第八章 固定化细胞和酶1
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
固定化技术应用-酶和细胞的固定化
固定化技术应用－酶和细胞的固定化试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。
选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。
也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。
问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？011.固定化酶技术固定化酶技术是用物理或化学手段。
将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
2.固定化酶技术的发展以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。
科学家们就开始了同定化酶的研究工作。
1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。
当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。
邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。
Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。
（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。
（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。
（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
b.提高了果糖的产量和品质。
2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。
（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。
二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。
葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。
但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。
因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。
本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。
【关键词】酶细胞固定化载体应用酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。
20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。
工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。
所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。
固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。
一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。
一、固定化技术分类1.吸附法很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。
后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。
2.共價结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。
生物催化剂技术
8.1 生物催化剂的类别 类别——起催化作用的游离或固定化细胞或酶的总称
8.2 生物催化反应的特征 （1）催化效率极高 传统化工催化剂用量0.1-1%，酶用量10-40-10-30 % （2）选择性极高（相对/绝对专一性） 一种酶只能催化一种底物，（绝对专一性） 一种酶能催化一类结构相似的底物，（相对专一性） （3）催化条件极温和 常温、常压、PH=5-8（通常在7）
某些无机材料如介孔分子筛、半导体等具有类似生物酶的 功能 分子印迹技术和分子识别技术已被用于模拟酶的设计制备
（5）异构酶 EC5 异构化，分子重排等
（6）连续酶 EC6 也称合成酶
命名：习惯命名、系统命名、系统分类命名 系统分类命名——EC后缀4位数字（例如EC3.1.1.3）
第一位数字——表示酶的类别 第二位数字——表示底物中被催化的基团或键的特点 第三位数字——表示亚类类型 第四位数字——表示登记号 单纯酶 由简单蛋白构成的酶 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、脲酶等 结合酶 除蛋白（酶蛋白）外，还有非蛋白成分（辅酶或辅因子） 如大多数的氧化还原酶
绝对专一性实例
相对专一性实例
键专一性或基团专一性—— 酯酶可对所有含酯键的酯类化合物进行催化
8.3 酶的系统分类及命名 目前已鉴定出2000多种酶，并得到200多种结晶体。
分类
（1）氧化还原酶 EC1 氧化还原
（2）转移酶
EC2 从一个底物转移到另一个底物
（3）水解酶
EC3 水解
（4）裂解酶 EC4 裂解
用于工业生物催化反应器。 抗体酶——化学与免疫学结合产生的催化抗体
用于解决天然酶在手性合成中无法解决的问题 抗体——动物为抗拒外来物质的入侵而合成的蛋白质
酶与细胞的固定化
酶与细胞的固定化
一、为什么要进行酶的固定化？
（1）游离酶的稳定性较差：在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。
(2)游离酶难于连续化生产：酶与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用。
这种一次性使用酶的方式，不仅使成本较高，而且难于连续化生产。
(3)游离酶给下游的纯化工作带来了难度：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。
二、固定化酶的概念：是指固定在载体上或被限制在一定的空间范围内，能连续进行催化反应，且反应后能回收并重复利用的酶。
三、固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。
也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
四、与游离酶相比，固定化酶优缺点各在哪里？
固定化酶优点：
五、固定化方法有哪几类？各类的优缺点及适合范围是什么？
酶固定化的方法很多，主要可分为载体结合法、交联法、包埋法和热处理法等。
现分述如下；。
固定化酶与固定化细胞
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
生物化学(第三版)第八章 酶通论课后习题详细解答 复习重点
第八章酶通论提要生物体内的各种化学变化都是在酶催化下进行的。
酶是由生物细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。
与一般催化剂相比有其共同性，但又有显著的特点，酶的催化效率高，具有高度的专一性，酶的活性受多种因素调节控制，酶作用条件温和，但不够稳定。
酶的化学本质除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白质。
根据酶的化学组成可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质是由不表现酶活力的脱辅酶及辅因子（包括辅酶、辅基及某些金属离子）两部分组成。
脱辅酶部分决定酶催化的专一性，而辅酶（或辅基）在酶催化作用中通常起传递电子、原子或某些化学基团的作用。
根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为六大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。
按规定每种酶都有一个习惯名称和国际系统名称，并且有一个编号。
酶对催化的底物有高度的选择性，即专一性。
酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质。
酶的专一性可分为结构专一性和立体异构专一性两种类型。
用“诱导契合说”解释酶的专一性已被人们所接受。
酶的分离纯化是酶学研究的基础。
已知大多数酶的本质是蛋白质，因此用分离纯化蛋白质的方法纯化酶，不过要注意选择合适的材料，操作条件要温和。
在酶的制备过程中，没一步都要测定酶的活力和比活力，以了解酶的回收率及提纯倍数，以便判断提纯的效果。
酶活力是指在一定条件下酶催化某一化学反应的能力，可用反应初速率来表示。
测定酶活力及测酶反应的初速率。
酶活力大小来表示酶含量的多少。
20世纪80年代初，Cech和Altmsn分别发现了某些RNA分子具有催化作用，定名为核酶（ribozyme）。
有催化分子内和分分子间反应的核酶。
具有催化功能RNA的发现，开辟了生物化学研究的新领域，提出了生命起源的新概念。
根据发夹状或锤头状二级结构原理，可以设计出各种人工核酶，用作抗病毒和抗肿瘤的防治药物将会有良好的应用前景。
抗体酶是一种具有催化能力的蛋白质，本质上是免疫球蛋白，但是在易变区赋予了酶的属性。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术方法，广泛应用于食品工业、医药工业、环境保护等领域。
通过这种技术，酶或细胞被固定在一种固体材料上，从而增强了它们的稳定性和重复使用性，提高了生产效率和产品质量。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、优势以及在不同领域的应用情况。
酶及细胞固定化技术的原理主要是通过将酶或细胞固定在一种固定载体上，使其能够稳定地存在于一定的环境中并保持其生物活性。
固定载体一般是多孔性的固体材料，如珠状树脂、活性炭、聚合物材料等。
在固定化过程中，酶或细胞通常会与载体表面发生物理或化学结合，从而实现固定化。
固定化后的酶或细胞能够在一定条件下发挥作用，实现对底物的转化或反应。
二、酶及细胞固定化技术的优势相较于游离态的酶或细胞，在固定化状态下具有以下优势：1.稳定性高：固定化后的酶或细胞能够更好地耐受环境变化，如温度、pH值等变化，从而提高其稳定性和长期使用的能力。
2.重复使用性强：固定化后的酶或细胞能够被多次使用，降低了成本，提高了生产效率。
3.易于分离：固定化后的酶或细胞与反应物之间的分离更加便利，便于后续操作和产品纯化。
4.改善环境适应性：固定化后的酶或细胞对不同环境条件的适应能力更强，可在复杂环境中发挥作用，适用范围更广。
5.抑制酶或细胞的不良反应：在固定化状态下，酶或细胞的不良反应如自身降解被抑制，更加稳定可靠。
酶及细胞固定化技术在食品工业中得到了广泛应用。
一些发酵产品的生产过程中，固定化酶或细胞能够提高发酵效率、缩短发酵周期，并且保证产品的稳定性和质量。
在乳制品工业中，利用固定化乳酸菌进行发酵能够保持产品的风味和质量，并且加速乳酸发酵的速度，提高了生产效率。
固定化酶还可以应用于酶解工艺，如利用固定化酶对淀粉、蛋白质等进行水解，得到高质量的发酵原料。
固定化技术还可以用于改善食品加工过程中的废水处理，通过固定化细胞去除废水中的有机物和重金属离子，净化废水，达到环保的目的。
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
生化工程固定化酶和细胞
底物从反应液传递到载体表面 （外扩散）
↓
底物从载体表面移向酶活性中心 （内扩散）
↓
底物与酶反应
↓
产物由反应位点移向载体表面 （内扩散）
↓
产物传递到反应液中（外扩散）
¾ 总的反应速度取决于最慢的步 骤
就是说固定化酶反应过程是由底物及产物的外 扩散、内扩散及反应等一系列分过程组成的。 传质过程必然影响到总体过程的速率。
④选择率Ssp (selectivity)
当反应过程中有副反应发生，除生成目的产物 外，还生成其它产物时，通常使用选择率这个概 念。
Ssp是指实际转化成目的产物量与全部底物可生
成产物S的sp 理= 论as量p (之sp0 比− 。s)
式 中 asp代表1摩尔底物能生成目的产物P的理论量 （摩尔），其数值取决于反应的计量式。
这种由物质扩散引起的固定化酶反应动力学与 游离酶间的差异称为扩散效应。
一般规律为： ①这种效应对反应速度的影响程度既取决于该效
应本身的大小，也取决于它和酶反应固有速度的 相对大小。这就是说，如果酶反应本身的速度很
小，扩散限制产生的影响也就小一些；反之，扩 散限制就将在整个过程起律速作用。
将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床， 然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现 酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液 (含产物)。在柱床中，液体流动状态接近于平推 流(又称活塞流)型，因此，填充床反应器可以近 似地看成是一种平推流型反应器。
填充床反应器
带循环的填充 床反应器
由于它且有高效率、易操作、结构简单等优点， 因而是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反 应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体 颗粒、强度不大的底物溶液，以及有产物抑制的 转化反应。
酶和细胞的固定化
研究得较多的载体是壳聚糖和海藻酸钠。由于 天然高分子材料存在强度较低，在厌氧条件下 易被微生物所分解，使用寿命较短，而且天然 高分子材料原料来源往往受产地所限，这在一 定程度上限制了其应用。
合成有机高分子材料
合成有机高分子材料由于其化学、物理性能都 有很大的可变性，从理论上来说，可以担当任 何一种酶的固定化载体，而且它们对微生物的 腐蚀也有较强的抵抗力。另外，与天然高分子 材料相比，合成有机高分子凝胶载体还有强度 较大的优点。
酶的催化具有高选择性、高催化活性、反应条 件温和、环保无污染等特点。但游离状态的酶 对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等 稳定性较差，易失活，并且反应后混入底物等 物质，纯化困难，不能重复使用。
历史简介
1916年Nelson和Griffin首先发现了酶的固定 化现象，从此科学家就开始了固定化酶的研究 工作。1969年日本一家制药公司第一次将固 定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中 生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的 新纪元。
(5) 组成和粒径：一般来说，材料的孔径越小， 其比表面积就越大，与自由酶固定化程度就越 高，固定化率也就越高。
(6) 对微生物的抵抗性：在长时间的使用中， 载体材料必须要能防止微生物的降解作用，对 微生物抵抗性好的载体材料可以长时间的使用。
(7) 经济性和环保：来源经济、丰富，无毒、 可降解。
3. 固定化细胞的方法
细胞的固定化主要是活细胞的固定化，是一种 不用载体的工艺。通过化学的或物理的手段， 使整个细胞彼此附着相连。
化学交联
化学交联是指细胞体借助双功能或多功能试剂， 如醛或胺的共价附着相连。固定含L-天门冬氨 酸解氨酶(天门冬氨酸酶)活性的大肠杆菌细胞， 它们是通过应用双功能试剂(戊二醛，以及甲 苯二异氰酸酯)来强化细胞壁或细胞膜的交联。
固定化细胞制备及应用事例
固定化细胞制备及应用事例固定化细胞是将活细胞固定在材料上，以实现其在生物反应或工业生产中的应用。
利用固定化细胞可以提高细胞的稳定性和生物活性，延长其寿命，并简化细胞分离和生产过程。
下面将介绍固定化细胞制备及应用的一些事例。
一、酶固定化1. 葡萄糖异构酶固定化：葡萄糖异构酶（GI）是一种重要的酶，用于将葡萄糖转化为果糖。
将GI固定在聚丙烯酸酯(PVA)凝胶中，可以实现连续和稳定的果糖生产。
此外，还可以将GI固定在金属氧化物纳米粒子上，以提高反应速率和酶稳定性。
2. 乳酸脱氢酶固定化：乳酸脱氢酶（LDH）是一种用于乳酸生产的重要酶。
将LDH固定在Ca2+交换树脂上，可以实现连续乳酸生产。
固定化LDH不仅具有较高的稳定性和重复使用性，还可以避免产物污染。
二、生物传感器1. 葡萄酒品质传感器：利用固定化酵母细胞制备的生物传感器，可以检测葡萄酒中的氨基酸和糖分等物质，以评估葡萄酒的品质。
固定化酵母细胞可以提高传感器的灵敏度和稳定性。
2. 环境污染物传感器：将大肠杆菌等细菌固定在传感器的电极表面上，可以实现对环境中污染物的实时监测。
固定化细菌可以与特定的污染物发生反应，并产生电流信号，从而实现环境污染物的快速检测。
三、药物传递系统1. 肿瘤靶向治疗：将抗癌药物固定在载体上，并加上靶向配体，可以实现对肿瘤细胞的选择性靶向治疗。
固定化药物可以提高药物的稳定性和生物利用率，减少药物对正常组织的毒性。
2. 糖尿病治疗：将胰岛素固定化在高分子材料上，并用于制备胰岛素缓释系统，可以实现糖尿病的长期治疗。
固定化胰岛素可以延长药物的作用时间，减少频繁注射的需要。
四、废水处理1. 有机废水处理：将具有降解有机物能力的细菌固定在废水处理装置中，可以高效降解废水中的有机物。
固定化细菌可以在较宽的温度和pH范围内工作，减少对环境的影响。
2. 污水氨氮去除：将氨氧化细菌固定在生物反应器中，可以实现对污水中氨氮的高效去除。
固定化细菌可以提高氨氮去除速率和稳定性，减少传统处理方法所需的空间和时间。
酶细胞和原生质体的固定化.pptx
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1、吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附 在其表面上，而使酶固定化的方法。
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常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔 玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
• 优点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价 易得，而且可反复使用。
• 缺点：由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢 固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。
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2、包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法。
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• 包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明 胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性
的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
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制备 结合程度 活力回收率 再生 固定化成本 底物专一性
表4-1 各种固定化方法的比较
吸附法 物理吸附法 离子吸附法
包埋法
易
易
较难
弱
中等
强
高，但酶易流失
固定化细胞：在一定的空间范围内进 行生命活动的细胞
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• 优点： 1.不溶于水，易于与产物分离； 2.可反复使用； 3.可连续化生产； 4.稳定性好。
• 缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活
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7.2 固定化酶的研究历史
固定化细胞实验报告
一、实验目的1. 了解固定化细胞技术的原理和操作方法。
2. 掌握固定化细胞在生物反应器中的应用。
3. 探讨固定化细胞在发酵过程中的稳定性和重复利用性。
二、实验原理固定化细胞技术是将细胞固定在固体载体上，使其在生物反应器中保持一定的空间结构，从而实现细胞催化反应的连续进行。
固定化细胞具有以下优点：1. 提高细胞催化反应的稳定性和重复利用性。
2. 减少细胞流失，降低生产成本。
3. 方便操作和分离。
三、实验材料与试剂1. 载体：海藻酸钠、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。
2. 细胞：大肠杆菌、酵母菌等。
3. 试剂：CaCl2、NaOH、葡萄糖、磷酸盐缓冲溶液等。
4. 仪器：恒温培养箱、生物反应器、显微镜等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃恒温培养18小时。
2. 细胞固定化：将培养好的细胞用无菌生理盐水洗涤，按1%的比例加入海藻酸钠溶液，混合均匀。
将混合液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠。
将凝胶珠用无菌生理盐水洗涤，去除未固定的细胞。
3. 固定化细胞反应：将固定化细胞放入生物反应器中，加入磷酸盐缓冲溶液，控制温度、pH值和搅拌速度，进行细胞催化反应。
4. 反应产物检测：采用高效液相色谱（HPLC）或酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法检测反应产物。
5. 固定化细胞再生：将反应后的固定化细胞用无菌生理盐水洗涤，重新加入到生物反应器中，进行下一次反应。
五、实验结果与分析1. 固定化细胞在生物反应器中的稳定性：实验结果显示，固定化细胞在生物反应器中具有较好的稳定性，反应过程中细胞形态、活性均未发生明显变化。
2. 固定化细胞在发酵过程中的重复利用性：实验结果显示，固定化细胞经过多次反应后，仍能保持较好的催化活性，重复利用性良好。
3. 反应产物检测：采用HPLC检测反应产物，结果表明固定化细胞催化反应效果良好，产物产量较高。
六、实验结论1. 固定化细胞技术在生物反应器中具有较好的应用前景。
2. 固定化细胞在发酵过程中具有较高的稳定性和重复利用性。
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外消旋化
固定化酶光学拆分DL-氨基酸生产流程 氨基酸生产流程 固定化酶光学拆分
• 1969年，日本千钿一郎成功地利用固定 化酰化氨基酸水解酶，由酰化-DL-氨基 酸连续生产L-aa获得成功。 • 这是世界上固定化酶在工业生产上应用 的第一个实例。各种光学活性氨基酸都 用这种方法生产。该项技术成功的关键 是制造出适合于工业化要求的固定化酶。
复习几个概念：
• 外消旋化 ： 在一般情况下，和不对称碳 外消旋化： 原子相连的四个原子或原子团，不能随 意调换位置，因此对映体不能相互转换， 旋光度维持不变。 • 但在热、光、或者化学试剂的影响下， 不对称碳原子上的原子或原子团可发生 调换现象，使旋光物质转化为它的对映 体，最后得到外消旋体，原来100%的左 旋体，经变化后，变成50%左旋体和50% 的右旋体，这种现象称为外消旋化。
果葡糖浆的生产
• 葡萄糖不能直接代替蔗糖，因甜度不够， 但葡萄糖和果糖是同分异构体，葡萄糖 可以异构为果糖。 • Glucose
葡萄糖异构酶
fructose +Gluc目前世界上使用固定化酶规 模最大的生产上的实例。
第八章 固定化细胞和酶 Immobilized cells and enzymes
• • • • • • •
酶催化剂的优点： 专一性强， 反应条件温和， 反应速度较快。 弱点： 溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难； 溶液酶稳定性差，易失活。
1969出现了固定化酶技术。 固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制 或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。
• DL-氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它 是利用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高 的L-aa，且收率高。
外消旋体
氨基酰化E DL-R-CHCOOH + H2O L-R-CH-COOH + D-R-CHCOOH 不对称水解 NH2 NH2 NHCOŔ 溶解度小 酰化-DL-aa L-aa 酰化D-aa
8.2 固定化酶和固定化细胞的应用
• 在70年代初，首先固定单一的酶，催化单 一反应； • 随后同时固定两种酶或两种以上的酶，以 及固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应； • 再后来发展起来的固定化细胞技术，使得 不易提取的不稳定的酶的利用有了方便条 件，还可以利用活细胞的完整代谢体系来 完成复杂的反应。如乙醇的生产。
固定化酶生物反应器
• 实际应用中，固定化 酶可以装在反应器中， 连续生产有利于生产 的自动化，提高生产 率。 • 鉴于此，70年代以 来，该技术受到各国 学者的瞩目，纷纷开 展固定化酶的研究。
8.1 固定化方法及固定化后酶和 细胞的性质
• • • • 一、 固定化的原则和方法 由于酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心。 固定化时，活性中心的必需基团避免参加反应； 避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐的处理， 保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋 白质的高级结构。尽可能在温和条件下进行固定 化反应。
8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质
二、 固定化酶和细胞的性质
• • • • 1、固定化后的活性 酶经固定化后，活力降低。 原因是： a. 酶和载体结合时，活性中心的氨基酸也 或多或少地参与了结合 ，使得酶的结构 发生部分变化，酶活力有一部分丧失。 • b. 由于载体的存在，有空间位阻，影响底 物和酶接触，酶的活性得不到全部表达。 • 细胞固定化后，一般酶活力不下降。细胞 内酶受细胞膜、壁的保护。
• c.反应的最适温度 反应的最适温度 固定化酶、细胞的最适温度往往升高， 升高的幅度不同，2~15 oC不等。 d.动力学常数 动力学常数 酶：米氏常数km反映了酶和底物的亲和力。 固定化酶的表现Km(app)与游离酶的Km相比 有些不变，有的 变化很大。
3、催化活性 （底物专一性，反应的 催化活性 底物专一性， pH值，T，动力学常数） 值 ，动力学常数）
8.2 固定化酶和固定化细胞的应用
• 在固定化酶、固定化细胞的研究中发展 起来的亲和层析技术，已经远远超出了 利用酶和微生物进行催化反应的范畴。 例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免 疫吸附反应。
• • • •
固定化酶和细胞技术的显著特点： 固定化酶和细胞技术的显著特点： 1． 连续反应； 2． 获得的产物纯度高； 3． 固定化酶或细胞可重复使用，减 少了浪费； • 4． 易实现自控。
a. 底物专一性：当底物为大分子时，酶或细胞 对底物专一性下降；当底物为小分子时，酶 或细胞对底物专一性变化不大。 • b．最适pH：依固定化载体与酶分子、细胞 上所分布电荷的相互作用不同而异。有的变 化，有的不变化，有的向pH小的方向移动， 有的向pH大的方向移动。
3、催化活性 （底物专一性，反应的 催化活性 底物专一性，反应的pH 值，T，动力学常数） ，动力学常数）
• 应用实例： • DL-氨基酸的光学拆分 • 人体只能利用L-氨基酸，所以L-氨基酸 在食品医药领域的应用非常广泛，并且 需要量不断增加。 • 化学合成法是生产氨基酸的方法之一， 该法成本低，但生产出来的氨基酸是DL 外消旋体。要想把L-氨基酸分离出来， 需要进行光学拆分。 •
复习几个概念：
• 外消旋体 ： 对映体的右旋体和左旋体等 外消旋体： 量混合后，它们的旋光性相互抵消，不 再有旋光性。这样的混合物称为外消旋 体，以D、L表示。外消旋体可以用适当 D L 方法拆开或分开。
• 原因可能是：载体间的静电作用，以及扩散效 应。如果固定化酶区域的底物浓度比外部液相 主体溶液高，Km(app)下降。相反，用包埋法 的固定化酶的Km(app)值，可较游离酶多两个 数量级。这是由于凝胶中的扩散效应使底物浓 度减少，导致内部底物浓度低于外部区域的浓 度，Km(app)上升。 • 对于固定化细胞，情况类似。 • Vmax 一般不变化。
8.1 固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质
固定化方法： 固定化方法：
载体结合法 交联法 包埋法
• 载体结合法：将酶（细胞）固定在不溶 性载体上。靠共价结合、离子结合、和 物理吸附。 • 常用的载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖 等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。
• 交联法：使酶与具有两个以上官能 团的试剂（戊二醛）进行反应，应 用化学键把酶固定。 •包埋法：将酶包在凝胶微小格子内， 或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的 固定化方法。 •常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、 胶原、卡拉胶等。 •包埋法简单，可适用于大多数酶。
固定化酶结构的改变
• 2、稳定性 • 酶或细胞被固定化后，由于载体的 存在，酶分子的结构或细胞被约束， 对外部恶劣环境的敏感性下降，使 其稳定性增加（对热、对各种化学 试剂等）。而且有时稳定性增加的 幅度比较大。
3、催化活性 （底物专一性，反应的 催化活性 底物专一性，反应的pH 值，T，动力学常数） ，动力学常数）