应用蛋白质芯片技术从电针胃经大鼠血清中快速筛选低分子量差异蛋白质

应用蛋白质芯片技术从电针胃经大鼠血清中快速筛选低分子量差异蛋白质1姚雯1，杨宗保1，严洁1*，常小荣1，易受乡1，叶能胜21.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南长沙（430007）2.中关村生命科学园北京市蛋白组学研究中心，北京（100080）E-mail：yj5381159@摘要：目的筛选正常大鼠血清与电针胃经大鼠血清中差异表达的低分子量蛋白质，为进一步阐明针刺效应的体液机理提供理论依据。

方法采用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术和WCX2(弱阳离子交换芯片)对正常大鼠血清和电针胃经大鼠血清进行蛋白质指纹图谱检测分析，通过Biomarker Wizard 和Biomarker Patterns System软件判别分析处理数据并结合生物信息学方法筛选差异表达蛋白质。

结果与正常大鼠血清比较，电针胃经大鼠血清蛋白质在质荷比为2000-50000有25个蛋白质峰差异有显著意义，其中有19个标志蛋白在电针胃经大鼠血清中呈现高表达，6个标志蛋白在电针胃经大鼠血清中呈现低表达。

结论电针胃经大鼠血清与正常大鼠血清中低分子量蛋白质存在明显差异，这种差异蛋白质可能与电针促进胃黏膜损伤修复效应密切相关。

关键词：表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱，电针，胃黏膜损伤，血清蛋白质组针刺疗法是祖国传统医学疗法之一，其历史可追溯到三千多年前，近年来在西方发达国家作为一种补充替代疗法而备受人们所青睐[1,2]。

胃黏膜损伤是消化系统疾病中常见的一种病理反应，针刺对其有很好的修复作用[3,4]，以往研究证实电针足三里、四白等胃经腧穴可引起胃运动及其分泌功能变化，同时血液及胃黏膜中胃泌素、P物质、胃动素、生长抑素、表皮生长因子、转化生长因子等浓度发生改变[5,6]。

然而目前对于针刺修复效应的客观物质基础仍未完全明了，SELDI技术是近年来新兴的蛋白质组学技术，具有优于二维电泳和其他质谱方法的特点，可广泛用于低丰度小分子生物标志蛋白质的筛选[7-9]。

本研究通过对正常大鼠和电针胃经大鼠血清蛋白质指纹图谱的初步观察，旨在筛选出表达差异的低分子量蛋白质，为进一步阐明电针参与胃黏膜损伤修复的体液机制奠定理论基础。

1. 材料与方法1.1 材料1.试剂：乙腈、三氟乙酸、尿素、CHAPS缓冲盐、DTT、Tris-HC1、HPLC H2O和OPG 均购自Sigma公司。

2.动物及处理：健康雄性Wistar大鼠6只，SPF级，均购自湖南农业大学实验动物中心(许可证号:20030316)，体质量200～230 g，采用水浸束缚法制作胃黏膜损伤大鼠模型[10]。

按随机数字表将大鼠随机分为正常组和电针组，每组3只，正常组不予处理，电针组在造模后即予电针胃经穴足三里，梁门和四白，取穴采用华兴邦动物穴位谱并结合模拟人体经穴法[11]进行。

大鼠各穴位分布：足三里：膝关节后外侧，在腓骨小头下约5mm处；梁门：腹正中线与乳头线之间的中线上，脐上4寸；四白：眶下缘正中。

电针刺激用G6805型电针仪,疏密波,电针频率疏波4 Hz,密波20 Hz,强度以肌肉或针柄微颤为度,电针时间30 min。

3.蛋白质飞行时间质谱仪（ProteinChip Biology System）：美国Ciphergen公司，PBS-Ⅱ型。

1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（NO:20050541003）和国家自然科学基金（NO.30672724）的资助。

4.蛋白质芯片：WCX2(弱阳离子交换芯片)，其表面结合有弱阴型离子羧基，可以和被分析物表面的正电荷基团相互作用（如赖氨酸、精氨酸和组氨酸）而捕获蛋白，可用于检测高等电点的蛋白质和生物标记分子。

1.2 方法1.标本收集：将试验大鼠行颈动脉取血，移入离心管中，37 ℃下静置2 h，用离心机2500 r/min离心10 min，用吸管小心吸取血清，过滤除菌，EP管分装，-70 ℃冰箱中冻存备用。

2.血清样品处理：从-70℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解（可以指弹震动，促进融溶）；以10,000 rpm , 4℃离心5分钟（低温防止蛋白变性）；取10 µL血清，加入含20 µL U9缓冲液稀释的1.5 mL EP管。

稀释时注意不要用取液器反复吹吸，避免产生大量气泡，用手指轻敲样品管底部(或振荡器上)，将样品充分混匀（使蛋白充分变性）。

将以上样品冰浴振荡30分钟（400-600 rpm），此时同时进行芯片处理。

将360 µL WCX-2 buffer加入30 µL 上述变性后样品, 尽快混匀（涡旋），避免产生蛋白质沉淀。

3.上样及洗脱：小心取出WCX2的芯片，不要触及芯片表面；将芯片放入15 mL离心管中，加入8 mL 10 mM HCl，400-600转/分震荡10分钟。

取出芯片，用水清洗干净后加入8 mL50mM NaAC清洗1次；取出芯片，用H2O清洗3次；将芯片装入生物芯片处理器, 在组装生物芯片处理器时，注意不要触碰加样孔，同时要将芯片上带有”A”的一头放在外端, 注意密封。

每孔加入200 µL50mM NaAC，置于振荡器 400-600转/分震荡5分钟，甩掉缓冲液。

重复上述操作一次（以上操作要注意芯片上每个点的表面要保持湿润，加缓冲液后要观察芯片有无气泡，如有气泡用取液器吹去，枪头不得接触芯片上各点的表面）。

第二次甩掉缓冲液后在芯片处理器每孔中加入100 µL处理好的样品，封口膜封好，置振荡器 400-600转/分, 室温震荡1小时。

甩出样品，每孔加入200 µL50mM NaAC，室温置振荡器 400-600转/分震荡5分钟，甩去孔中液体，再次加入50mM NaAC 200 µL，重复操作一次。

每孔加入HEPES 1mM （pH4.0）200 µL，立刻甩出，并用水清洗2次（洗去未特异性结合的蛋白）。

立刻拆开芯片处理器，取出芯片，风干后，立刻在每个加样孔上加SPA 1 µL，待全干后，重复加SPA 1 µL一次。

待全干后，即可上机测定。

4.数据采集及统计学处理：采用蛋白质芯片阅读机读取数据(仪器每天用标准多肽和低于200×103的蛋白质标准分子校正，系统的质量偏差为1％)，检测芯片时蛋白质芯片阅读机参数设置：激光强度230，检测敏感度8，数据收集范围2000-50000质荷比(m/z)，考虑到基质峰的存在，将1kD以下的峰滤去，以免基质峰对结果造成干扰。

每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量。

采用Proteinchip3.0 自带的Biomarker Wizard 3.1 软件对正常大鼠血清和电针胃经(穴)大鼠血清的蛋白质指纹图谱数据进行比较和t检验，寻找两组间表达有差异的蛋白质峰。

2. 结果2.1 蛋白质在WCX2芯片上的分布采用Biomarker Wizard软件对所有蛋白质谱进行标准化，然后分析正常大鼠血清与电针大鼠血清中蛋白质峰数目和相对强度。

设有意义峰的最低信噪比为5，最小峰域值为30%，每个样品至少都采用两个以上WCX2芯片检测，经对3例正常大鼠血清中的30个峰进行分析，结果表明平行蛋白质芯片之间的平均变异系数不大于10%，除去基质峰，在WCX2芯片上，2个组共获得蛋白质峰数150个，其中有显著差异的蛋白质峰25个。

2.2 电针胃经大鼠血清中高表达的标志蛋白质从WCX2蛋白质芯片检测的结果表明，与正常大鼠血清蛋白质指纹图谱相比，电针胃经大鼠血清中有19个标志蛋白质表达增高，分别定义为电针胃经高表达标志蛋白（electroacupuncture stomach meridian high expression protein, ESMHP1-19）,它们的平均分子质量分别是ESMHP1:2932 Da, ESMHP2:4359 Da, ESMHP3:4475 Da, ESMHP4:4674 Da, ESMHP5:4755 Da, ESMHP6:4799 Da, ESMHP7: 5029 Da, ESMHP8:5864 Da, ESMHP9:6524 Da, ESMHP10:7148 Da, ESMHP11:7848Da, ESMHP12:8122 Da, ESMHP13:9337 Da, ESMHP14:14877 Da,ESMHP15:18650 Da, ESMHP16:18825 Da, ESMHP17:34461 Da, ESMHP18:33512 Da, ESMHP19:33865 Da，(见表1，图1)。

2.3 电针胃经大鼠血清中低表达的标志蛋白质从WCX2蛋白质芯片检测的结果表明，与正常大鼠血清蛋白质指纹图谱相比，电针胃经大鼠血清中有19个标志蛋白质表达降低，分别定义为电针胃经低表达标志蛋白（electroacupuncture stomach meridian low expression protein, ESMLP1-19）,它们的平均分子质量分别是ESMLP1:4508 Da, ESMLP2:5502 Da, ESMLP3:8017 Da, ESMLP4:8243 Da, ESMLP5:15216 Da, ESMLP6:23550 Da（见表1，图2）。

表1 电针大鼠血清和正常大鼠血清的差异蛋白质比较Tabl 1 Differentially expressed proteins in the serum between normal and electroacupuncture rats DEPs M/Z value DEPs M/Z value DEPs M/Z value DEPs M/Z value↑ 2932 ↑ 5864 ↑ 18650 ↓ 4508 ↑ 4359 ↑ 6524 ↑ 18825 ↓ 5502↑ 4475 ↑ 7148 ↑ 34461 ↓ 8017↑ 4674 ↑ 7848 ↑ 33512 ↓ 8243↑ 4755 ↑ 8122 ↑ 33865 ↓ 15216↑ 4799 ↑ 9337 ↑ 14877 ↓ 23550↑ 5029DEPs: differentially expressed proteins; ↑: up-regulated proteins in serum after electroacupuncture; ↓: down-regulated proteins in serum after electroacupunctureMolecular weight of 4000-5000 Molecular weight of 10000-20000图1 高表达差异蛋白质峰图2 低表达差异蛋白质峰Fig 1 High expressed protein peaks Fig 2 Low expressed protein peaks3. 讨论祖国医学认为，经脉脏腑密切相关，针刺经穴可引起内脏功能的变化，然而对于针刺调节脏腑功能的具体途径仍未完全明了，目前国内外学者主要集中在神经体液机制的探讨上，其中又以神经机制的研究为主，体液因素的研究相对较少，尤其缺少最直接的依据。