞色素C比较稳定，耐热、酸碱，不易变性。
细胞色素c为生物氧化过程中的电子传递体。
其作用原理为在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。
通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。
细胞色素C是一种细胞色素氧化酶，是电子传递链中唯一的外周蛋白，位于线粒体内侧外膜。
在药品上，用于组织缺氧的急救和辅助用药，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。
细胞色素C判定生物亲缘关系的远近，亲缘关系越近的生物，其细胞色素C越相似或相同。
比如人和黑猩猩。
而如果在进化史上相去甚远，则其其细胞色素C也相差越远，比如人和酵母菌。
内容：1试剂、材料及器材1.1 试剂：硫酸（1mol/L）、氨水（2mol/L）、硫酸铵、氯化钠；标准细胞色素溶液；凝胶贮备液（聚丙烯酰胺凝胶）、分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）、浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）、10%SDS、样品缓冲液、电极缓冲液、低相对分子质量标准蛋白质、质量浓度为10%过硫酸铵、1.5%琼脂、染色液、脱色液。
细胞色素C的制备测定及SDS—PAGE纯度鉴定
细胞色素C的制备测定及SDS—PAGE纯度鉴定摘要：本文研究细胞色素C的制备及测定方法和SDS-PAGE测定蛋白质分子质量及纯度鉴定，以猪心未原料，采用离心、透析、抽提、抽滤、沉淀等技术，制备出细胞色素C，然后用消光法，紫外吸收法测得细胞色素C的产量，蛋白质的总含量。
再运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定细胞色素C的分子质量。
实验结果细胞色素C的产量为8.84mg，产率为60.86mg/kg,蛋白质浓度为0.722mg/ml,纯度为38.04%，细胞色素C的分子质量为12417，相对误差为0.14%。
关键词：细胞色素C 离心抽提抽滤透析消光法紫外吸收法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯度前言：细胞色素C是一种细胞色素C(Cytochrome C)是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶,是呼吸链中的一个基本成分,广泛存在于所有的需氧组织中。
一般说来,组织的细胞色素C的含量与它们的呼吸活性大致成平行关系,在心肌与其它作剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。
在细胞内细胞色素C位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中,是线粒体电子传递链中重要成员,在生物氧化过程中起着重要作用。
细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂,早期研究发现在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态,在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢,使细胞恢复正常呼吸,病情得到缓解或痊愈目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。
本实验以猪心为原料，向心肌中加入三氯乙酸溶液中，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则存留在三氯乙酸溶液中。
将硫酸氨粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白，血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C则仍留于溶液中。
进一步用三氯乙酸酸化此溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。
鉴定及测定细胞色素C用消光法。
在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为：氧化型细胞色素C：K1=0.9*10^4/克分子/厘米，还原型细胞色素C：K2=2.77*10^4/克分子/厘米，样品较纯时，从氧化型转变为还原型或者还原型转变为氧化型，消光值的情况相同。
细胞色素c的制备与相对分子质量的测定
细胞色素c的制备与相对分子质量的测定钟日龙(2009316044) 赵炀（山西大学生命科学学院山西太原市坞城路92号邮编：030006）摘要氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C在415nm、520nm和550nm有最大吸收峰。
550nm处的磨尔消光系数为2.77×l04moL/m。
其中还原型最稳定，实验中所获得的细胞色素产品是氧化型和还原型的混合物。
经氧化剂或还原剂处理，可变为单一种型。
测定其中一种的光吸收，根据磨尔消光系数，即可计算出细胞色素C的含量。
根据生物大分子所带电荷量和大小不同，利用SDS-聚病稀酰的胺凝胶电泳测定细胞色素C的相对分子质量关键词细胞色素C制备相对分子质量电泳法测定中国分类号：文献识别码：文章编号：Preparation of cytochrome c and molecular weight determinationZhong Ri Long (2009316044) Zhao Yang (College of Life Science, Shanxi University Taiyuan, Shanxi Province No. 92 Dock Road, City Zip: 030006)Summary of oxidized cytochrome C in the 408nm, 530nm maximum absorption peak of reduced cytochrome C at 415nm, 520nm and 550nm absorption maximum. Seoul mill at 550nm extinction coefficient 2.77 × l04moL / m. Which is also the most stable prototype experiment in the product obtained is oxidized cytochrome and also the prototype of the mixture. By oxidizing or reducing agent treatment, into one single type. One measurement of light absorption, extinction coefficient based on grinding Seoul, you can calculate the cytochrome C content. According to the charge of biological macromolecules amount and size of the different rare diseases usingSDS-poly amine acid gel electrophoresis of cytochrome C, molecular weight Key words cytochrome C preparation electrophoresis for determination of molecular weight正文1.前言细胞色素C是有效的电子传递体，对因组织缺氧引起的一系列症状，起到矫正细胞呼吸与物质代谢作用。
细胞色素C的制备及其测定及思考题答案
细胞色素C 的制备及其测定及思考题答案一、实验原理1、通过细胞色素C 的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤；2、掌握制备细胞色素C 的操作技术及其含量的测定方法。
二、实验原理：细胞色素C 的特点与实验原理三、实验器材、材料及试剂：1、器材：捣碎机、离心机、磁力搅拌器、可见分光光度计、玻璃层析柱（2.5cm×30cm）、透析袋、纱布、广泛PH 试纸、精密PH 试纸、烧杯（2000、1000、500mL ）、量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等；2、材料：（1）新鲜猪心、（2）人造沸石（60～80目）、（3）0.25mol/L NaOH 和1mol/L NaCl 混合液、（4）0.2% NaCl ，12%BaCl2，20%TCA ，2mol/L H2SO4、（5）0.06mol/L 磷酸氢二钠、0.4mol/L 氯化钠、（6）1%BaCl2三、实验步骤：1、细胞色素C 的制备：2.细胞色素C含量的测定：根据还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大光吸收这一特性，作出细胞色素C浓度和光吸收值标准曲线，然后根据所测定的光吸收值，由标准曲线的斜率来求得所测样品的含量。
具体操作如下：(1)标准曲线的绘制配制细胞色素C标准母液（3.24mg/mL）。
按下表配制标准样品的浓度梯度，再在各管中加入3mL的水，混匀，以0号管做空白对照，在520nm波长处测得各管的光吸收值（A520nm），如图：（2）样品测定取纯化后的细胞色素C液1mL加水3mL，混匀，测A520nm。
如果光吸收值不在标准曲线范围内（0～0.30），应用水稀释适当倍数后，重复上步的操作，然后换算。
五、结果计算：实验中测得的细胞色素C的光吸收值为：A520nm=0.266按照老师的计算公式(y=0.1675x)：样品浓度=1.588mg/mL我得到的吸光度与浓度换算公式(y=0.166x+0.0014)：样品浓度=1.594mg/mL原因：可能是所用软件运用不同的算法造成的误差。
细胞色素C提取
实验一、细胞色素C的制备和测定摘要：细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，包括多种能够传递电子的含铁蛋白质。
广泛存在于各种动植物组织和微生物中。
它是呼吸链中极重要的电子传递体。
细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。
在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。
在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。
本实验以新鲜牛心为材料提取、制备和纯化细胞色素C，得到其粗品溶液，并进行含量测定。
关键词：细胞色素C 提取制备纯化含量测定1、原理：细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。
广泛存在于各种动植物组织和微生物中。
它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C （cytochrome c，CytC）只是细胞色素的一种。
它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。
线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。
细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。
分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。
它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。
细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。
细胞色素C对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。
细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。
在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。
在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。
本实验以新鲜猪心为材料提取制备和纯化细胞色素C，得到其粗品溶液，方法简单易操作。
生化实验论文
细胞色素C的制备及测定摘要：本实验以猪心为主要原料，通过匀浆，抽滤，盐析，离心，透析等步骤提取其中的细胞色素C，并通过cytc含量测定，紫外分光光度计测定蛋白质的含量测定提取得到的细胞色素C的产量、产率和纯度，最后通过cytc溶液波峰扫描测定细胞色素C溶液的光吸收峰。
测得蛋白质含量为1.288mg/ml，产量为15.11mg，产率为58.33mg/公斤，符合标准。
Cytc 氧化型吸收峰在410nm和530nm，cytc还原型吸收峰在410nm和530nm处。
关键词：细胞色素C 制备产率 cytc正文1.前言：细胞色素C广泛存在于需氧细胞的线粒体中，是一种含血红素辅基的单链蛋白质，呼吸链的一个重要组成成份。
是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。
细胞色素C分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000道尔顿。
它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。
细胞色素C分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C制成还原型的，氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm，这一特性可用于细胞色素C的含量测定。
由于细胞色素C在心肌组织中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。
本实验以猪心为材料。
向心肌中加入三氯乙酸溶液，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则存留在三氯乙酸中。
将硫酸铵粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白、血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C仍留于溶液中。
进一步用三氯乙酸酸化此溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。
鉴定及测定细胞色素C用消光法。
在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为：氧化型细胞色素C：K1=0.9*10^4/克分子/厘米还原型细胞色素C：K2=2.77*10^4/克分子/厘米其含义为浓度是1克分子/升或1毫克分子/毫升的氧化型细胞色素C溶液，通过1厘米的光程，其消光值为0.9*10^4。
实验报告细胞色素C的提取
实验报告细胞色素C的提取一、实验目的1、熟悉细胞色素C提取与检测方法；2、掌握吸附、盐析、透析等实验技术。
二、实验原理细胞色素C是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶，广泛存在于所有的需氧组织中。
在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。
细胞色素C位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中，分子量约为13000，肽链中含有19个赖氨酸残基，为一碱性蛋白, 等电点（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。
人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。
在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。
装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C 交换下来。
硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。
硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。
另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。
三、实验仪器设备与材料试剂1、设备：组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱2、仪器：剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管3、试剂：联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵4、材料：新鲜猪心（2个）四、实验技术路线预处理水、硫酸、PH3.4新鲜猪心匀浆提取液氨水、pH6.0、过滤氨水、pH7.5、过滤滤液人造沸石水、氯化钠、硫酸铵硫酸铵盐析洗脱液滤液20%的三氯乙酸沉淀、离心、透析细胞色素C粗品溶液五、实验步骤1、预处理：健康猪心去脂肪等结缔组织—→剪碎放入碎冰中（保护酶的活性，避免捣碎机破碎时使酶失活）—→放入生理盐水中清洗去污—→称重：烧杯80g，烧杯＋猪心=240g，（240-80）×1.5=240ml酸化水—→组织捣碎机匀浆10min（匀浆3min，停5min，为了保证捣碎机安全）2、提取：搅拌后静置2h—→四层纱布过滤后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在过滤后静置2h—→放入冰箱保存过夜—→从冰箱中取出—→加2mol/L氨水调PH 至6.0，静置30min，过滤—→滤液加2mol/L氨水调PH至7.5，静置30min,过滤3、吸附：加10%人造沸石（滤液为220ml）—→磁力搅拌器搅拌吸附1h—→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→滤出人造沸石待用4、洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液（没分辨出红色液体阶段，收集了所有洗脱液）5、盐析：在洗脱液（300ml）中慢慢加入固体硫酸铵75g, 边加边搅拌，使硫酸铵溶液的浓度为50%—→置4℃冰箱过夜—→过滤，收集滤液—→向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液（过滤液和20%三氯乙酸溶液最好在4℃遇冷, 边加边搅拌, 加时要快, 防止局部蛋白质变性）—→加完后分成8管，立即离心—→无明显沉淀，再5000转离心15min—→无明显沉淀，向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液—→再5000转离心15min—→无明显沉淀，实验结束6、透析将上述溶解后的细胞色素C 装入透析袋中, 放进500ml烧杯中（用磁力搅拌器搅拌），用去离子水透析, 除去硫酸根离子，15min换水一次，换手3~4次后，检查硫酸根离子是否已被除尽。
实验二、细胞色素C的制备和检测
粗品A520nm×C标准×V标准 细胞色素C粗品质量浓度（mg/ml） =—————————————— 标准溶液A520nm×V粗品
思考题： 1、还有那些方法可以进行蛋白质脱盐处理？ 2、熟悉、了解酶活力测定方法.
4.Cyt C纯度鉴定 （1）采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行杂蛋 白的检测。 分离胶浓度为l0%，浓缩胶浓度3%，染 色采用常规固定染色法。精制后Cyt C的 电泳谱带仅一条纯度较高．粗品溶液谱 带有3条，所含杂蛋白较多，说明所用提 纯方法有效。
3、细胞色素C粗品液质量浓度测定（标准管法）
取5支试管按表加入试剂测定：
试管编号
标准液 /mL 样品液 /mL dH2O 还原粉 A520nm
1
0
2
0.5 0 2.5
少许（约 3mg）
3
0.5
4
0 0.5 2.5
少许（约 3mg）
5
0 0.5 2.5
少许（约 3mg）
0 3.0
少许（约 3mg）
0 2.5
（4）洗脱
吸附完毕，可在柱内洗涤：依次用 30ml 自来水、去离子水、 0.2% 氯化钠溶液、 去离子水洗柱。然后用 25% 硫酸铵溶液 洗脱（流速小于2ml/min），收集红色洗 脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收 集），测量体积（控制在 15ml 左右）。 洗脱完毕，人造沸石回收，可再生使用。
（5）盐析
4 、三氯乙酸是一种蛋白变性剂，可使蛋白质变 性沉淀。要通过控制三氯乙酸的浓度和作用时 间，使其产生的是可逆沉淀，达到进一步纯化 作用。因此必须要逐滴加入三氯乙酸，搅匀后 尽快离心，避免局部酸浓度过大和接触时间过 长，产生细胞色素 C 不可逆变性沉淀造成损失。 5、透析脱盐是利用细胞色素C分子较大，不能通 过一定截留值的半透膜，而其中的盐分由于分 子较小，浓度很高，容易透过半透膜从高浓度 向低浓度的水相移动，达到去除效果。并且在 透析前一定要检查透析袋有无渗漏
细胞色素C的制备和测定(分离工程)3
细胞色素C的制备和测定目的要求（1）通过细胞色素C的测定，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤。
（2）掌握制备细胞色素C的操作技术及含量测定方法。
实验原理细胞色素C使包括多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称。
它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。
细胞色素C使呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C 只是细胞色素的一种。
它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。
细胞色素C为含铁啉的结合蛋白质，分子量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成。
它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分为氧化型和还原型两种，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。
细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯已酸和乙酸可使之变形，引起某些失活。
本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。
试剂和器材一、材料猪心。
二、试剂2mol/LH2SO4溶液, 1mol/LNH4OH氨水溶液，0.2%NaCl，25%（NH4）2SO4溶液（100 ml 溶液中含25 g（NH4）2SO4，约为25℃时40%的饱和度），BaCl2试剂,20%三氯乙酸（TCA）溶液，人造沸石，联二亚硫酸钠，考马斯亮蓝试剂。
三、器材绞肉机，电磁搅拌器，电动搅拌器，离心机，722型分光光度计，烧杯（2000ml，1000ml，500ml，200ml，50ml各若干），量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃棒，透析袋，纱布，滤纸，容量瓶，试管，试管架，吸量管。
操作方法一、材料处理新鲜猪心，除去脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小块，放入绞肉机中绞碎。
二、提取称取心肌碎肉150g，放入1000ml烧杯中，加蒸馏水300ml。
用电动搅拌器搅拌，加入2mol/L H2SO4，调PH值至4.0，在室温下搅拌提取2h。
用调PH至6.0，停止搅拌。
用数层纱布过滤，收集滤液，滤渣加入750ml蒸馏水，按上述条件重复提取1h，两次提取液合并。
细胞色素C的制备及其测定及思考题答案
细胞色素C 的制备及其测定及思考题答案一、实验原理 1、通过细胞色素C 的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤；2、掌握制备细胞色素C 的操作技术及其含量的测定方法。
二、实验原理：细胞色素C 的特点与实验原理三、实验器材、材料及试剂：1、器材：捣碎机、离心机、磁力搅拌器、可见分光光度计、玻璃层析柱（2.5cm×30cm）、透析袋、纱布、广泛PH 试纸、精密PH 试纸、烧杯（2000、1000、500mL ）、量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等；2、材料：（1）新鲜猪心、（2）人造沸石（60～80目）、（3）0.25mol/L NaOH 和1mol/L NaCl 混合液、（4）0.2% NaCl ，12%BaCl2，20%TCA ，2mol/L H2SO4、（5）0.06mol/L 磷酸氢二钠、0.4mol/L 氯化钠、（6）1%BaCl2三、实验步骤：1、细胞色素C 的制备：2.细胞色素C含量的测定：根据还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大光吸收这一特性，作出细胞色素C浓度和光吸收值标准曲线，然后根据所测定的光吸收值，由标准曲线的斜率来求得所测样品的含量。
具体操作如下：(1)标准曲线的绘制配制细胞色素C标准母液（3.24mg/mL）。
按下表配制标准样品的浓度梯度，再在各管中加入3mL的水，混匀，以0号管做空白对照，在520nm波长处测得各管的光吸收值（A520nm），如图：（2）样品测定取纯化后的细胞色素C液1mL加水3mL，混匀，测A520nm。
如果光吸收值不在标准曲线范围内（0～0.30），应用水稀释适当倍数后，重复上步的操作，然后换算。
五、结果计算：实验中测得的细胞色素C的光吸收值为：A520nm=0.266按照老师的计算公式(y=0.1675x)：样品浓度=1.588mg/mL我得到的吸光度与浓度换算公式(y=0.166x+0.0014)：样品浓度=1.594mg/mL原因：可能是所用软件运用不同的算法造成的误差。
提取细胞色素c的研究
提取细胞色素c的研究细胞色素C（CPC）是一种十分重要的植物天然产物，它广泛存在于植物细胞质和细胞壁中，具有多种功能，如调节细胞内水分的平衡、促进内源性抗氧化剂的合成、增强植物抗病能力等。
由于其具有许多重要的生物活性，因此，提取细胞色素C具有重要的实际意义。
1、细胞色素C的提取方法目前，主要采用几种提取方法进行提取细胞色素C，包括一种是抽提法，一种是碱提取法，一种是超声波提取法以及一种固相萃取技术，当中抽提法和碱提取法是较常用的提取方法。
（1）抽提法：该方法是将植物细胞质装入离心管中，然后加入适当的溶剂如乙醇和水，将溶液抽出注入另一个离心管中，然后将植物细胞质从溶液中分离出来，即可提取出细胞色素C。
（2）碱提取法：该方法是将植物细胞质和冷水一起放入容器中，并加入一定量的碱，使植物细胞质中细胞色素C与碱发生反应，然后经过离心，使细胞色素C和其他不利因素分离开来，从而实现细胞色素C的提取。
（3）超声波提取法：该方法是将植物细胞质和提取剂放入容器中，然后加入超声波处理，使植物细胞质中的细胞色素C与提取剂发生反应，然后将混合液离心，使植物细胞质和杂质分离，即可获得细胞色素C。
（4）固相萃取技术：该方法基于固相萃取技术，利用多种有机溶剂和生物亲和剂对细胞色素C进行提取，将植物细胞质基质吸附，然后再经过多次萃取，即可提取出细胞色素C。
2、细胞色素C的应用细胞色素C具有多种生物活性，可应用于各种领域，如化妆品、药物、食品等。
目前，细胞色素C可用于护肤保湿、防晒、抗疲劳、抗衰老等。
同时，它也是一种有效抗氧化剂，可以有效抑制脂质过氧化反应，减少皮肤中的自由基，从而保护皮肤细胞免受自由基的损害，可以延缓皮肤衰老，从而使皮肤更加细腻光滑。
此外，细胞色素C也可以用于治疗各种疾病，如多发性硬化症、贫血、高血压等。
研究表明，细胞色素C通过氧化还原反应可以与特定的疾病相关的蛋白质结合，从而起到抑制或促进其功能的作用，因此可能是有效的治疗多发性硬化症的药物之一。
提取细胞色素c的研究
提取细胞色素c的研究细胞色素C(Chlorophyll)，又称叶绿素，是一种类卟啉复合物，目前是生物体中最重要的有机物之一。
由于它具有优良的生物活性，被广泛应用于食品、药物和其他产品中，因此，提取细胞色素C分子对于现代科学技术的发展有着重要的意义。
目前，提取细胞色素C采用化学法和生物法相结合的方式。
其中，化学法分为水溶性细胞色素C提取法和油溶性细胞色素C提取法。
溶性细胞色素C提取法是将植物中含有水溶性细胞色素C的物质，通过酸溶剂或碱溶剂对细胞色素C分子进行溶解，使它们可以被溶解到含有细胞色素C的溶液中，再经过过滤、萃取、净化等工序等，最终得到纯度高的细胞色素C分子。
油溶性细胞色素C提取法则是将植物中含有油溶性细胞色素C的物质，用有机溶剂溶解，将细胞色素C分子溶解到溶剂中，然后再经过过滤、萃取、净化等工序等，最终得到纯度高的细胞色素C分子。
此外，生物法提取细胞色素C主要是利用微生物进行产细胞色素C的方法，如利用厌氧发酵技术，利用嗜热发酵技术等。
在微生物发酵过程中，会产生大量的细胞色素C，将其经过过滤、萃取、净化等工序等，最终得到纯度高的细胞色素C分子。
细胞色素C被广泛应用在食品、药物和其他产品中。
例如，细胞色素C在食品领域中，它能够增强食物的营养成分，促进食物的新陈代谢，提高食物的色泽以及口感，还有防止脂肪氧化等功能。
在药物领域，细胞色素C可以提高药物体内的消化吸收，促进药物的吸收以及调节免疫系统等功能。
总而言之，提取细胞色素C分子对于实现更多的应用而言，技术的发展是不可替代的。
化学法和生物法相结合是提取细胞色素C分子的实用方法，并且在未来可能会发展出更多的技术。
对于这种技术的发展，未来的研究将会有助于细胞色素C的利用更加广泛，为人们带来更多的好处。
实验报告细胞色素C的提取
实验报告细胞色素C的提取一、实验目的1、熟悉细胞色素C提取与检测方法；2、掌握吸附、盐析、透析等实验技术。
二、实验原理细胞色素C是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶，广泛存在于所有的需氧组织中。
在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。
细胞色素C位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中，分子量约为13000，肽链中含有19个赖氨酸残基，为一碱性蛋白, 等电点（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。
人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。
在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。
装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C 交换下来。
硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。
硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。
另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。
三、实验仪器设备与材料试剂1、设备：组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱2、仪器：剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管3、试剂：联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵4、材料：新鲜猪心（2个）四、实验技术路线预处理水、硫酸、PH3.4新鲜猪心匀浆提取液氨水、pH6.0、过滤氨水、pH7.5、过滤滤液人造沸石水、氯化钠、硫酸铵硫酸铵盐析洗脱液滤液20%的三氯乙酸沉淀、离心、透析细胞色素C粗品溶液五、实验步骤1、预处理：健康猪心去脂肪等结缔组织—→剪碎放入碎冰中（保护酶的活性，避免捣碎机破碎时使酶失活）—→放入生理盐水中清洗去污—→称重：烧杯80g，烧杯＋猪心=240g，（240-80）×1.5=240ml酸化水—→组织捣碎机匀浆10min（匀浆3min，停5min，为了保证捣碎机安全）2、提取：搅拌后静置2h—→四层纱布过滤后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在过滤后静置2h—→放入冰箱保存过夜—→从冰箱中取出—→加2mol/L氨水调PH 至6.0，静置30min，过滤—→滤液加2mol/L氨水调PH至7.5，静置30min,过滤3、吸附：加10%人造沸石（滤液为220ml）—→磁力搅拌器搅拌吸附1h—→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→滤出人造沸石待用4、洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液（没分辨出红色液体阶段，收集了所有洗脱液）5、盐析：在洗脱液（300ml）中慢慢加入固体硫酸铵75g, 边加边搅拌，使硫酸铵溶液的浓度为50%—→置4℃冰箱过夜—→过滤，收集滤液—→向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液（过滤液和20%三氯乙酸溶液最好在4℃遇冷, 边加边搅拌, 加时要快, 防止局部蛋白质变性）—→加完后分成8管，立即离心—→无明显沉淀，再5000转离心15min—→无明显沉淀，向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液—→再5000转离心15min—→无明显沉淀，实验结束6、透析将上述溶解后的细胞色素C 装入透析袋中, 放进500ml烧杯中（用磁力搅拌器搅拌），用去离子水透析, 除去硫酸根离子，15min换水一次，换手3~4次后，检查硫酸根离子是否已被除尽。
细胞色素c的制备与相对分子质量的测定
细胞色素c的制备与相对分子质量的测定钟日龙(2009316044) 赵炀（山西大学生命科学学院山西太原市坞城路92号邮编：030006）摘要氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C在415nm、520nm和550nm有最大吸收峰。
550nm处的磨尔消光系数为2.77×l04moL/m。
其中还原型最稳定，实验中所获得的细胞色素产品是氧化型和还原型的混合物。
经氧化剂或还原剂处理，可变为单一种型。
测定其中一种的光吸收，根据磨尔消光系数，即可计算出细胞色素C的含量。
根据生物大分子所带电荷量和大小不同，利用SDS-聚病稀酰的胺凝胶电泳测定细胞色素C的相对分子质量关键词细胞色素C制备相对分子质量电泳法测定中国分类号：文献识别码：文章编号：Preparation of cytochrome c and molecular weight determinationZhong Ri Long (2009316044) Zhao Yang (College of Life Science, Shanxi University Taiyuan, Shanxi Province No. 92 Dock Road, City Zip: 030006)Summary of oxidized cytochrome C in the 408nm, 530nm maximum absorption peak of reduced cytochrome C at 415nm, 520nm and 550nm absorption maximum. Seoul mill at 550nm extinction coefficient 2.77 × l04moL / m. Which is also the most stable prototype experiment in the product obtained is oxidized cytochrome and also the prototype of the mixture. By oxidizing or reducing agent treatment, into one single type. One measurement of light absorption, extinction coefficient based on grinding Seoul, you can calculate the cytochrome C content. According to the charge of biological macromolecules amount and size of the different rare diseases usingSDS-poly amine acid gel electrophoresis of cytochrome C, molecular weight Key words cytochrome C preparation electrophoresis for determination of molecular weight正文1.前言细胞色素C是有效的电子传递体，对因组织缺氧引起的一系列症状，起到矫正细胞呼吸与物质代谢作用。
实验三、细胞色素C的制备
A520nm
以细胞色素C的浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度 A520nm为纵坐标制作标准曲线，从标准曲线上计算出样品 液中细胞色素C的质量（mg）。
注意事项： 1、酸水提取时，由于组织液的释出使 pH上升，因此需不断调整pH直至稳定在 pH3.5-4.0。 2、为使细胞色素C充分被沸石柱吸附， 吸附时流速应该慢些。洗脱时同样控制 流速慢些，使细胞色素C在比较少体积内 被充分洗脱出来。 3、盐析时需加入粉末状硫酸铵，并且边 加边搅拌，切忌一下子到进去，造成局 部浓度过大使细胞色素C被盐析。
6、为尽量减少损失，在每个操作过程都 要细心，例如过滤用的纱布、滤纸事前 一定要用少量水润湿。 7、加入过多还原粉（联二亚硫酸钠）会 使测定溶液迅速变混浊而无法比色，因 此加入量应严格控制，并迅速比色。
思考题：
1、试以细胞色素C的制备为例，总结出蛋 白质制备（分离纯化）的主要方法，并简 述其原理。
CytC）只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色
素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素 绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松， 较易被分离纯化。
细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分 子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋
白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量
2、本实验应用了哪些基本的生化分离纯化
的方法？
3、有那些方法可以进行蛋白质脱盐处理？
较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水， 在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。
细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子 可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，
细胞色素C制备
7.用1 mL蒸馏水溶解沉淀，将此悬浮液移入透析袋，
透析至无（NH4）2SO4和TCA。 8.透析后的细胞色素C溶液4000 r/min离心20 min去 除沉淀，得到粉红色滤液。 六、注意事项 1.加入（NH4）2SO4时要先将其磨成粉末，再缓慢地边 搅拌边加入。 2. 10％NaOH溶液调混合液pH值至7.3时，一定不能调 过头，否则细胞色素C易变性。 3.透析时要求低温，透析袋要避免破漏，每隔几小时 要换透析液，并用Ba2+检查是否还有SO42－存在。
三、材料、试剂与器材 材料、 材料：猪心 试剂： 20% TCA、 0.145 mol/L TCA、硫酸铵、10% NaOH 器材：组织捣碎机 、离心机、磁力搅拌器
四、离心机的使用 (1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平 面。 (2).使用前应检查套环是否平衡。 (3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡。 (4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡， 平衡后把它们放置于转子的对称位置。 (5).盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。 (6).启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要 2~3min)。 (7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间。 (8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。 (9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品。
五、操作方法 1. 新鲜猪心50 g，切碎，加等量0.145 mol/L TCA，高 速组织捣碎机匀浆2min。使cytc从线粒体膜上解聚下 来。 2. 用6层纱布过滤匀浆液去杂质。并于室温放置抽提3小 时。 3. 用10％ NaOH溶液将上述混合液调pH值至7.3，并测定 体积。 ——以利于（NH4）2SO4沉淀去杂蛋白 4. 按500 g/L混合液缓慢加入（NH4 ） 2SO4 粉末，边加边 搅拌。放置一段时间，4000 r/m离心20 min去除沉淀， 得到粉红色滤液，测定体积。 5. 进一步按50 g/L滤液缓慢加入（NH4）2SO4粉末，边加 边搅拌。放置一段时间，4000 r/m离心20 min去除沉 淀，得到粉红色滤液，测定体积。 6. 加入20%TCA（25 mol/L上清）—沉淀cytc。3000r/m 离心15 min得到沉淀。
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袋，对自来水、去离子水各透析 30min（用磁力搅拌器搅拌），用 BaCl2 检测透析袋周围的水（用试 管收集流下来的透析液约1ml，滴 加1-2滴BaCl2 试剂至试管中。摇 匀若无白色沉淀，表示透析完 全）。过滤除去不溶物质，得到 细胞色素C的粗品液，量体积，测 定其含量。
（4）洗脱
吸附完毕，在柱内洗涤：依次用 30ml自来水、去离子水、0.2%氯化钠溶 液、去离子水洗柱。然后用25%硫酸铵 溶液洗脱（流速小于1ml/min），收集红 色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止 收集），测量体积（控制在15ml左右）。 洗脱完毕，回收人造沸石，可再生使用。
（5）盐析 为了进一步纯化细胞色素C，向洗脱 液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌， 使 硫 酸 铵 溶 液 浓 度 为 45% （ 约 相 当 于 67%的饱和度，即100ml洗脱液加17g硫 酸铵），放置30min以上(最好过夜)，杂 蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的 细胞色素C滤液，测量体积。
实验三、细胞色素C的制备和测定
9学时
一、实验目的：
1、通过细胞色素C的制备，了解蛋白质分离
纯化的一般原理和步骤。
2、掌握制备细胞色素C的操作技术及含量测
定方法。
二、 原理：
细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总 称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸 链中极重要的电子传递体，细胞色素C（cytochrome c，
半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒
磁力搅拌器
3、细胞色素C含量测定
细胞色素C含量的标准曲线
试管编号 标准溶液 （ml） 蒸馏水 （ml） 还原粉 （联二亚 硫酸钠）
1 0 4
2 0.2 3.8
3 0.4 3.6
4 0.6 3.4
5 0.8 3.2Fra bibliotek6 1.0 3.0
7（样品液) (ml） 4 0
少许（约3mg）
（6）三氯乙酸（TCA）沉淀 按8%体积滴加20%TCA，边加边搅
拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生
成可逆沉淀析出，立即离心
(4000rpm,10min),收集沉淀（若上清液仍
为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，
再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离
子水溶解（体积不超过10mL）。
（7）透析
三、试验材料和方法 1、材料： 新鲜（冷冻）动物心脏 2、试剂
（1）25%(NH4)2SO4，12%BaCl2，联二亚硫酸钠。 （2）人造沸石：白色颗粒， 40-60目。 （3）20% 三氯乙酸（TCA）、1mol/L H2SO4、 1mol/L NH4OH溶液、 0.2% NaCl、 细胞色素C标准液（3mg/ml）
3、仪器： 绞肉机、电磁搅拌器、离心机、分光光度计、 透析袋、层析柱、烧杯、纱布等
四、实验方法： 1、材料处理 新鲜或冷冻动物心脏，除尽脂肪、血管和 韧带，洗尽积血，切成小块，放入绞肉机中绞 碎（两遍）。 2、细胞色素C粗品制备 （1）提取： 称取动物心脏碎肉500克，加自来水800毫 升酸化水（水预先用6-8毫升，1mol/L的硫酸 酸化）。用电磁搅拌器搅拌提取，用1mol/L的 硫酸调pH=4.0（需要不断调整），搅拌提取2 小时。用1mol/L的氨水调pH=6.0，停止搅拌。 四层纱布挤压过滤，收集滤液。
A520nm
以细胞色素C的浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度 A520nm为纵坐标制作标准曲线，从标准曲线上计算出样品 液中细胞色素C的质量（mg）。
注意事项： 1、酸水提取时，由于组织液的释出使 pH上升，因此需不断调整pH直至稳定在 pH3.5-4.0。 2、为使细胞色素C充分被沸石柱吸附， 吸附时流速应该慢些。洗脱时同样控制 流速慢些，使细胞色素C在比较少体积内 被充分洗脱出来。 3、盐析时需加入粉末状硫酸铵，并且边 加边搅拌，切忌一下子到进去，造成局 部浓度过大使细胞色素C被盐析。
细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠 正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代 谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。在自然界 中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的 活动强度成正比。本实验以新鲜动物心脏为材料提取、纯 化细胞色素C，制备其粗品溶液，方法简单易操作。
CytC）只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色
素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素 绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松， 较易被分离纯化。
细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分 子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋
白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量
2、本实验应用了哪些基本的生化分离纯化
的方法？
3、有那些方法可以进行蛋白质脱盐处理？
（2）中和：
用1mol/L的氨水调滤液pH=7.2-7.5，
利用等电点沉淀杂蛋白，静置20-30min，
使沉淀沉下。虹吸上清夜，过滤除杂质，
下部浑浊液离心（4000rpm,10min）。合
并得到的红色清液，测量体积。
（3）吸附： 称取人造沸石4g，加水搅拌，除去12s内 不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2体积， 然后边搅拌边连续、均匀地将预处理好的人造 沸石水溶液装填入柱，避免柱内出现气泡。装 柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩 下一薄层水。 将中和好的澄清滤液小心加到沸石上面， 勿冲动沸石，使之流入柱内进行吸附，控制流 出液的速度不超过5ml/min。随着细胞色素C被 吸附，人造沸石由白色变为红色，流出液应为 淡黄色或微红色。
4、三氯乙酸是一种蛋白变性剂，可使蛋白质 变性沉淀。要通过控制三氯乙酸的浓度和作用 时间，使其产生的是可逆沉淀，达到进一步纯 化作用。因此必须要逐滴加入三氯乙酸，搅匀 后尽快离心，避免局部酸浓度过大和接触时间 过长，产生细胞色素C不可逆变性沉淀造成损 失。 5、透析脱盐是利用细胞色素C分子较大，不能 通过一定截留值的半透膜，而其中的盐由于分 子较小，浓度很高，容易透过半透膜从高浓度 向低浓度的水相移动，达到去除效果。在透析 前一定要检查透析袋有无渗漏
较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水， 在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。
细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子 可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，
前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对
热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引 起某些失活。
6、为尽量减少损失，在每个操作过程都 要细心，例如过滤用的纱布、滤纸事前 一定要用少量水润湿。 7、加入过多还原粉（联二亚硫酸钠）会 使测定溶液迅速变混浊而无法比色，因 此加入量应严格控制，并迅速比色。
思考题：
1、试以细胞色素C的制备为例，总结出蛋 白质制备（分离纯化）的主要方法，并简 述其原理。