金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响_赵曦
土壤重金属Cd胁迫对大蒜和大豆幼苗生长的影响
维普资讯
２ ０
阜 阳 师 范 学 院 学报 （ 自然 科 学 版 ）
第２ ４卷
Ｃ （ ｄ ＮＯ。。 Ｈ２ 几 何级 数 配制 成 水 溶 液 均 匀 加 入 在 ｃ ） ４ Ｏ２ ｄ浓 度 分 别为 ５ １、 ０４ ／ ｇ时 ， 蒜 幼 苗 、０ ２ 、０ｍｇｋ 大 土壤 中， 以使 土壤 中 Ｃ ｄ的 总量分 别 达到 １ｍｇ ｋ 、 ／ｇ５
作 物． 蒜 凶其含 有 丰富 的大 蒜 素 、 大 氨基 酸 和维 生 素
丽 成 为 广受 人 欢迎 的 索 菜 和 调 味 品 ， 同时 大蒜 具 有抗 菌 、 血糖 、 高机 体 的免 疫功 能 和 解毒 等功 效 降 提 使其 在 药理 和 临 床 医学 上 有 广 泛 的 用 途 ． 豆 具育 大 丰富 的 篮 白质 和 油脂 ， 姓静ｊ 豆 浆 和 豆 腐 等 豆奶 制 作
…
定量时， 即对 植 物 产 生 毒 害效 应 ． 年 来 ， 近 由于工
业 的迅 猛发 眨 以及农 田污灌 导致大 量 Ｃ ｄ进入 环 境 ， 据统计 ， 罔Ｃ 我 ｄ污 染农 田超过 １ ０ ×１ ４ 顷［ （ ． ９ ０ 公 ＝ 秦 ２
为绿色 农业 生产 和农 业 生态 环 境 的保护 提 供科 学 依 天才 等 ，９ ７ ． １ ９ ） 土壤 一 旦 被 Ｃ 一 ｄ污染 后 ， 不仅 直 接 影 据 ． 响植 物生 长发育 、 低作 物产 量 ， 且 Ｃ 降 而 ｄ在植 物根 、 茎、 叶及 籽 实 中积 累 ， 重 影 响 农产 品的 品质 ． 严 并通
品及大 豆 油 的主要 原 料 ． 文通 过 土 壤 中重 金 属 Ｃ 本 ｄ
读书汇报 金属对花生分离蛋白凝胶形成特性的影响
结论
• 金属离子的浓度和种类对花生蛋白凝胶形成 时间、凝胶的透明度、硬度、持水性有很大 的影响。在90℃，花生分离蛋白质量浓度为 14g/100mL，pH为9.0 时，CaCl2浓度为 0.06mol/L 时，凝胶形成时间最短仅为 13min，在浓度为0.04mol/L 时，形成凝胶 透明度最高，0.06mol/L 凝胶硬度达到最高， 为214g/cm2。NaC1 浓度为0.06mol/L时凝 胶的持水性最高，为86.2%。加入CaC12、 CuSO4的凝胶形成的胶粒较粗，而加入 MgCl2、NaC1 的凝胶形成的胶粒较细。
材料与方法
• 1.1 材料、试剂与仪器
• 优质花生仁 市售。 • 氢氧化钠(分析纯)；盐酸(分析纯)；硼砂 pH 缓冲剂。 • TGL-16G 型台式离心机 上海安亭科学 仪器厂； • PHS-25 数显pH 计 上海精密科学仪器 有限公司。
1.2 方法
• 1.2.1 花生分离蛋白的提取 用稀碱溶液(pH=9)浸提花生 浆中蛋白质，离心除去脂肪及不溶 残渣，用盐酸将乳液调至pH为4.5， 使蛋白质凝集，离心分离出蛋白质， 4 ℃下低温放置备用。
• 总的来说，金属离子在低浓度条件 下，在花生蛋白凝胶质构特性方面， 主要表现为中和蛋白质的表面电荷， 增加了凝胶的硬度和持水性。同时 适当浓度的金属离子可以提高起始 凝胶点，缩短凝胶形成时间。
引发的思考
• 本文研究的金属离子浓度范围为 0.01～ 0.06mol/L，随着盐浓度的增加，阴离 子对蛋白质构象的影响导致凝胶特性的 变化变得复杂，其影响作用还有待于进 一步研究。
• 影响花生分离蛋白凝胶形成特性的因素是 多方面的，首先是花生分离蛋白产品中蛋 白质的含量，其次是蛋白质的变形程度和 花生分离蛋白在非蛋白质部分的组成。除 了上述这些内在的因素外，许多外部因素 也影响着花生分离蛋白凝胶特性，例如pH 值，离子强度，加热时间和温度等。
重金属离子Pb~(2+)胁迫对早熟禾品种润草1号生理特性的影响
Ｏ
ｅ
５ Ｏ
１ Ｏ ０ Ｐ 浓 度（ ｍ
２ ０ ０
５ ０ ０
）
图１ Ｐ ｂ 处 理后 “ 润草一 号”叶片 中叶绿素含 量变化 ①基金 项 目： 江苏 省农林职 业技术学 院科 技项 目（ 项 目编号 ： ２ ０ １ ４ ｋ ｊ ｌ １ ） 。
作者 简介 ： 赵忠涛（ １ ９ ８ １ 一） ， 男， 江苏句客人 ， 硕士， 讲 师， 研究方 向： 生物化学和有 机化学。
量瓶中 ， 并用少量乙醇处理研钵 、 研棒 、 残渣和滤纸上的叶绿体 色
供试草地早熟禾 品种为“ 润草一号” ， 由江苏农林职 业技术学 院提供 。 供试土壤取 自学院花房土 质较好 的表层土壤 ， Ｐ ｂ 添加 形式为Ｐ ｂ （ Ａｃ ） 分析纯 。 １ ． ２试验方 法 室外盆栽试验干２ ０ １ ４ 年９ Ｂ ～２ ０ １ ４ 年１ ｉ ｌ ｌ 在江苏农林职业技 术学 院进行 。 供试 土壤风干 后过０ ． ５ ｃ ｍ筛 ， 按 照１ ： ３ 将草炭 土和
究 了其在不同浓度的ｐ ｂ ２ 胁迫的生理生化指标的变化规律。 该研
究结果 为今后开 发利 用“ 润草一 号” 用于Ｐ ｂ 污染 的土壤修 复提 供 了理论依据 ， 为“ 润草一号” 在城市地 区园林的广泛应用提供 了
参考 。
５ ０ ０ ｍｇ ／ Ｒ ｇ ＊ Ｎ １ ０ ０ ０ ｍｇ ／ ｋ ｇ ， 每 个处理浓度３ 次 重复。 平衡土 壤半
释放到环境 中Ｐ ｂ日渐增加 。 Ｐ ｂ 可以在土 壤中大量 积累， 难 以被微
生物分解代谢 ， 可能会导致土壤 的正常功能失调、 质量下降， 并且
会对植物产生 毒害。 草地早熟禾（ Ｐ ｏ ａ ｐ ｒ ａ ｔ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ） 是冷季 型草坪 中
铁离子处理对大豆种子活力的影响
但 在植 物 中广泛 发挥 生理 功能 的是 Ｆ ２ ｅ ，所 以 ＋
Ｆ３ 入 植物 体后 需要 还原 为 Ｆ 才 能发 挥其 应有 ｅ进 ＋ ｅ后
的生理 功 能 ，本 研究 旨在探 讨不 同浓 度 Ｆ “ Ｆ ３浸 ｅ 、 ｅ＋
恒 重 ， 算平 均单 株干 重 。 计
② 叶绿 素含 量测 定 随机 取培 养 第 ７天 的幼 苗
铁在 植 物 呼吸 、 化 代谢 等方 面都 起 着 重 要 作 氧 用 。同时铁 是 变价 金属元 素 ， 被植 物 吸收 的铁通 常是
，
天 计算 种子 发芽率 。
第 ７天 时 ，将 全 部发芽种 子 根及 地 上 部 分 分 别
剪 下 ， １５ 于 ０ ℃下 杀 青 Ｏ５小 时 ， 置 于 ８ ℃烘 至 ． 后 ０
Ｎ ｏ ｎ ｇ Ｇ ｕ ｎ Ｋ ｓ Ｊ ｉ
… 一 … 一 一 … ～ … 一 一 一 一 … 一 一 … … 一 … … … － －－ … … … … … ， 一 －－ － 一
●
．
铁离子处理 对大豆种子活 力的影响
魏 强， 贾玉 芳 ， 乔彦 娇 ， 付 来 ， 芳 袁 王 （ 疆农 业 大 学农 学院 ， 新 乌鲁 木 齐 ８０ ５ ） ３ ０ ２
种对大豆种子萌发的影响 ， 为铁 逆 境 生 理生 化 机 理
研 究 提供 参 考依 据 。
一
、
材料 与方 法
１材料 ．
大 豆 品种 为黑 河 ２ 。药剂 为 ＦＳ ４Ｆ ： ０） 分 ６ ｅＯ、ｅ（ ４（ Ｓ ３
析 纯 ） 。
２方 法 ．
中， 用少 量 乙醇 冲洗 研 钵 、 棒及 残 渣 数 次 ， 后 连 研 最 同残渣 一起倒 入漏 斗 中 。 滴管 吸取 ７ ％乙醇 ， 滤 用 ５ 将 纸 上 的叶 绿体 色 素 全 部 洗入 容量 瓶 中 ， 后 定 容 至 最
重金属Cd、Pb复合污染对植物生理生化和细胞结构影响的研究进展
资源与环境科学现代农业科技2019年第8期重金属Cd.Pb复合污染对植物生理生化和细胞结构影响的研究进展卢楠心，4('陕西省土地工程建设集团有限责任公司，陕西西安710075；2自然资源部退化及未利用土地整治工程重点实验室；彳陕西省土地整治工程技术研究中心；4陕西地建土地工程技术研究院有限责任公司)摘要我国受重金属污染的土地面积广大，因采矿等造成的环境和土壤重金属污染问题日趋严重。
因金属矿床形成特点及开采方式单一等原因，造成Cd、Pb居于重金属复合污染前列。
通过总结单一Cd、Pb污染对植物生理生化特征的影响以及Cd、Pb复合污染对植物生理生化及细胞结构的影响等研究进展，明晰土壤重金属Cd、Pb复合污染对植物影响和损害的研究热点，进而探明植物重金属胁迫的生理响应机制。
关键词重金属胁迫；生长发育；细胞形态；致损机理中图分类号X53文献标识码A文章编号1007-5739(2019)08-0176-02Research Progress on Effect of Cadmium and Lead Combined Pollution on Physiological and Biochemical Characteristicsand Cell Structure of PlantLU Nan1,2,34(1Shaanxi Provincial Land Engineering Construction Group Co.,Ltd.,Xi'an Shaanxi710075；2Key Laboratory of Degraded and Unused Land Consolidation Engineering,the Ministry of Natural Resources；3Shaanxi Provincial Land Consolidation Engineering Technology Research Center；4Institute of Land Engineering and Technology,Shaanxi Provincial Land Engineering Construction Group Co.,Ltd.) Abstract The large-scale area of our country is polluted by heavy metals.The pollution in the environment and soil caused by mining is becoming more and more serious.Due to the characteristics of metal deposit formation and single mining method,Cd and Pb pollution is in the forefront of combined heavy metal pollution.Research progress on the effect of combined pollution of Cd and Pb on plant physiology, biochemistry and cell structure,as while as the effects of single Cd and Pb pollution on physiological and biochemical characteristics of plants were summarized.The research hotspots on effect of combined pollution of heavy metals Cd and Pb on plants and its damages to plants were cleared,and the physiological response mechanism of plant heavy metal stress was further explored.Key words heavy metal stress；growth and development；morphological structure；injury mechanism根据国土资源部门的统计，我国受重金属污染的耕地面积约为2000万hn^T,污染面积占耕地总面积的20%左右。
nature 酶 金属离子
nature 酶金属离子
（最新版）
目录
1.介绍 nature 酶
2.阐述金属离子对 nature 酶的影响
3.讨论金属离子与 nature 酶的相互作用
4.总结 nature 酶与金属离子的关系
正文
1.介绍 nature 酶
ature 酶，即自然酶，是一类在生物体内发挥作用的蛋白质，它们能够催化生物体内的化学反应，是生命活动中不可或缺的组成部分。
自然酶具有高效、专一和可逆性等特点，能够促进生物体内复杂化学反应的进行。
2.阐述金属离子对 nature 酶的影响
金属离子在生物体内起着许多重要作用，其中之一就是对 nature 酶的影响。
金属离子可以作为辅因子或激活剂，参与 nature 酶的催化过程，从而影响其活性和功能。
有些金属离子对于 nature 酶的活性至关重要，例如锌离子对于碳酸酐酶的活性具有关键作用，而铜离子则是铜绿微囊藻酶活性中心的组成部分。
3.讨论金属离子与 nature 酶的相互作用
金属离子与 nature 酶之间的相互作用可以通过多种方式进行。
首先，金属离子可以通过与酶蛋白分子结合，改变酶的构象，从而影响其催化活性。
其次，金属离子还可以作为底物或产物的结合伴侣，参与催化反应过程。
最后，金属离子还可以通过调节酶的表达和翻译，进而影响其生物学功能。
4.总结 nature 酶与金属离子的关系
ature 酶与金属离子之间存在密切的相互作用关系，金属离子对nature 酶的活性和功能具有重要影响。
重金属Cd胁迫对不同玉米品种生理生化指标的影响
重金属Cd 胁迫对不同玉米品种生理生化指标的影响李晔,李玉双,孙丽娜,程全国*(沈阳大学区域污染环境生态修复重点实验室,辽宁沈阳110044)摘要 [目的]研究重金属Cd 胁迫对不同玉米品种生理生化指标的影响,为重金属生态毒理学研究提供理论依据。
[方法]以辽宁地区大面积种植的玉米品种铁南2号、营丹11号和郑丹958号为供试材料,探讨了不同浓度Cd 2+胁迫对玉米种子萌发及幼苗生理生化指标的影响。
[结果]低浓度Cd 胁迫表现为一定的刺激作用,较高浓度在某种程度上则表现了明显的抑制性。
当Cd 2+浓度大于5mg /L 时,对不同玉米种子萌发均有明显的抑制效应,并且随着Cd 2+浓度的增加,对Cd 耐受程度不同的玉米品种其幼苗生长及其外渗电导率、叶绿素含量等生理生化指标产生明显差异。
[结论]铁南2号玉米品种对重金属Cd 的抗性明显高于其他2种玉米品种。
关键词 玉米;Cd ;生理生化指标中图分类号 S13 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2011)05-02627-02E ffects of Cad m i u m S tress on Physiol ogical and B i oche m i cal Indexes in D ifferentM ai ze Cu lti vars L I Ye et al (K ey L aboratory of Regional Env iron ment and Eco R e medi ati on of Shenyang Un i versit y ,Shenyang ,L i aon i ng 110044)Abstract [Objecti ve]This paper a m i ed to i nvesti gate t he eff ects o f cad m i u m (Cd)stress on physi o l og ica l and bi oche m ical i ndexes i n differ ent ma i ze culti vars and provide t heoretica lbasis for t he st udy on heavy me t a l ecotox ico l ogy .[M e t hod]The ma i ze culti vars i ncludi ng T i enan 2,Y i ngdan 11and Zhengdan 958wh i ch w ere w i del y pl anted i n L i aon i ng Prov i nce were se l ected as the experm i ent a l materi a ls .And t hen t heeffects of different Cd 2+concentra ti ons on seed ger m inati on ,physi o l ogica l and bi oche m ica l i ndexes of young seedli ngs were i nvestiga ted .[Result]The l ower Cd 2+concentrati on s ho w ed so me the stm i ulati on effect on seed ger m i nation ofm aize ,wh il e the hi gher concentra tion hadobvi ous i nh i bit o ry effect to s ome ex t end .The seed ger m inati on of a ll the ma i ze verities was obviously i nhi bited when t he Cd 2+concentra ti on wasm ore than 5mg /L .A nd w it h t he i ncreasi ng o f t he Cd 2+concentrati on ,the seedli ng grow t h ,exos m i c conducti v it y and chl orophyll cont entof the m aize varieti esw i th different tolerance t o Cd 2+w ere d i sti nctl y changed .[Concl usi on]The resi stance of T ienan 2to Cd 2+was si gn i fi cantly higher than that of t he other t w o varieti es .K ey words M a iz e ;Cad m i u m ;Physi olog ica l and bi oche m ica l i ndexes基金项目 国家社科基金重点项目(09AZD026);国家自然科学基金重点项目(40930739)。
施用硒_锌_铁对玉米和大豆产量与营养品质的影响_昝亚玲
此 ,我们采用黄土高原低硒区土壤 ,研究外源硒 、锌 、
大豆于 2007 年 8 月 31 日收获 ,玉米 9 月 3 日收
铁对玉米 、大豆产量和营养品质的影响 ,以期了解 获 。大豆植株分为茎叶 、荚壳 、籽粒 ; 玉米分为茎叶
硒 、锌 、铁对玉米 、大豆产量和籽粒营养品质的作用 (含苞叶) 、穗轴 、子粒 。称量各器官的鲜重后 ,根据
均施 P2O5 012 g/ kg 和 K2O 013 g/ kg。硒 、锌土施处 理的用量为 Se 0186 mg/ kg、Zn 35 mg/ kg ,叶面喷施
成癌症 、心脑血管疾病 、糖尿病 、肠胃病 、克山病等 处理的浓度为 Se 12 mg/ L 、Zn 0129 g/ L 。由于石灰
40 多种疾病的原因之一[5] 。锌对人体也有非常重 要的生理功能 ,现已证实 ,人体有 200 多种酶活性依
性土壤低价铁会很快氧化失效 ,在 A2 和 A3 处理中 铁均以叶面喷施的形式施用 ,浓度为 Fe 0113 g/ L 。
赖锌的存在 ; 膳食中锌摄入量不足严重影响人们的
各肥料施用时期 : 氮肥 50 %作基肥 ,于播前施
身心健康 ,造成免疫力降低 ,生长发育停滞 , 智力发 入 ; 50 %作追肥 ,分别于玉米大喇叭期 、大豆蕾期随
菜等多种作物进行了微量元素方面的研究 ,但人们 保出苗前不再灌水 ; 水分完全渗入土壤后 ,每盆均
较多关注硒 、锌等元素对作物产量的影响 ,至于对作 匀播种玉米 6 粒 、大豆 8 粒 ,并将剩余土壤覆盖于土
物品质的影响 ,尤其是施用微量元素对农产品微量 面 ,覆土厚度约 115 cm。每处理重复 4 盆 。玉米长
2 Waite Analytical Services School of Agriculture , Food and Wine , University of Adelaide , Adelaide : Pot experiments were conducted with maize and soybean as test crops to study the effects of application of Se , Zn , Fe on crop yields and nutritional quality. Obtained results showed that application of N , P , Kfertilizers only had in2 significant effect on the yield of maize and soybean , but application together with Se , Zn , Fe had increased the grain yield of maize by 1516 %- 7318 % and that of soybean by 5819 %- 11511 % compared to the control (no fertilizer applica2 tion) . Se , Zn , Fe application could increase N ,P contents of maize grain , while no significant effect on its K content . For soybean , Se , Zn , Fe application had no significant effects on grain N content , but decreased P and K contents. Se , Zn , Fe application could significantly increase Se ,Zn and Fe contents in maize and soybean grain. Among different Se , Zn , Fe application methods , soil combined with foliar application of Se , Zn , Fe had increased the grain Se , Zn and Fe contents respectively by 48014 % , 10619 % and 12617 % for maize , and 51219 % , 6212 % and 1516 % for soybean compared to the control . By considering both the grain yield and its micronutrient content , both soil application and soil combined with foliar application were feasible for Se and Zn. Foliar application was the effective way to increase grain Fe content of crops. Key words : maize ; soybean ; selenium ; zinc ; iron
理化因素对白芸豆凝集素生物学活性影响
南方农 业学报
Ｊ Ｏ Ｕ ＲＮ Ａ Ｌ ＯＦ Ｓ Ｏ Ｕ Ｔ Ｈ Ｅ Ｒ Ｎ ＡＧ Ｒ Ｉ Ｃ Ｕ Ｌ Ｔ Ｕ ＲＥ ２ ０ １ ３ ， ４ ４ （ ９） ： １ ４ ３ ９ — １ ４３
（ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｄ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｃ ｏ ｎ ｓ ｅ ｒ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｕｔ ｉ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ Ｍｏ ｕ ｎ ｔ Ｅｍｅ ｉ ，Ｌ ｅ ｓ ｈ ａ ｎ Ｎ ｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｌ ｅ ｓ ｈ ａ ｎ ，
ｈ ｔ ｔ ｐ： Ｉ ｌ ｗｗ ｗ． ｎ ｆ ｎ ｙ ｘ ｂ ． ｃ ｎ
Ｉ ＳＳ Ｎ ２ ０ ９ ５ —１ １ ９ １ ；ＣＯＤＥＮ ＮＮＸＡＡＢ
Ｄ Ｏ Ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ６ ： ｉ ｓ ｓ ｎ ． ２ ０ ９ ５ — １ １ ９ １ ． ２ ０ １ ３ ． ９ ． １ ４ ３ ９
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酸、铝和盐胁迫对夏季豆科绿肥作物种子萌发及根瘤菌抗氧化酶活性的影响
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金属离子对豆腐果苷与牛血清白蛋白相互作用的影响
第３９卷第１期２０１９年２月林㊀产㊀化㊀学㊀与㊀工㊀业ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔＰｒｏｄｕｃｔｓＶｏｌ.３９Ｎｏ.１Ｆｅｂ.２０１９ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.０２５３￣２４１７.２０１９.０１.０１７金属离子对豆腐果苷与牛血清白蛋白相互作用的影响㊀㊀收稿日期:２０１８￣０９￣３０㊀㊀基金项目:广西自然科学基金资助项目(２０１６ＧＸＮＳＦＤＡ３８０００５)ꎻ广西科技基地和人才专项(２０１７ＡＤ１９０２９)ꎻ广西民族大学研究生教育创新计划资助项目(ｇｘｕｎ￣ｃｈｘｐｓ２０１８２０)㊀㊀作者简介:赵丹丹(１９９３ ㊀)ꎬ女ꎬ山东济南人ꎬ硕士生ꎬ研究方向为生物无机化学㊀∗通讯作者:边贺东ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ研究领域为生物无机化学ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｇｘｕｎｃｈｅｍ＠１６３.ｃｏｍꎮＺＨＡＯＤａｎｄａｎ㊀㊀赵丹丹１ꎬ金小伟１ꎬ石婧楠１ꎬ张玉贞１ꎬ边贺东１ꎬ２∗ꎬ廖永志２(１.广西民族大学化学化工学院ꎻ广西林产化学与工程重点实验室ꎬ广西南宁５３０００６ꎻ２.广西水产科学研究院ꎬ广西南宁５３００２１)摘㊀要:㊀在模拟人体生理环境的条件下ꎬ运用荧光光谱法研究了豆腐果苷(ＨＬＤ)与牛血清白蛋白(ＢＳＡ)的相互作用ꎬ以及不同金属离子的加入对ＨＬＤ￣ＢＳＡ体系产生的影响ꎮ研究结果表明:ＨＬＤ与ＢＳＡ发生了静态猝灭ꎬ形成了稳定的化合物ꎮ通过Ｓｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒ方程计算可知ꎬＨＬＤ与ＢＳＡ在２９３㊁２９８和３０３Ｋ的猝灭常数分别为６.３１６㊁５.１４７和４.０４０ˑ１０１２Ｌ/(ｍｏｌ ｓ)ꎬ结合常数分别为９.１０ˑ１０５㊁７.７６ˑ１０５和４.９７ˑ１０５Ｌ/ｍｏｌꎮ非辐射能量转移Ｆöｓｔｅｒ理论分析表明:ＢＳＡ中色氨酸残基与ＨＬＤ的作用距离(ｒ)为４.７９ｎｍꎬ当加入金属离子后ꎬｒ值均有不同程度的降低ꎻ热力学分析表明:ＨＬＤ和ＢＳＡ之间的作用力以氢键和范德华力为主ꎮ运用圆二色光谱研究了ＨＬＤ和金属离子的加入对ＢＳＡ二级结构的影响ꎬ结果表明:ＨＬＤ的加入导致了ＢＳＡ的α￣螺旋结构百分比的下降ꎬ金属离子的存在进一步诱导了ＢＳＡ二级结构的变化ꎬＢＳＡ的α￣螺旋结构百分比明显下降ꎮ关键词:㊀牛血清白蛋白ꎻ豆腐果苷ꎻ金属离子ꎻ相互作用中图分类号:ＴＱ３５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:０２５３￣２４１７(２０１９)０１￣０１１５￣０８引文格式:赵丹丹ꎬ金小伟ꎬ石婧楠ꎬ等.金属离子对豆腐果苷与牛血清白蛋白相互作用的影响[Ｊ].林产化学与工业ꎬ２０１９ꎬ３９(１):１１５－１２２.ＥｆｆｅｃｔｏｆＭｅｔａｌＩｏｎｓｏｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＢｅｔｗｅｅｎＨｅｌｉｃｉｄａｎｄＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎＺＨＡＯＤａｎｄａｎ１ꎬＪＩＮＸｉａｏｗｅｉ１ꎬＳＨＩＪｉｎｇｎａｎ１ꎬＺＨＡＮＧＹｕｚｈｅｎ１ꎬＢＩＡＮＨｅｄｏｎｇ１ꎬ２ꎬＬＩＡＯＹｏｎｇｚｈｉ２(１.ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓꎻＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＦｏｒｅｓｔＰｒｏｄｕｃｔｓꎬＮａｎｎｉｎｇ５３０００６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｕａｎｇｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｉｓｈｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｎｉｎｇ５３００２１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＦｅ３＋ꎬＣｕ２ꎬＮｉ２＋ꎬＺｎ２＋ｏｎｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｈｅｌｉｃｉｄ(ＨＬＤ)ａｎｄｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ(ＢＳＡ)ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｕｎｄｅｒｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＢＳＡｗａｓｑｕｅｎｃｈｅｄｖｉａＨＬＤｂｙｆｏｒｍｉｎｇｓｔａｂｌｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓ.Ｔｈｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇｃｏｎｓｔａｎｔｓ(ｋｑ)ｃａｌｃｕｌａｔｅｄｂｙＳｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒｅｑｕａｔｉｏｎｕｎｄｅｒ２９３ꎬ２９８ａｎｄ３０３Ｋｗｅｒｅ６.３１６ꎬ５.１４７ａｎｄ４.０４０ˑ１０１２Ｌ/(ｍｏｌ ｓ)ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｃｏｎｓｔａｎｔｓ(Ｋ)ｗｅｒｅ９.１０ˑ１０５ꎬ７.７６ˑ１０５ꎬａｎｄ４.９７ˑ１０５Ｌ/ｍｏｌꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｄｉｓｔａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆＢＳＡａｎｄＨＬＤｗａｓ４.７９ｎｍｂｙｕｓｉｎｇＦöｓｔｅｒᶄｓｅｑｕａｔｉｏｎꎬａｎｄｉｔｄｅｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｍｅｔａｌｉｏｎｓ.ＴｈｅｔｈｅｒｏｍｏｄｙｎａｍｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｏｒｃｅｂｅｔｗｅｅｎＨＬＤａｎｄＢＳＡｗｅｒｅｈｙｄｒｏｇｅｎｂａｎｄａｎｄｖａｎｄｅｒＷａａｌｓｆｏｒｃｅｓ.ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＨＬＤａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔａｌｉｏｎｓｏｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢＳＡｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇｃｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍ(ＣＤ)ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＨＬＤｃｈａｎｇｅｄｔｈｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＢＳＡｉｎｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎꎬａｎｄα￣ｈｅｌｉｘｃｏｎｔｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄ.ＴｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢＳＡｗａｓａｌｓｏｃｈａｎｇｅｄｂｙｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｓａｎｄα￣ｈｅｌｉｘｃｏｎｔｅｎｔｆｕｒｔｈｅｒｒｅｄｕｃｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙ.Ｋｅｙｗｏｒｄ:ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎꎻｈｅｌｉｃｉｄꎻｍｅｔａｌｉｏｎｓꎻｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ１１６㊀林㊀产㊀化㊀学㊀与㊀工㊀业第３９卷豆腐果苷(４￣甲酰苯基￣β￣Ｄ￣吡喃阿洛糖苷ꎬＨＬＤ)ꎬ又名昆明神衰果素ꎬ是从云南野生植物山龙眼科萝卜树的果实中提取的一种单体化合物ꎬ其结构与天麻素类似ꎬ止痛㊁消炎㊁抗抑郁的作用却强于天麻素[１]ꎮ血清白蛋白是血浆中含量最高的载体蛋白ꎬ能够较好地结合多种内源性㊁外源性物质ꎬ可作为脂肪酸和激素等物质的载体ꎬ从而在储存㊁运输等功能方面发挥了重要的作用[２]ꎮ因为牛血清白蛋白(ＢＳＡ)与人血清白蛋白(ＨＳＡ)属于同源蛋白ꎬ所以在结构上具有相当高的相似度ꎬ相比之下ꎬＢＳＡ比ＨＳＡ更廉价易得ꎬ因此在研究中经常用ＢＳＡ代替ＨＳＡꎮ金属离子能够和蛋白质㊁酶㊁核酸等生物大分子发生相互作用ꎬ而且对蛋白质功能调节有一定的促进作用[３]ꎮ本研究采用圆二色光谱法㊁紫外光谱法和荧光光谱法ꎬ在模拟生理条件下研究豆腐果苷与ＢＳＡ的相互作用ꎬ并在金属离子存在的情况下ꎬ得到了荧光猝灭常数ꎬ推测了猝灭机理ꎬ探讨了蛋白质二级结构的变化ꎬ以期为药理活性分析以及高效药物的设计提供参考ꎮ１㊀实验１.１㊀原料、试剂与仪器豆腐果苷(ＨＬＤ)ꎬ纯度９８％ꎬ分子式Ｃ１３Ｈ１６Ｏ７ꎬ相对分子质量２８４.２６ꎬ用无水乙醇配制１.０ｍｍｏｌ/Ｌ豆腐果苷储备液ꎻ０.０５ｍｏｌ/Ｌ的磷酸缓冲溶液(ＰＢＳ)ꎬｐＨ值７.４３ꎻ牛血清白蛋白(ＢＳＡ)ꎬ相对分子质量６６２１０ꎬ用ＰＢＳ缓冲溶液配制１.０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＢＳＡ储备液ꎬ储备液中ＮａＣｌ的浓度均保持在０.１ｍｏｌ/Ｌꎬ用以维持离子强度并在４ħ下保存ꎻ将Ｆｅ３＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｚｎ２＋和Ｎｉ２＋相应的金属盐分别溶于二次水中ꎬ得到浓度为０.１ｍｏｌ/Ｌ的金属离子储备溶液ꎮ实验用水均为二次水ꎬ氯化钠等试验药品均为分析纯ꎮＲＦ￣５３０型荧光分光光度计ꎬ日本Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司ꎻＪａｓｃｏ￣８１０圆二色(ＣＤ)光谱仪ꎬ日本Ｊａｓｃｏ公司ꎻ超级恒温水浴箱ꎻＣａｒｙ１００紫光可见分光光度计(ＵＶ￣Ｖｉｓ)ꎬ美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀紫外可见吸收光谱测定㊀采用微量进样器向１ｃｍ石英比色皿中加入３.０ｍＬ浓度为１.０μｍｏｌ/Ｌ的ＢＳＡ溶液ꎬ对应的参比比色池中加入３.０ｍＬ的ＰＢＳ缓冲液ꎬ用移液枪移取一定量浓度为１.０ｍｍｏｌ/ＬＨＬＤ溶液ꎬ使得ＨＬＤ/ＢＳＡ的物质的量之比为０ʒ１㊁１ʒ１㊁２ʒ１㊁３ʒ１㊁４ʒ１㊁５ʒ１㊁６ʒ１㊁７ʒ１㊁８ʒ１和９ʒ１ꎬ同时扫描１.０μｍｏｌ/ＬＨＬＤ的紫外吸收光谱ꎮ１.２.２㊀稳定荧光猝灭光谱测定㊀采用微量注射器向１ｃｍ的石英比色皿中加入浓度为１.０μｍｏｌ/Ｌ的ＢＳＡ溶液３.０ｍＬꎬ扫描ＢＳＡ的荧光光谱ꎬ然后分别加入浓度为１.０μｍｏｌ/Ｌ的金属离子ꎬ最后分别加入一定量浓度为１.０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＨＬＤꎬ使ＨＬＤ/ＢＳＡ的物质的量之比为０ʒ１㊁１ʒ１㊁２ʒ１㊁３ʒ１㊁４ʒ１㊁５ʒ１㊁６ʒ１㊁７ʒ１和８ʒ１ꎬ每次进样后静置５ｍｉｎꎬ使其能够混合均匀㊁充分作用ꎮ将荧光的激发波长设置在２８０ｎｍꎬ狭缝宽度５/５ｎｍꎬ在３００~４５０ｎｍ范围内扫描荧光的发射波长ꎮ在２９３㊁２９８㊁和３０３Ｋ的温度下ꎬ扫描ＢＳＡ以及ＢＳＡ￣ＨＬＤ相互作用的荧光光谱ꎬ以及在２９８Ｋ金属离子存在时ꎬ扫描ＢＳＡ与ＨＬＤ作用的荧光猝灭光谱ꎮ１.２.３㊀圆二色光谱测定㊀采用微量进样器向１ｃｍ的石英比色皿中加入浓度为１.０μｍｏｌ/Ｌ的ＢＳＡ溶液３.０ｍＬꎬ扫描ＢＳＡ的ＣＤ光谱ꎻ然后分别加入一定量浓度为１.０μｍｏｌ/Ｌ的金属离子(Ｍ)ꎬ最后分别加入一定量浓度为１.０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＨＬＤ溶液ꎬ使得ＣＭʒＣＨＬＤʒＣＢＳＡ分别为０ʒ１ʒ１㊁０ʒ０ʒ１㊁１ʒ１ʒ１和２ʒ１ʒ１ꎬ测定其在１９０~２８０ｎｍ波长范围内的ＣＤ光谱ꎮ２㊀结果与讨论２.１㊀紫外光谱分析ＢＳＡ有两个主要的吸收峰ꎬ主要在２２０和２８０ｎｍ附近ꎮ２８０ｎｍ附近的吸收峰主要是含苯环的色氨酸㊁酪氨酸和苯丙氨酸残基的特征吸收ꎻ２２０ｎｍ附近的吸收峰主要是ＢＳＡ的骨架肽键羰基的π￣π∗跃迁引起的[４]ꎮ从图１(ａ)可以看出ꎬ随着ＨＬＤ的不断加入ꎬ紫外吸收光谱在２７８ｎｍ处的吸收峰峰位基本不变ꎮ在２２５ｎｍ处的吸收峰发生了红移ꎬ移动到２３１ｎｍꎬ说明ＢＳＡ与豆腐苷发生了相互作用ꎬ导致ＢＳＡ的构㊀第１期赵丹丹ꎬ等:金属离子对豆腐果苷与牛血清白蛋白相互作用的影响１１７象发生改变ꎮ２.２㊀ＨＬＤ与ＢＳＡ相互作用的荧光分析２.２.１㊀荧光光谱㊀ＢＳＡ分子中含有色氨酸㊁酪氨酸和苯丙氨酸等能够产生内源性荧光的物质ꎮ激发波长为２８０ｎｍ时ꎬＢＳＡ分子会产生较强的荧光峰ꎬ当小分子物质与ＢＳＡ结合时ꎬ会导致Ｔｒｐ￣２１２(在ＢＳＡ中ꎬ色氨酸在氨基酸序列中位于第２１２位)发生荧光猝灭ꎬ导致蛋白质的二级结构发生变化[５]ꎮ在２９８７.４３的条件下ꎬ不同浓度的对ＢＳＡ图１㊀不同浓度ＨＬＤ对ＢＳＡ的紫外吸收光谱(ａ)和荧光光谱(ｂ)的影响Ｆｉｇ.１㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆＨＬＤｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｎ.ｏｎｔｈｅＵＶ(ａ)ａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒａ(ｂ)ｏｆＢＳＡ从图１(ｂ)可以看出ꎬ随着ＨＬＤ浓度的增加ꎬＢＳＡ的荧光被猝灭ꎬ与之对应的荧光强度逐渐降低ꎮ同时ꎬ随着ＨＬＤ浓度的增加ꎬＢＳＡ荧光光谱的最大发射波长从３４２ｎｍ蓝移动到３３９ｎｍꎬ表明ＢＳＡ和ＨＬＤ发生了作用ꎬ使ＢＳＡ中的色氨酸残基微环境发生了改变ꎬ使其所在的微环境的疏水性增加ꎮ金属离子存在下不同浓度ＨＬＤ对ＢＳＡ的荧光猝灭光谱如图２所示ꎮ图２㊀金属离子存在下不同浓度ＨＬＤ对ＢＳＡ的荧光猝灭光谱Ｆｉｇ.２㊀ＥｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆＢＳＡｗｉｔｈＨＬＤｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｓ由图２可知ꎬ当Ｆｅ３＋㊁Ｎｉ２＋㊁Ｃｕ２＋和Ｚｎ２＋存在时ꎬ再加入ＨＬＤꎬＢＳＡ的荧光强度也有规律的降低ꎬ其荧光光谱蓝移１~３ｎｍꎬ说明金属离子存在时色氨酸的疏水环境增加ꎬ但增加的程度比没有金属离子时小ꎮ２.２.２㊀猝灭机制的确定㊀根据猝灭机制的不同ꎬ猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭ꎮ静态猝灭是指猝灭１１８㊀林㊀产㊀化㊀学㊀与㊀工㊀业第３９卷剂与荧光物质形成静态复合物ꎬ与复合物的稳定性有着密切的关系ꎬ当温度升高时ꎬ静态猝灭常数减小ꎻ动态猝灭是指猝灭剂与荧光体发生碰撞㊁扩散ꎬ动态猝灭速率受扩散速率的影响比较大ꎬ随着温度的升高ꎬ动态猝灭常数增大[６]ꎮ根据猝灭常数(ＫＳＶ)随着温度的变化可以判断出猝灭机理ꎬＫＳＶ可以通过Ｓｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒ方程来计算ꎬ见式(１):Ｆ０/Ｆ＝１＋ｋｑτ０ＣＨＬＤ＝１＋ＫＳＶＣＨＬＤ(１)式中:Ｆ０ ＢＳＡ的荧光强度ꎻＦ 加入ＨＬＤ后ＢＳＡ的荧光强度ꎻｋｑ 猝灭速率常数ꎬＬ/(ｍｏｌ ｓ)ꎻＫＳＶ 猝灭常数ꎬＬ/ｍｏｌꎻＣＨＬＤ 猝灭剂浓度ꎬｍｏｌ/Ｌꎻτ０ 没有ＨＬＤ存在时ＢＳＡ荧光分子的平均寿命ꎬ约为１０－８ｓꎮ根据式(１)ꎬ以Ｆ０/Ｆ对ＣＨＬＤ作图ꎬ得到不同温度下的ＨＬＤ￣ＢＳＡ以及在金属离子的存在下的Ｓｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒ曲线ꎬ和Ｋ图３㊀ＨＬＤ与ＢＳＡ相互作用的Ｓｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒ曲线Ｆｉｇ.３㊀Ｓｔｅｒｎ￣ＶｏｌｍｅｒｐｌｏｔｓｆｏｒｔｈｅｂｉｎｇｉｎｇｏｆＨＬＤａｎｄＢＳＡ由图３(ａ)可以看出ꎬ没有加入金属离子时ꎬ随着温度的升高ꎬＳｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒ曲线的斜率随之降低ꎬ即荧光猝灭常数ＫＳＶ逐渐减小ꎬ这是由于升高温度降低了新缔合物的稳定性ꎮ从表１可以看出ꎬ当Ｃｕ２＋㊁Ｆｅ３＋㊁Ｎｉ２＋㊁Ｚｎ２＋等离子存在时ꎬＨＬＤ对ＢＳＡ的荧光猝灭常数ｋｑ都大于动态猝灭的最大猝灭常数２.０ˑ１０１０Ｌ/(ｍｏｌ ｓ)ꎬ由此可以初步判断在不同金属离子的存在下ＨＬＤ￣ＢＳＡ体系的荧光猝灭也为静态猝灭[７]ꎮ表１㊀不同温度下各体系的Ｓｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒ常数Ｔａｂｌｅ１㊀ＴｈｅＳｔｅｒｎ￣ＶｏｌｍｅｒｐｌｏｔｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｓｙｓｔｅｍｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓＴ/Ｋ体系ｓｙｓｔｅｍｓ㊀㊀１０－４ＫＳＶ/(Ｌ ｍｏｌ－１)１０－１２ｋｑ/(Ｌ ｍｏｌ－１ ｓ－１)Ｒ２９３ＨＬＤ￣ＢＳＡ６.３１６６.３１６０.９８６７ＨＬＤ￣ＢＳＡ５.１４７５.１４７０.９８６６ＨＬＤ￣ＢＳＡ￣Ｆｅ３＋７.８７４７.８７４０.９９３５２９８ＨＬＤ￣ＢＳＡ￣Ｃｕ２＋６.１１６６.１１６０.９９５７ＨＬＤ￣ＢＳＡ￣Ｚｎ２＋５.１３１５.１３１０.９９７５ＨＬＤ￣ＢＳＡ￣Ｎｉ２＋９.３８５９.３８５０.９８３２３０３ＨＬＤ￣ＢＳＡ４.０４０４.０４００.９８３４２.２.３㊀结合常数㊀为了获得静态猝灭过程中的结合常数(Ｋ)ꎬ可以根据修正的Ｓｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒ方程[８]计算ꎬ见式(２):Ｆ０/(Ｆ０－Ｆ)＝１/ｆａ＋１/(ＣＨＬＤｆａＫ)(２)式中:ｆａ 最大荧光百分数ꎬ％ꎻＫ 猝灭剂与荧光物质的结合常数ꎬ也称为Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ￣Ｂｒｕｋ猝灭常数ꎬＬ/ｍｏｌꎮ根据公式(２)以Ｆ０/(Ｆ０－Ｆ)对１/ＣＨＬＤ作图(ｐＨ值７.４３ꎬλｅｘ为２８０ｎｍ)ꎮ从图４中可以得到ＨＬＤ与ＢＳＡ相互作用的结合常数Ｋ以及在金属离子存在下ＨＬＤ￣ＢＳＡ体系的结合常数ꎬ结果列于表２ꎮ第１期赵丹丹ꎬ等:金属离子对豆腐果苷与牛血清白蛋白相互作用的影响１１９㊀图４㊀ＢＳＡ与ＨＬＤ作用的改良Ｓｔｅｒｎ￣Ｖｏｌｍｅｒ曲线Ｆｉｇ.４㊀Ｓｔｅｒｎ￣ＶｏｌｍｅｒｐｌｏｔｓｆｏｒｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｏｆＨＬＤａｎｄＢＳＡ从表２可以看出ꎬＨＬＤ￣ＢＳＡ体系的结合常数随着温度的升高而逐渐降低ꎬ进一步说明ＨＬＤ与ＢＳＡ反应过程是静态猝灭过程[９]ꎮ从表２亦可看出ꎬ２９８Ｋ时ꎬＦｅ３＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｚｎ２＋和Ｎｉ２＋的存在均降低了ＨＬＤ￣ＢＳＡ体系的结合常数(７.７６ˑ１０５Ｌ/ｍｏｌ)ꎬ这说明金属离子的存在均使豆腐果苷与ＢＳＡ的结合减弱了ꎬ从而缩短了药物在血浆中的储留时间ꎬ使药物能够较快地被释放ꎮ表２㊀不同温度下各体系的结合常数Ｔａｂｌｅ２㊀ＴｈｅｂｉｎｄｉｎｇｐｌｏｔｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｓｙｓｔｅｍｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓＴ/Ｋ体系ｓｙｓｔｅｍｓ㊀㊀１０－５Ｋ/(Ｌ ｍｏｌ－１)ｆａＲ２９３ＨＬＤ￣ＢＳＡ９.１００.３６０.９９５５ＨＬＤ￣ＢＳＡ７.７６０.３５０.９９０８ＨＬＤ￣ＢＳＡ￣Ｆｅ３＋２.６８０.５６０.９９１２２９８ＨＬＤ￣ＢＳＡ￣Ｃｕ２＋２.１６０.５４０.９９７０ＨＬＤ￣ＢＳＡ￣Ｚｎ２＋２.３２０.５６０.９９９０ＨＬＤ￣ＢＳＡ￣Ｎｉ２＋２.８４０.６１０.９９２２３０３ＨＬＤ￣ＢＳＡ４.９７０.３４０.９８４２２.２.４㊀配合物与ＢＳＡ的结合距离㊀根据Ｆöｒｓｔｅｒ的偶极￣偶极非辐射能量转移理论[１０]ꎬ给体与受体间能量转移的效率为:Ｅ＝１￣Ｆ/Ｆ０＝Ｒ６０/(Ｒ６０＋ｒ６)(３)Ｒ６０＝８.８ˑ１０－２５Ｋ２Ｎ－４ϕＪ(４)Ｊ＝ Ｆ(λ)ε(λ)λ４Δλ/ Ｆ(λ)λΔλ(５)式中:Ｅ 给体与受体间能量转移的效率ꎻＲ０ Ｅ为５０％时的临界距离ꎬｎｍꎻｒ 给体/受体间距离ꎬｎｍꎻ图５㊀ＢＳＡ的荧光光谱图与ＨＬＤ的吸收光谱图Ｆｉｇ.５㊀ＢＳＡｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒａａｎｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆＨＬＤＫ２ 偶极空间取向因子ꎻＮ 介质的折射指数ꎻФ ＢＳＡ的荧光量子产率ꎻＪ 给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的光谱重叠积分ꎬ(ｃｍ３ Ｌ)/ｍｏｌꎻＦ(λ) 荧光给体在波长λ处的荧光强度ꎻε(λ) 受体在波长λ处的摩尔消光系数ꎮ当ＣＢＳＡʒＣＨＬＤ＝１ʒ１时ꎬ通过ＢＳＡ的荧光光谱与ＨＬＤ的紫外吸收光谱的重叠曲线ꎬ以及Ｆｅ３＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｚｎ２＋和Ｎｉ２＋存在下的ＨＬＤ与ＢＳＡ的荧光光谱的重叠曲线ꎬ计算得Ｊ＝６.８９ˑ１０－１４ｃｍ３ Ｌ/ｍｏｌ[１１]ꎬ如图５所示ꎮ根据相关公式求得Ｒ０＝３.３９ｎｍꎬＢＳＡ中色氨酸残基与ＨＬＤ的作用距离ｒ＝４.７９ｎｍꎬｒ<７ｎｍꎮ并且０.５Ｒ０<ｒ<１.５Ｒ０ꎬ表明ＨＬＤ与ＢＳＡ之间发生了相互作用ꎬ产生非辐射能量转１２０㊀林㊀产㊀化㊀学㊀与㊀工㊀业第３９卷移[１２]ꎬ在金属离子存在下ꎬ由相关公式得出ＨＬＤ￣ＢＳＡ体系非辐射能量转移的影响列于表３中ꎮ在表３中可以清楚地看出ꎬ当加入金属离子后ꎬＢＳＡ中色氨酸残基分别与ＨＬＤ的作用距离ｒ均有降低ꎬ说明了ＨＬＤ与ＢＳＡ之间发生非辐射能量转移ꎮ表３㊀不同金属离子对ＢＳＡ￣ＨＬＤ体系非辐射能量转移的影响Ｔａｂｌｅ３㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔａｌｉｏｎｓｏｎｎｏｎ￣ｒａｄｉａｔｉｖｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒｏｆＢＳＡ￣ＨＬＤｓｙｓｔｅｍ体系ｓｙｓｔｅｍＪ/(ˑ１０－１４ｃｍ３ Ｌ ｍｏｌ－１)Ｒ０/ｎｍＥｒ/ｎｍＢＳＡ￣ＨＬＤ￣Ｆｅ３＋６.３４３.３５０.１８６４.４８ＢＳＡ￣ＨＬＤ￣Ｃｕ２＋６.１５３.３５０.０９７４.３７ＢＳＡ￣ＨＬＤ￣Ｚｎ２＋６.８３３.３５０.０８８４.５８ＢＳＡ￣ＨＬＤ￣Ｎｉ２＋６.６４３.３５０.０７９４.６６２.２.５㊀热力学性质及其作用力分析㊀ＨＬＤ与ＢＳＡ的作用类型的判断ꎬ根据Ｖａｎ ｔＨｏｆｆ方程进行计算焓变(ΔＨɵ)㊁熵变(ΔＳɵ)ꎬ并进一步计算吉布斯自由能(ΔＧɵ)ꎬ见式(６)~(７):ｌｎＫ＝－ΔＨɵ/ＲＴ＋ΔＳɵ/Ｒ(６)ΔＧɵ＝－ＲＴｌｎＫ(７)图６㊀豆腐果苷与ＢＳＡ结合的Ｖａｎ ｔＨｏｆｆ图Ｆｉｇ.６㊀Ｖａｎ ｔＨｏｆｆｍａｐｏｆＨＬＤｂｉｎｄｉｎｇｔｏＢＳＡ式中:Ｋ 温度Ｔ时的结合常数ꎻＲ 气体常数ꎬ８.３１４Ｊ/(ｍｏｌ Ｋ)ꎻＴ 热力学温度ꎬＫꎻΔＧɵ 吉布斯自由能变ꎬｋＪ/ｍｏｌꎻΔＨɵ 反应前后的热力学焓变ꎬｋＪ/ｍｏｌꎮ根据式(６)ꎬ分别选取２９３㊁２９８和３０３Ｋ这３个温度值及其对应的Ｋ值ꎬ以ｌｎＫ对１/Ｔ作图ꎬ如图６所示ꎮ由直线的斜率可求得ΔΗɵꎬ由截距可求得ΔＳɵꎬ并求得反应的吉布斯自由能变(ΔＧɵ)ꎬ结果见表４ꎮ通过以上热力学参数的大小可以判断药物小分子与蛋白质的作用力类型ꎮ当ΔＨɵ>０ꎬΔＳɵ>０时为典型的疏水作用力ꎻ当ΔＨɵ<０ꎬΔＳɵ<０时为氢键和范德华力ꎻ当ΔＨɵ<０ꎬΔＳɵ>０时为静电引力[１３]ꎮ从表４结果可知ꎬΔΗɵ＝－２２４.２８１ｋＪ/ｍｏｌꎬΔＳɵ＝－６７３.１７Ｊ/(ｍｏｌ Ｋ)ꎬ即ΔＨɵ<０ꎬΔＳɵ<０ꎬ因而ꎬＨＬＤ与ＢＳＡ的相互作用是以氢键和范德华力为主ꎮ表４㊀ＨＬＤ与ＢＳＡ结合的结合常数和热力学参数Ｔａｂｌｅ４㊀ＢｉｎｄｉｎｇｃｏｎｓｔａｎｔｓａｎｄｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｃｏｎｓｔａｎｔｓｏｆＨＬＤａｎｄＢＳＡＴ/ＫＫ/(ˑ１０５Ｌ ｍｏｌ－１)ΔＧɵ/(ｋＪ ｍｏｌ－１)ΔＨɵ/(ｋＪ ｍｏｌ－１)ΔＳɵ/(Ｊ ｍｏｌ－１Ｋ－１)２９３９.１４－１３４.７１２９８７.４９－１１９.４２－２２４.２８１－６７３.１７３０３４.９７－１０１.０２图７㊀ＨＬＤ￣ＢＳＡ结合的圆二色光谱Ｆｉｇ.７㊀ＣｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍｓｐｅｃｔｒａｏｆＨＬＤａｎｄＢＳＡ２.３㊀圆二色光谱分析ＢＳＡ在２０８和２２０ｎｍ紫外区存在２个负峰ꎬ负峰是蛋白质α￣螺旋的特征吸收ꎮ在２０８ｎｍ处的吸收峰是蛋白质α￣螺旋肽键的π￣π∗跃迁引起的ꎻ而在２２０ｎｍ处的吸收峰是蛋白质α￣螺旋肽键π￣π∗跃迁引起的[１４]ꎮ图７和图８为ＨＬＤ与ＢＳＡ及Ｆｅ３＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｚｎ２＋和Ｎｉ２＋存在下ＨＬＤ￣ＢＳＡ体系反应中ＢＳＡ的圆二色光谱图ꎮ从图可以看出ꎬＦｅ３＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｚｎ２＋和Ｎｉ２＋等金属离子加入前后ꎬ随着ＨＬＤ浓度的增加ꎬＣＤ光谱的形状和峰位没有发生明显改变ꎬ但负峰峰高的振幅逐渐减弱ꎬ结果表明:随着ＨＬＤ浓度的增加ꎬ蛋白质的二级结构中ꎬα￣螺旋含量有所降低ꎬ但α￣螺旋依然是ＢＳＡ㊀第１期赵丹丹ꎬ等:金属离子对豆腐果苷与牛血清白蛋白相互作用的影响１２１的主要结构[１５]图８㊀金属离子与ＢＳＡ结合的圆二色光谱Ｆｉｇ.８㊀ＣｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍｓｐｅｃｔｒａｏｆＨＬＤａｎｄＢＳＡｉｎｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｓ蛋白质α￣螺旋结构的百分比(ｘα￣螺旋)可以通过计算得到:ηＭＲＥ＝θｏｂｓ/(１０ˑｎˑｌˑＣｐ)(８)ｘα￣螺旋＝(－ηＭＲＥꎬ２０８－４０００)/(３３０００－４０００)ˑ１００％(９)式中:ηＭＲＥ 残基的椭圆率ꎬ(ʎ) ｃｍ２/ｍｏｌꎻθｏｂｓ 椭圆度ꎬ毫度ꎻｎ 氨基酸残基的数目(ＢＳＡ为５８３)ꎻｌ 样品池的厚度ꎬ１ｃｍꎻＣｐ ＢＳＡ的浓度ꎬ１.０ˑ１０－６ｍｏｌ/Ｌꎮ根据式(８)和式(９)求得ＢＳＡ的α￣螺旋结构百分比为５０.３６％ꎬ当ＣＨＬＤʒＣＢＳＡ为１ʒ１时ꎬＢＳＡ的α￣螺旋结构百分比减少到４８.４５％ꎮ在ＨＬＤ￣ＢＳＡ体系中加入金属离子后ꎬＢＳＡ的α￣螺旋结构百分比继续下降(表５)ꎬ表明药物ＨＬＤ使得ＢＳＡ的构象发生了改变ꎬα￣螺旋结构百分比降低ꎻ在ＨＬＤ￣ＢＳＡ体系中加入金属离子后ꎬα￣螺旋结构百分比进一步降低ꎬ这表明药物和金属离子的加入改变了ＢＳＡ的二级结构[１６]ꎮ表５㊀ＨＬＤ及金属离子与ＢＳＡ结合的α￣螺旋结构百分比Ｔａｂｌｅ５㊀ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｅａｃｈｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＢＳＡｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒａｄｄｉｎｇＨＬＤｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｓＣＭʒＣＨＬＤʒＣＢＳＡＦｅ３＋￣ＢＳＡ￣ＨＬＤ/％Ｃｕ２＋￣ＢＳＡ￣ＨＬＤ/％Ｚｎ２＋￣ＢＳＡ￣ＨＬＤ/％Ｎｉ２＋￣ＢＳＡ￣ＨＬＤ/％０ʒ０ʒ１４０.２５４０.２５４０.２５４０.２５０ʒ１ʒ１４０.０３４０.０３４０.０３４０.０３１ʒ１ʒ１３９.３０３９.７０３８.３９３８.６０２ʒ１ʒ１３７.９３３７.６６３７.６４３８.０１３㊀结论３.１㊀通过荧光光谱㊁圆二色光谱研究了豆腐果苷(ＨＬＤ)与牛血清白蛋白(ＢＳＡ)的相互作用ꎬ并分析了Ｆｅ３＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｚｎ２＋和Ｎｉ２＋４种金属离子的加入对ＢＳＡ￣ＨＬＤ体系的影响ꎮ研究结果表明:ＨＬＤ能使ＢＳＡ产生荧光猝灭ꎬ属于静态猝灭ꎬ形成稳定的复合物ꎮ３.２㊀非辐射能量转移理论分析表明:ＢＳＡ中色氨酸残基与ＨＬＤ的作用距离(ｒ)为４.７９ｎｍꎮ根据热力１２２㊀林㊀产㊀化㊀学㊀与㊀工㊀业第３９卷学分析ꎬ判断ＨＬＤ和ＢＳＡ之间的作用力以氢键和范德华力为主ꎮ通过圆二色光谱计算了ＢＳＡ的α￣螺旋结构百分比ꎬ表明ＨＬＤ的加入ꎬ使ＢＳＡ的α￣螺旋结构百分比下降ꎬ改变了ＢＳＡ的二级结构ꎻＦｅ３＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｚｎ２＋和Ｎｉ２＋的加入ꎬ加剧了ＢＳＡ的α￣螺旋结构百分比的降低ꎬ改变了ＢＳＡ的二级结构ꎮ参考文献:[１]谢江枫.豆腐果苷和天麻素与蛋白酶相互作用机理研究[Ｄ].深圳:深圳大学ꎬ２０１７.ＸＩＥＪＦ.Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｂｅｔｗｅｅｎｈｅｌｉｃｉｄａｎｄｇａｓｔｒｏｄｉｎａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅ[Ｄ].Ｓｈｅｎｚｈｅｎ:ＳｈｅｎｚｈｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０１７. 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NaCl胁迫对野生大豆和栽培大豆生理生化的影响研究
关键词 ： 野生大豆 ； 盐胁迫 ； 羧化效率 ； 抗氧化酶
中图分类号 ：５５１ ￥６．
文献标识码 ： Ａ
文章编 号 ：０６００ （００ ０—０９ ０ １０ —６Ｘ ２ １ ） ０５— ３ ７
Ｅｆｅ ｔ ｆＮａＣＩＳ ｒ ｓ ｎ ｆ ｃ ｓｏ ｔ ｅ ｓ ｏ Ｐｈｙ ｉ ｌ ｇ ｃ ｌａ ｄ ｏ ｈ ｍ ｉ ａ ｓｏ ｏ ｉａ ｎ Ｂｉ ｃ ｅ ｃ ｌＣｈａ ａ ｔ ｒ ｒ ｃｅ ｓ
Ａｂ ｔａ ｔ Ｃ ａ ｇｓｏ ｐ ｏｏｙ ｔｅｉ ａ ｄａｔ ｘｄｎ ｎｙ ｓａｔ ｉｅ ｆ ｌ ｉｅｓｊ ｎ ｔ ｉ 麟 ｕ ｄｒ ｈｒ ｓｒ ｃ ： ｈｎ ｅ ｆ ｈｔｓｎｈ ｓ ｎ ｎｉ ｉａ ｔ ｚｍｅ ｃｉｔ ｓ ｙ ｎ ｏ ａ ｄＧｙ ｎ ｍ ｓ ｏ ｅ ｖｉ ｏ Ｇ ｃ ａ ｃｅ ｎ ｅ ｏｔ ｓ —
业污 染加 剧 和化 肥 使用 不 当等 原 因 ， 土壤 盐 渍 化 １ ３ 趋 严重。盐胁迫下植物光合能力降低 ， 作物严重减
植物材料 、 实验 时植 物 所 处 的 生 育 期 、 胁 迫 的方 盐 式 和 程度 等 因素 不 同有关 。
ｓｙ ｅ ｎ ｌ ｖ ｓ Ｔ ｅ ｒｓ ｌ ｈ ｗ ｄ ｔａ ｔ ｅｄ ｃｅ ｓ ｆ ａｂ ｘ ｌ ｉ ｆ ｃ ｎ ｙ ｗ ｓａ ｍ ｊｒｆｃ ｒｆ ｅ ｄ ｃｅ ｓ ｆ ｏ ｂ ａ ｅ ｅ ． ｈ ｅｕｔ ｓｏ ｅ ｈ ｔ ｈ ｅ ｒａｅ ｏ ｒ ｏ ｙ ｔ ｎ ｅ ｉ ｃ ａ ａｏ ｔ ｒｔ ｅ ｒａ ｅ ｏ ａ ｓ ｃ ａｏ ｉ ｅ ａｏ ｏ ｈ
盐胁 迫 是制 约 农业 发展 的一 个重 要 因 素 ， 全世 界大 约 ７ ％的土地受 到 盐胁 迫 的影 响 ｆ 而且 随着 工 １ １ ，
影 响的 。 胁 迫下 植 物 的光 合 能力 减弱 的 机制是 什 盐
金属离子生物学中的研究进展
金属离子生物学中的研究进展金属离子在生物学中扮演着极为重要的角色，以铁、锌、钙、镁等常见离子为代表的金属离子与生物体内许多重要的生物分子紧密结合，在细胞生物学和医学上有着广泛的研究价值。
在过去的几十年，金属离子生物学的研究取得了长足的进展，涉及的领域包括但不限于金属离子在生物分子中的角色、金属离子与健康之间的关系、金属离子缺乏和过量摄入的影响以及免疫系统、神经系统等方面的研究，相关成果为开发新型药物提供了重要的依据与参考。
下面将从多个角度归纳总结金属离子生物学研究的进展情况。
一、金属离子在生物分子中的作用1.铁离子及其酸碱平衡对细胞代谢的影响铁离子在生物分子中是常见的金属离子之一，主要参与中呼吸链、核酸合成、DNA修复等关键生物过程。
人体内的血红蛋白、肌红蛋白、线粒体细胞色素c等许多重要蛋白质都含有铁离子，铁离子数量的缺乏或异常可能导致贫血、糖尿病等疾病的发生，因此，严格的铁代谢对于维护人体健康至关重要。
2.锌离子对酶类的活性调控锌离子除了在DNA转录和蛋白质合成等基本生物过程中扮演着重要角色，还与许多细胞酶的结构和活性调控密切相关。
例如，丝氨酸蛋白酶是一种重要的消化酶，其酶活性需要锌离子的催化和调控。
此外，锌还可以激活T细胞、B细胞等免疫细胞，对于维持人体免疫系统的正常功能也起到重要作用。
二、金属离子与健康之间的关系1.锰、镉等重金属离子对生殖系统的影响锰是人体内的必需微量元素，其在骨骼、胰岛素、脑发育等方面都有重要作用。
然而，过量摄入锰离子会影响生殖能力，导致生殖系统发育异常或功能紊乱。
同样，镉离子摄入过多也会对生殖系统造成危害，长期摄入可能导致男性精子质量下降、女性月经紊乱等问题。
2.铅离子对儿童发育的不良影响在污染物的高度曝露环境中，铅离子被视为极具毒性的元素。
儿童因为摄取的铅离子会受到更加严重的影响，如智力不足、认知障碍等问题。
近年来，为了保障青少年的健康，相关部门开始关注并加强了对铅离子等污染物的防控措施。
重金属Cu2+胁迫对绿豆生理生化指标的影响
重金属Cu2+胁迫对绿豆生理生化指标的影响重金属污染是当前严重的环境问题之一，其中铜铁污染较为常见。
铜是一种必需的微量元素，但在高浓度下会对生物体产生毒害作用。
绿豆是一种常见的耐旱植物，在重金属污染环境中具有一定的耐受能力。
本文旨在研究Cu2+胁迫对绿豆生理生化指标的影响。
实验选择了绿豆种子作为研究材料，分为胁迫组和对照组。
对照组以蒸馏水浸泡种子，胁迫组以含有不同浓度的Cu2+溶液浸泡种子，浓度分别为0、50、100、200和300 mg/L。
浸泡时间为24小时后，将种子移植到含有相应浓度的Cu2+溶液中继续培养1周。
接下来，采集绿豆根部和叶片进行生理生化指标的测定。
比较了绿豆根部和叶片的鲜重和干重。
结果显示，与对照组相比，胁迫组的绿豆根部和叶片的鲜重和干重显著降低。
特别是在高浓度Cu2+胁迫下，绿豆根部和叶片的鲜重和干重减少更为明显，表明Cu2+胁迫对绿豆的生长和发育产生了抑制作用。
对绿豆根部和叶片的抗氧化酶活性进行了测定，包括超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性。
结果显示，随着Cu2+浓度的增加，绿豆根部和叶片的SOD和POD活性逐渐上升。
这表明Cu2+胁迫引起了绿豆的氧化应激反应，导致抗氧化酶活性的增加。
测定了绿豆根部和叶片的丙二醛（MDA）含量，作为细胞膜损伤的指标。
结果显示，在高浓度Cu2+胁迫下，绿豆根部和叶片的MDA含量显著上升，说明Cu2+引起了细胞膜的损伤。
Cu2+胁迫对绿豆生理生化指标的影响是多方面的。
高浓度Cu2+胁迫抑制了绿豆的生长和发育，降低了叶绿素含量，导致了氧化应激反应的增强和细胞膜的损伤。
在应对重金属铜污染时，需要采取相应的措施，减少Cu2+对植物的毒害作用，保护环境和人类健康。
金属离子对生物样品负离子化的影响研究
金属离子对生物样品负离子化的影响研究负离子对人类的健康有很多好处，可以改善环境，减少压力，促进身体健康等。
然而，在实践中，我们会发现，金属离子对负离子的生成和形成产生了很大的影响。
本文将探讨金属离子对生物样品负离子化的影响，并提出一些具有理论指导意义的“捕获负离子”的方法。
1. 金属离子的种类和影响金属离子的种类很多，而每种金属离子都有不同的影响，下面将分别进行介绍。
1.1 铁离子铁离子是人体所必需的微量元素，但是过量摄入会对健康产生不良影响。
研究表明，铁离子可以提高生物负离子的产生，但同时会抑制电离空气中负离子的生成。
1.2 锌离子锌离子是人体内重要的代谢物质，对提高免疫力和缓解焦虑等有积极作用。
而关于锌离子对负离子化的影响还需进一步研究，但目前的研究表明，锌离子可以抑制负离子的产生。
1.3 铝离子铝离子是一种有争议的金属离子，因为其可以对生物系统产生抑制作用和损伤作用。
关于铝离子对负离子化的影响还没有明确的结论。
2. 进行金属离子研究的方法在进行金属离子对负离子化研究时，我们需要借助科学的实验方法，下面将介绍一些常用的实验方法。
2.1. 恒温条件下负离子浓度的测定可以按照预定浓度的方法，调整样品的金属离子浓度，避免温度的影响。
在恒温下，通过采样并测定负离子的浓度，则可以得出金属离子对负离子产生的影响。
2.2 金属离子对生物样品表面感应负离子的影响选取适宜的生物样品，并在样品表面喷洒不同浓度的金属离子溶液，待干燥后，通过培养样品的表面，测定负离子的浓度，即可得出金属离子对负离子化的影响。
2.3 “捕获负离子”的方法通过科学的方法进行“捕获负离子”，可以为我们提供一些实践经验，并具有指导意义。
下面将介绍两种典型的捕获方法。
2.3.1 材料捕获法在研究负离子的生成和捕获时，材料捕获法是一种常用的方法。
选取一些表面材料较为特殊的材料，如凝胶体和纳米材料，通过简单的方法可在样品表面进行捕获，并在被测量之前就可进行准备。
金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响_赵曦
收稿日期:2004-06-30基金项目:国家自然科学基金(39770178)*通讯作者文章编号: 0490-6756(2005)01-0179-06金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响赵 曦,荣艳珍,常丽青,高 顺,吴传芳,李宜瑾,王陈继,鲍锦库*(四川大学生命科学学院成都610064)摘要:野花生豆凝集素在pH 7.0和pH 5.0缓冲体系中,用EDTA 去除其金属离子,CM L 凝血活性下降.Ca 2+、M g 2+、Mn 2+、Zn 2+可使去除金属离子CM L 活性基本恢复到天然水平,表明这些二价金属离子为CML 活性所必需.研究不同温度和不同浓度盐酸胍条件下CML 的圆二色谱、荧光光谱及其凝血活性的变化,结果表明CML 含有较多B -折叠,具有较强的抗变性能力;脲变性的时间扫描荧光光谱证实了CM L 变性过程的阶段性.关键词:野花生豆凝集素;金属离子;圆二色谱;荧光光谱;生物学活性中图分类号:Q68 文献标识码:A凝集素是一类结构各异的非免疫源性的糖结合蛋白或糖蛋白[1].植物凝集素是凝集素家族中重要一类.虽然植物凝集素存在的生理意义还不十分清楚,但越来越多的植物凝集素被分离纯化,人们利用各种生物化学手段对植物凝集素的结构和性质进行研究.野花生豆凝集素(Crotalaria mucronata lectin,简称CM L)是一类A 型血专一性凝集素,对它的分离纯化及性质研究已有报道[2,3].本文在已有性质研究的基础上,研究CML 活性与金属离子之间的关系,并结合远紫外圆二色谱及内源荧光光谱的方法,研究CM L 在变性条件下构象和活性变化的关系.1 材料与方法1.1 材料野花生豆种子采自福建省上杭地区;新鲜健康人A 型血采自成都市第六人民医院;Sephacry S -200HR 购自Pharmacia 公司;SDS -PAGE 低分子量标准为上海丽珠东风生物技术有限公司产品.荧光光谱测定在HITACHI F -4500荧光分光光度计上进行,激发和发射光谱谱宽均为5.0nm ,测定温度为25e .圆二色谱在JASCO -500型自动记录分光偏振仪上测定.1.2 方法1.2.1 CML 纯度测定 按文献[4]的方法纯化CML,纯化的CML 在PAGE 或SDS -PAGE 均呈现单一蛋白带.1.2.2 CML 浓度测定 蛋白质浓度测定用Folin -酚试剂,以牛血清白蛋白作标准[5].1.2.3 CML 活性测定 参照文[6]凝集活性测定在微量血清稀释板上进行,在系列倍比稀释的/V 0型孔中加入人A 型血红细胞振摇10m in,室温放置2h,显微镜检查凝血活性.1.2.4 金属离子对CML 活性影响 取4.32@10-4g/mL CM L 2~3mL,在含2mmol/L EDTA 0.1mol/L2005年2月第42卷第1期四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan U niversity (Natural Science Edition)Feb.2005Vol.42 No.1HAc-NaAc缓冲液中透析20~30h,透析去除EDTA,调节pH到中性,测定凝集素凝血活性和荧光光谱.凝血活性.另取对照测定凝血活性.1.2.5不同温度处理对CML圆二色谱和荧光的影响未经处理样品(生理盐水为溶液)进行远紫外圆二色谱.CM L为0.716@10-3g/mL;残基平均分子量110;灵敏度2m b/cm;光程0.02cm.以下圆二色谱的测定均按此参数进行.将溶解在生理盐水中的CM L作为天然状态CM L.将用生理盐水配制的CM L分别于40e、60e、70e、80e保温10m in,快速冷却后测定其活性及光谱性质.(以下实验样品同)1.2.6不同pH处理对CM L圆二色谱的影响配制0.1mol/L pH4.0、5.0HAc-NaAc缓冲液、0.1mol/ L pH9.0NaHCO3-Na2CO3缓冲液和pH11.0、pH13.0NaOH溶液.将CML溶于上述溶液中,4e放置过夜,测定圆二色谱和调节pH到中性并测凝血活性.1.2.7不同浓度盐酸胍对CML圆二色谱的影响将CM L溶于含有0.5mol/L、1mol/L、3mol/L、6mol/ L、8mol/L盐酸胍的生理盐水中,分别测定凝血活性和圆二色谱.1.2.8CML脲变性的时间扫描荧光光谱将含8mol/L脲的CML溶液(配制后放置24h以上),用水稀释,使CML终浓度为50mg/L,测定其在295nm激发光下发射波长为335nm的相对荧光光谱强度随时间的变化.2结果与讨论2.1天然状态CML的圆二色性与荧光光谱CM L的远紫外圆二色谱在218nm处显示单一负峰(图1),在199nm处有一正峰,峰值约为218nm峰值的两倍.这些是以B-折叠为主的蛋白质的远紫外圆二色谱的主要特征[7].在中性和SDS溶液中,多聚L-赖氨酸呈B-折叠,它的远紫外圆二色谱在218nm处有一负峰.Litman 等人[7]从遗传树上处于关键地位的九个种属中分离了高分子或低分子的免疫球蛋白,测定了他们的远紫外圆二色谱,这些谱线共同特征是217nm处的负峰,而它们的结构以B-折叠为主.白鲟有一沉降系数为10S的免疫球蛋白及鸡的IgG的远紫外圆二色谱的峰位置均为217.5nm[8].CM L的远紫外圆二色谱峰在218nm处,它的谱线与以上的蛋白很相似,由此推测,CM L的二级结构以B-折叠为主.CM L的内源荧光发射光谱见图2.用280nm激发时,发射峰峰值位于335nm处.其中未见有T yr残基的发射峰,表明Tyr残基的荧光基本上通过能量转移传递给了Trp残基,使得Trp残基的荧光光谱增强[9,10].用295nm的激发光激发时,CM L荧光光谱最大发射峰也在335nm,这与水溶液中自由Trp的荧光光谱280nm相比发生了明显的蓝移[9].说明Trp残基位于疏水环境中,这与荧光淬灭的结果一致[2].图1天然CM L的圆二色谱图Fig.1CD spectra of native CML图2天然CM L的荧光发射光谱F ig.2Fluorescence spectra of nativ e CM L 1:激发光波长280nm;2:激发光波长295nm180四川大学学报(自然科学版)第42卷2.2 金属离子对CM L 光谱和活性的影响在pH 5.0和pH7.0时用EDTA 除去金属离子后,CM L 的活性变化如表1:表1 金属离子对CM L 活性的影响T able 1 T he hemagglutinating activit y of CM L with the effect of metal ionCM L 凝集素浓度(@10-4g/mL)4.32 2.16 1.080.540.270.1350.68天然+++++++pH5.0去离子--+++----Ca 2+++++++-M g 2++++++--Zn 2+++++++-M n 2++++++--pH7.0去离子++-----Ca 2+++++++-M g 2++++++--Zn 2+++++++-M n 2++++++--/+0表示凝血;/-0表示不凝血金属离子对CML 光谱和活性的影响见图3.去除金属离子后CM L 还有一部分处于活性构型,就像去离子的ConA 处于/松散0型和/紧凑0型的平衡一样[12],/紧凑0型具有活性.pH 5.0时去除金属离子后的荧光峰相对强度下降更甚的原因可能是:酸性pH 值,使失去金属离子的CML 部分Trp 残基的微环境发生了较大的变化,使之更为亲水,CM L 分子的稳定性下降程度更大,导致相对荧光强度下降更甚.图3 金属离子对CM L 的荧光光谱的影响Fig.3 Fluor escence spectr a of CM L w ith the effect o f metal ion激发波长280nm;A:pH 7.0;B:pH 5.0;1:天然CM L,2:未除去EDTA,3:去除EDTA在去除金属离子后的CML 中添加Ca2+、Mg2+、Zn2+、M n2+,CML 的活性恢复程度见表1.一些金属离子可以使去离子的CM L 活性恢复,说明这些金属离子是CML 活性所必需的,特别是Ca 2+和Zn 2+.豆科凝集素有两个金属离子结合位点:一个是过渡金属离子的结合位点,另一个是钙离子结合位点.在C on A 中,Ca 2+可以稳定/紧凑0型(活性构型)构型,Mn 2+也有这种作用[13].由此看来,去离子的CML 可能也存在着/紧凑0型和/松散0型的平衡,Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Mn 2+都可以稳定CML 的/紧凑0型构型,使平衡向有利于/紧凑0型构型方向移动,从而使去离子的C ML 活性得到恢复.只是Mg 2+、Mn 2+的作用不及Ca 2+、Zn 2+.2.3 不同温度处理对CM L 活性及光谱的影响181第1期赵曦等:金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响CM L 经不同温度处理的远紫外圆二色谱见图4.温度处理导致的活性变化见表2.在40e 、60e 处理10min 后的CML 的远紫外圆二色谱与天然状态的CML 相比,峰的位置没有改变,但峰值减小.此时仍然具有较强的凝血活性.70e 处理的CML 的远紫外圆二色谱峰蓝移,峰值减小,峰形变宽,这时的CML 结构有了较大的变化,活性也相应降低.经80e 处理的CML 的谱形变化较大,不仅峰发生蓝移,而且谱峰显示典型的双负峰,分别出现在216nm 、208nm 处,这些都是A 螺旋的特征谱型.这时的CM L 的活性有了较大的改变,但未完全失活.不同温度处理后的CML 的荧光光谱见图5.表2 不同温度处理对CM L 活性的影响T able 2 T he hemag glutinating activity of CM L w ith the different temperatur e温度(e )凝集素浓度(@10-4g /mL )7.16 3.58 1.790.8950.4480.2240.112天然+++++++30+++++++40+++++--60+++++--70++++---80+++----/+0表示凝血/-0表示不凝血图4 不同温度处理对CM L 圆二色谱的影响Fig.4 CD spectra of CM L with different temperature1:天然CM L;2:40e ;3:60e ;4:70e 5:80e图5 不同温度处理对CM L 荧光光谱影响Fig.5 F luor escence intensify of CML w ith different temper ature1:天然CM L;2:40e ;3:60e ;4:70e ;5:80e2.4 不同pH 处理对CML 圆二色谱的影响不同pH 条件下的CML 的远紫外圆二色谱见图6,活性变化见表3.在pH 4.0时,谱峰呈现双负峰,说明在pH 4.0时,CML 的结构显示了A -螺旋的特征结构,而且这时CM L 的活性也有较大的下降.pH 13.0时,CM L 的远紫外圆二色谱在202nm 处出现了一个大的负峰,这时的CM L 已完全失活.200nm 附近的负峰是无规卷曲为主的特征曲线,因此pH 13.0条件下的CML 的分子主要以无规卷曲为主,此时CM L 活性中心构象受到破坏,导致了活性完全丧失.2.5 不同浓度的盐酸胍对CM L 圆二色谱的影响不同浓度盐酸胍处理CML 的圆二色谱见图7,活性变化见表4.CML 在盐酸胍达到3.0mol/L 时,谱峰出现双负峰,并在大约234nm 处出现一小的负峰.这时CM L 的活性有所下降,而活性没有大的变化.从这里也看出CM L 的结构变化先于活性的变化,甚至结构变化较大,活性变化也不大,表明CML 具有一定的抗变性能力.当盐酸胍达到6.0mol/L 时,CM L 在210nm~250nm 的谱峰出现蓝移,峰位置在210nm182四川大学学报(自然科学版)第42卷处.在234nm 处也出现一个小峰,这时CM L 仍有凝血活性.当盐酸胍达到8mol/L 时,峰值出现在206nm,CM L 的活性完全丧失.盐酸胍达8.0mol/L 时的谱线与pH 13.0时的谱线很相似,都在200nm 处出现一个大的负峰,这是以无规卷曲为主的特征谱线,但是8.0mol/L 盐酸胍时的[H ]值变化不如pH 13.0时变化明显,说明在这时CM L 未完全变性,分子中仍存在部分有序结构.表3 不同pH 对CM L 活性的影响T able 3 T he hemag glutinating activity of CM L w ith the different pHpH 凝集素浓度(@10-4g/mL)7.16 3.58 1.790.8950.4480.2240.1124.0+++----5.0++++++-天然+++++++9.0++++++-11.0++-----13.0-------/+0表示凝血/-0表示不凝血图6 不同pH 条件下CM L 的圆二色谱Fig.6 CD spectra of CM L with different pH1:天然CM L;2:pH 4.0;3:pH 5.0;4:pH 9.0;5:pH 11.0;6:pH 13.图7 不同浓度盐酸胍对CM L 圆二色谱的影响Fig.7 CD spectra of CM L w ith different concen -tration of guanidine -hydrochloride1:0mol/L;2:0.5mol/L;3:1.0mol/L;4:3.0m ol/L;5:6.0mol/L;6:8.0mol/L表4 不同浓度的盐酸胍对CM L 活性的影响T able 4 T he hemagglutinating activit y of CM L guanidine -hy drochlo ride盐酸胍(mol/L )凝集素浓度(@10-4g/mL)7.16 3.58 1.790.8950.4480.2240.1120+++++++0.5+++++--1.0++++--+3.0++++---6.0++-----8.0-------/+0表示凝血/-0表示不凝血蛋白质变性经历不同的中间构象阶段.以上不同条件下的研究结果表明,CM L 的变性过程至少经历两个阶段,先是整体构象的变化,凝血活性变化有限.然后是活性中心构象的变化,CM L 丧失活性.对比183第1期赵曦等:金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响CM L 在不同变性条件下的远紫外圆二色谱,发现在变性过程中都有一个B -折叠向A -螺旋转变的状态,这个状态可能就是CM L 变性的一个中间状态,这也为CML 的变性过程具有阶段性提供了证据.2.6 CM L脲变性的时间扫描荧光光谱图8 CML 的时间扫描荧光光谱 Fig.8 T ime -scanning F luorescence intensify of CM L 从图8是CML 的时间扫描荧光光谱,激发光波长295nm,发射波长335nm,1:从水溶液到8.0mol/L 的脲;2:从8.0mol/L 的脲到水溶液.可以看到,相对荧光强度的变化表明CML 在8.0mol/L 脲中的变性过程是一个相对较快的的过程,而脲变性的复性过程则是一个相对缓慢的过程.参考文献:[1] 孙册.生物化学与生物物理进展,1981,1:136.[2] 周红,曾仲奎.生物化学杂志,1997,13:546-551.[3] 汪新艳,周红.四川大学学报,2001,38:752-756.[4] 曾仲奎,杨静平.生物化学杂志,1988,4:489-494.[5]Low ry O H,Rosebr ough N J,F arr A L ,et al .J.Biol.Chem,1951,193:265-275.[6] 孙册,朱政.凝集素[M].北京:科学出版社,1996.15-21.[7] L itman G W ,Frommel D,Rosenberg A,et al .Biochim Biophys A cta,1971,236(3):647-654.[8] 鲁子贤,崔涛,施庆洛.圆二色性和旋光色散在分子生物学中的应用[M ].北京:科学出版社,1987.[9] 曾仲奎,邓俊林.四川大学学报(自然科学版),1995,32:720-724.[10] 孙建忠,王克夷.生物化学与生物物理学报,1994,26:649-655.[11] 周红,曾仲奎,鲍锦库.生物化学杂志,1996,12:564-568.[12] Brown R D,Brewer C F,K oenig S H.Biochemistry ,1982,21:465-469.[13] Brown R D,Brewer C F,K oenig S H.Biochemistry ,1977,16:3883-3896.The Effects of Metal Ions and Denaturants on the Conformation andHemagglutinating Activity of Crotalaria mucronata lectinZHA O X i,RON G Yan -z en ,CH ANG L i -qing,GA O Shun ,W U Chuan -f ang ,L I Yi -in ,WAN G Chen -j i,BAO J in -ku(College of Life Science Sichuan University,Chengdu 610064,China)Abstract:To elucidate the relationship between conformational change and hemagglutinating activity of Cro -talaria mucronata lectin (CM L),the effects of metal ions and denaturants on conformation and hemag glut-ination of CM L w ere studied.T he agglutinating activity of CM L decreased obv iously after removing metal ionsfrom CML.Incubation of the deionized CML with Ca 2+,M g 2+,Mn 2+,Zn 2+respectively,recovered the ag -g lutinating activity of CM L to its natural level.It show ed that some ions w ere helpful to stabilize the confor -mation of CML.Circular dichroism (CD)spectrum of natural CML indicated that B -sheets dominated in its secondary structure.The chang e of CD spectrum and hemagglutination of CML at different pH ,temperature and guanidinium hydrochloride concentration indicated that CM L had a comparably stable structure despite of containing high B -sheet and lack of disulfide bond.The denaturation w as a tw o -step process.First,CM L didn .t lose activity despite of its structural changes because these changes were out of the activity center.Sec -ond,the activ ity center w as destroyed and CML lost its agglutinating activity completely.And the fluores -cence spectra (FLS)of CM L at different temperature also revealed that there were tw o steps during the de -naturation.Key words:Crotalaria mucronata le ctin;metal i o n;circ ular dichroism;fluore sc ence spec tra ;hemagglutina ting activity184四川大学学报(自然科学版)第42卷。
植物血凝素与金属离子锰(Ⅱ)的配位作用
植物血凝素与金属离子锰(Ⅱ)的配位作用
马贵斌;杨频
【期刊名称】《化学研究与应用》
【年(卷),期】1992(000)001
【摘要】植物血凝素简称PHA是从菜豆中提取的一种凝集素,能激活T淋巴细胞使其增殖,含有红血球凝集素（H-PHA）和白血球凝集素（L-PHA）,某些凝集素分子中含有金属离子,如Mn<sup>2+</sup>、Ca<sup>2+</sup>等,这些凝集素与糖结合的活力和生物活性均依赖于金属离子的存在,这表明金属离子对凝集素的活性有影响.PHA与金属离子的作用研究还未见报道,本
【总页数】4页(P57-60)
【作者】马贵斌;杨频
【作者单位】山西大学化学系、分子所;山西大学化学系、分子所太原 030006;太原 030006
【正文语种】中文
【中图分类】O6
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君
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凝集素生物学功能及应用_综述_
安徽农业大学学报,2001,28(4):445～447Journal of A nhui A gricultural U niversity凝集素生物学功能及应用(综述)α赵寅生(安徽大学生命科学学院,合肥230039)摘 要:凝集素(lectin)是一类具有糖结合专一性,是可促使细胞凝集的蛋白质。
凝集素对糖的特异结合性决定了它在动植物体内具有一些重要而特殊的生物学功能。
利用这些功能,凝集素在生物养殖、生物工程、生理活动调控、疾病防治等方面展示出广阔的应用前景。
关键词:凝集素;生物学功能;应用 中图分类号:Q51文献标识码:A文章编号:100022197(2001)0420445203凝集素具有糖结合专一性,因此可与生物体内大量功能各异的糖复合物结合,形成一系列生物学功能。
在动物和植物体内,凝集素又有一些不同的功能。
凝集素的独特的生物学功能为其应用开辟了广阔的前景。
以下就其部分功能和应用做一个简要评述。
1 植物凝集素的生物学功能111 防卫作用凝集素在植物保护上起着重要作用。
植物凝集素可识别并结合入侵者的糖结构域,从而干扰该入侵者对植物产生的可能影响。
许多植物凝集素可结合到诸如Glc、M an或Gal的单糖上,尤其对植物中不常见外来的寡糖具有更高的亲和性。
例如:结合几丁质植物凝集素识别真菌细胞壁及无脊椎动物的外骨骼成分中的碳水化合物。
另外,许多凝集素在较大pH值范围内稳定、抗热、抗动物及昆虫蛋白酶等等。
有些凝集素甚至是完全稳定的蛋白质,如从刺荨麻茎中分离出的凝集素在三氯乙酸中保持稳定,沸煮也不会失活。
因此,植物凝集素是植物防御系统重要的组成部分[1,2]。
11111 对真菌的作用 凝集素可与真菌表面的葡聚糖、半乳糖、甘露糖等多糖结合,干扰真菌细胞壁的合成,影响其细胞的正常代谢。
体外研究表明W GA抑制孢子发芽及T richod er m av irid e菌丝生长,具有抗真菌性。
棉花抗病品种种仁凝集素粗提物对棉枯萎病菌(F usarlum ox y sp orum f1sp1vasinf eclum)孢子萌发的抑制效果为86141%～93175%,根部提取液抑制效果为86157%～89106%[1]。
金属离子对蛋白酶活力和热稳定性的影响
金属离子对蛋白酶活力和热稳定性的影响
李隽芝
【期刊名称】《明胶科学与技术》
【年(卷),期】2004(24)4
【摘要】分别详细考查了3种金属离子对1398中性蛋白酶活力和热稳定性的影响。
采用福林法测定了蛋白酶的最适反应温度和pH值，并在最适条件下确定了3种不同金属离子的最适反应浓度，考察和比较了它们对蛋白酶活力及热稳定性影响的差异。
结果表明，这3种金属离子对酶活力均有提高，而钙离子还具有增强酶热稳定性的作用。
【总页数】1页(P213-213)
【关键词】金属离子;蛋白酶;热稳定性;福林法;反应温度;钙
【作者】李隽芝
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】O629.8
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2022年辽宁省沈阳市浑南新区实验中学高一生物期末试题含解析
2022年辽宁省沈阳市浑南新区实验中学高一生物期末试题含解析一、选择题（本题共40小题，每小题1.5分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
）1. 动物体内重要的储能物质是（）A. 乳糖B. 脂肪C. 淀粉D. 糖原参考答案：BD2. 下列关于基因、性状以及二者关系的叙述，正确的是( )A．基因在染色体上呈线性排列，基因的前端有起始密码子，末端有终止密码子B．基因能够通过复制实现遗传信息在亲代和子代之间的传递C．性状受基因的控制，基因发生突变，该基因控制的性状也必定改变D．通过控制酶的合成从而直接控制性状，是基因控制性状的途径之一参考答案：B略3. 噬菌体侵染细菌后形成子代噬菌体。
这些子代噬菌体的蛋白质外壳的原料来自于A、亲代噬菌体外壳B、子代噬菌体外壳C、噬菌体的化学成分D、细菌内的化学成分参考答案：D略4. 荠菜的果实形状有三角形和卵圆形两种，由两对等位基因控制，遵循基因的自由组合定律。
现三角形果实荠菜与卵圆形果实荠菜做亲本杂交，F1都是三角形果实荠菜，F2中三角形果实与卵圆形果实荠菜的比例为15：1。
F2三角形果实荠菜中，部分个体自交后发生性状分离，这样的个体在F2三角形果实荠菜中的比例为 ( )A．1/5 B．1／3 C．7／15 D．8/15参考答案：D5. 下列关于分离现象的假说不正确的是A. 决定显性性状的显性遗传因子，用大写字母表示B. 生殖细胞中遗传因子是成对存在的C. 受精时，雌雄配子的结合是随机的D. 生物体在形成配子时成对的遗传因子彼此分离，分别进入不同的配子中参考答案：B显性性状由显性遗传因子决定，用大写字母表示，A项正确；生殖细胞中遗传因子是成单存在的，B 项错误；受精时雌雄配子随机结合，C项正确；生物体在形成配子时成对的遗传因子彼此分离，分别进入不同的配子中，D项正确。
6. ATP是细胞的能量“通货”。
下列相关叙述正确的是A．ATP中的A代表腺嘌呤 B．ATP中的T代表胸腺嘧啶C．ATP的结构简式可表示为A—P~P~P D．ATP中靠近A的高能磷酸键易水解参考答案：C7. 取生长健壮的小麦根尖，经过解离、漂洗、染色、制片过程，制成临时装片，放在显微镜下观察。
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收稿日期:2004-06-30基金项目:国家自然科学基金(39770178)*通讯作者文章编号: 0490-6756(2005)01-0179-06金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响赵 曦,荣艳珍,常丽青,高 顺,吴传芳,李宜瑾,王陈继,鲍锦库*(四川大学生命科学学院成都610064)摘要:野花生豆凝集素在pH 7.0和pH 5.0缓冲体系中,用EDTA 去除其金属离子,CM L 凝血活性下降.Ca 2+、M g 2+、Mn 2+、Zn 2+可使去除金属离子CM L 活性基本恢复到天然水平,表明这些二价金属离子为CML 活性所必需.研究不同温度和不同浓度盐酸胍条件下CML 的圆二色谱、荧光光谱及其凝血活性的变化,结果表明CML 含有较多B -折叠,具有较强的抗变性能力;脲变性的时间扫描荧光光谱证实了CM L 变性过程的阶段性.关键词:野花生豆凝集素;金属离子;圆二色谱;荧光光谱;生物学活性中图分类号:Q68 文献标识码:A凝集素是一类结构各异的非免疫源性的糖结合蛋白或糖蛋白[1].植物凝集素是凝集素家族中重要一类.虽然植物凝集素存在的生理意义还不十分清楚,但越来越多的植物凝集素被分离纯化,人们利用各种生物化学手段对植物凝集素的结构和性质进行研究.野花生豆凝集素(Crotalaria mucronata lectin,简称CM L)是一类A 型血专一性凝集素,对它的分离纯化及性质研究已有报道[2,3].本文在已有性质研究的基础上,研究CML 活性与金属离子之间的关系,并结合远紫外圆二色谱及内源荧光光谱的方法,研究CM L 在变性条件下构象和活性变化的关系.1 材料与方法1.1 材料野花生豆种子采自福建省上杭地区;新鲜健康人A 型血采自成都市第六人民医院;Sephacry S -200HR 购自Pharmacia 公司;SDS -PAGE 低分子量标准为上海丽珠东风生物技术有限公司产品.荧光光谱测定在HITACHI F -4500荧光分光光度计上进行,激发和发射光谱谱宽均为5.0nm ,测定温度为25e .圆二色谱在JASCO -500型自动记录分光偏振仪上测定.1.2 方法1.2.1 CML 纯度测定 按文献[4]的方法纯化CML,纯化的CML 在PAGE 或SDS -PAGE 均呈现单一蛋白带.1.2.2 CML 浓度测定 蛋白质浓度测定用Folin -酚试剂,以牛血清白蛋白作标准[5].1.2.3 CML 活性测定 参照文[6]凝集活性测定在微量血清稀释板上进行,在系列倍比稀释的/V 0型孔中加入人A 型血红细胞振摇10m in,室温放置2h,显微镜检查凝血活性.1.2.4 金属离子对CML 活性影响 取4.32@10-4g/mL CM L 2~3mL,在含2mmol/L EDTA 0.1mol/L2005年2月第42卷第1期四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan U niversity (Natural Science Edition)Feb.2005Vol.42 No.1HAc-NaAc缓冲液中透析20~30h,透析去除EDTA,调节pH到中性,测定凝集素凝血活性和荧光光谱.凝血活性.另取对照测定凝血活性.1.2.5不同温度处理对CML圆二色谱和荧光的影响未经处理样品(生理盐水为溶液)进行远紫外圆二色谱.CM L为0.716@10-3g/mL;残基平均分子量110;灵敏度2m b/cm;光程0.02cm.以下圆二色谱的测定均按此参数进行.将溶解在生理盐水中的CM L作为天然状态CM L.将用生理盐水配制的CM L分别于40e、60e、70e、80e保温10m in,快速冷却后测定其活性及光谱性质.(以下实验样品同)1.2.6不同pH处理对CM L圆二色谱的影响配制0.1mol/L pH4.0、5.0HAc-NaAc缓冲液、0.1mol/ L pH9.0NaHCO3-Na2CO3缓冲液和pH11.0、pH13.0NaOH溶液.将CML溶于上述溶液中,4e放置过夜,测定圆二色谱和调节pH到中性并测凝血活性.1.2.7不同浓度盐酸胍对CML圆二色谱的影响将CM L溶于含有0.5mol/L、1mol/L、3mol/L、6mol/ L、8mol/L盐酸胍的生理盐水中,分别测定凝血活性和圆二色谱.1.2.8CML脲变性的时间扫描荧光光谱将含8mol/L脲的CML溶液(配制后放置24h以上),用水稀释,使CML终浓度为50mg/L,测定其在295nm激发光下发射波长为335nm的相对荧光光谱强度随时间的变化.2结果与讨论2.1天然状态CML的圆二色性与荧光光谱CM L的远紫外圆二色谱在218nm处显示单一负峰(图1),在199nm处有一正峰,峰值约为218nm峰值的两倍.这些是以B-折叠为主的蛋白质的远紫外圆二色谱的主要特征[7].在中性和SDS溶液中,多聚L-赖氨酸呈B-折叠,它的远紫外圆二色谱在218nm处有一负峰.Litman 等人[7]从遗传树上处于关键地位的九个种属中分离了高分子或低分子的免疫球蛋白,测定了他们的远紫外圆二色谱,这些谱线共同特征是217nm处的负峰,而它们的结构以B-折叠为主.白鲟有一沉降系数为10S的免疫球蛋白及鸡的IgG的远紫外圆二色谱的峰位置均为217.5nm[8].CM L的远紫外圆二色谱峰在218nm处,它的谱线与以上的蛋白很相似,由此推测,CM L的二级结构以B-折叠为主.CM L的内源荧光发射光谱见图2.用280nm激发时,发射峰峰值位于335nm处.其中未见有T yr残基的发射峰,表明Tyr残基的荧光基本上通过能量转移传递给了Trp残基,使得Trp残基的荧光光谱增强[9,10].用295nm的激发光激发时,CM L荧光光谱最大发射峰也在335nm,这与水溶液中自由Trp的荧光光谱280nm相比发生了明显的蓝移[9].说明Trp残基位于疏水环境中,这与荧光淬灭的结果一致[2].图1天然CM L的圆二色谱图Fig.1CD spectra of native CML图2天然CM L的荧光发射光谱F ig.2Fluorescence spectra of nativ e CM L 1:激发光波长280nm;2:激发光波长295nm180四川大学学报(自然科学版)第42卷2.2 金属离子对CM L 光谱和活性的影响在pH 5.0和pH7.0时用EDTA 除去金属离子后,CM L 的活性变化如表1:表1 金属离子对CM L 活性的影响T able 1 T he hemagglutinating activit y of CM L with the effect of metal ionCM L 凝集素浓度(@10-4g/mL)4.32 2.16 1.080.540.270.1350.68天然+++++++pH5.0去离子--+++----Ca 2+++++++-M g 2++++++--Zn 2+++++++-M n 2++++++--pH7.0去离子++-----Ca 2+++++++-M g 2++++++--Zn 2+++++++-M n 2++++++--/+0表示凝血;/-0表示不凝血金属离子对CML 光谱和活性的影响见图3.去除金属离子后CM L 还有一部分处于活性构型,就像去离子的ConA 处于/松散0型和/紧凑0型的平衡一样[12],/紧凑0型具有活性.pH 5.0时去除金属离子后的荧光峰相对强度下降更甚的原因可能是:酸性pH 值,使失去金属离子的CML 部分Trp 残基的微环境发生了较大的变化,使之更为亲水,CM L 分子的稳定性下降程度更大,导致相对荧光强度下降更甚.图3 金属离子对CM L 的荧光光谱的影响Fig.3 Fluor escence spectr a of CM L w ith the effect o f metal ion激发波长280nm;A:pH 7.0;B:pH 5.0;1:天然CM L,2:未除去EDTA,3:去除EDTA在去除金属离子后的CML 中添加Ca2+、Mg2+、Zn2+、M n2+,CML 的活性恢复程度见表1.一些金属离子可以使去离子的CM L 活性恢复,说明这些金属离子是CML 活性所必需的,特别是Ca 2+和Zn 2+.豆科凝集素有两个金属离子结合位点:一个是过渡金属离子的结合位点,另一个是钙离子结合位点.在C on A 中,Ca 2+可以稳定/紧凑0型(活性构型)构型,Mn 2+也有这种作用[13].由此看来,去离子的CML 可能也存在着/紧凑0型和/松散0型的平衡,Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Mn 2+都可以稳定CML 的/紧凑0型构型,使平衡向有利于/紧凑0型构型方向移动,从而使去离子的C ML 活性得到恢复.只是Mg 2+、Mn 2+的作用不及Ca 2+、Zn 2+.2.3 不同温度处理对CM L 活性及光谱的影响181第1期赵曦等:金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响CM L 经不同温度处理的远紫外圆二色谱见图4.温度处理导致的活性变化见表2.在40e 、60e 处理10min 后的CML 的远紫外圆二色谱与天然状态的CML 相比,峰的位置没有改变,但峰值减小.此时仍然具有较强的凝血活性.70e 处理的CML 的远紫外圆二色谱峰蓝移,峰值减小,峰形变宽,这时的CML 结构有了较大的变化,活性也相应降低.经80e 处理的CML 的谱形变化较大,不仅峰发生蓝移,而且谱峰显示典型的双负峰,分别出现在216nm 、208nm 处,这些都是A 螺旋的特征谱型.这时的CM L 的活性有了较大的改变,但未完全失活.不同温度处理后的CML 的荧光光谱见图5.表2 不同温度处理对CM L 活性的影响T able 2 T he hemag glutinating activity of CM L w ith the different temperatur e温度(e )凝集素浓度(@10-4g /mL )7.16 3.58 1.790.8950.4480.2240.112天然+++++++30+++++++40+++++--60+++++--70++++---80+++----/+0表示凝血/-0表示不凝血图4 不同温度处理对CM L 圆二色谱的影响Fig.4 CD spectra of CM L with different temperature1:天然CM L;2:40e ;3:60e ;4:70e 5:80e图5 不同温度处理对CM L 荧光光谱影响Fig.5 F luor escence intensify of CML w ith different temper ature1:天然CM L;2:40e ;3:60e ;4:70e ;5:80e2.4 不同pH 处理对CML 圆二色谱的影响不同pH 条件下的CML 的远紫外圆二色谱见图6,活性变化见表3.在pH 4.0时,谱峰呈现双负峰,说明在pH 4.0时,CML 的结构显示了A -螺旋的特征结构,而且这时CM L 的活性也有较大的下降.pH 13.0时,CM L 的远紫外圆二色谱在202nm 处出现了一个大的负峰,这时的CM L 已完全失活.200nm 附近的负峰是无规卷曲为主的特征曲线,因此pH 13.0条件下的CML 的分子主要以无规卷曲为主,此时CM L 活性中心构象受到破坏,导致了活性完全丧失.2.5 不同浓度的盐酸胍对CM L 圆二色谱的影响不同浓度盐酸胍处理CML 的圆二色谱见图7,活性变化见表4.CML 在盐酸胍达到3.0mol/L 时,谱峰出现双负峰,并在大约234nm 处出现一小的负峰.这时CM L 的活性有所下降,而活性没有大的变化.从这里也看出CM L 的结构变化先于活性的变化,甚至结构变化较大,活性变化也不大,表明CML 具有一定的抗变性能力.当盐酸胍达到6.0mol/L 时,CM L 在210nm~250nm 的谱峰出现蓝移,峰位置在210nm182四川大学学报(自然科学版)第42卷处.在234nm 处也出现一个小峰,这时CM L 仍有凝血活性.当盐酸胍达到8mol/L 时,峰值出现在206nm,CM L 的活性完全丧失.盐酸胍达8.0mol/L 时的谱线与pH 13.0时的谱线很相似,都在200nm 处出现一个大的负峰,这是以无规卷曲为主的特征谱线,但是8.0mol/L 盐酸胍时的[H ]值变化不如pH 13.0时变化明显,说明在这时CM L 未完全变性,分子中仍存在部分有序结构.表3 不同pH 对CM L 活性的影响T able 3 T he hemag glutinating activity of CM L w ith the different pHpH 凝集素浓度(@10-4g/mL)7.16 3.58 1.790.8950.4480.2240.1124.0+++----5.0++++++-天然+++++++9.0++++++-11.0++-----13.0-------/+0表示凝血/-0表示不凝血图6 不同pH 条件下CM L 的圆二色谱Fig.6 CD spectra of CM L with different pH1:天然CM L;2:pH 4.0;3:pH 5.0;4:pH 9.0;5:pH 11.0;6:pH 13.图7 不同浓度盐酸胍对CM L 圆二色谱的影响Fig.7 CD spectra of CM L w ith different concen -tration of guanidine -hydrochloride1:0mol/L;2:0.5mol/L;3:1.0mol/L;4:3.0m ol/L;5:6.0mol/L;6:8.0mol/L表4 不同浓度的盐酸胍对CM L 活性的影响T able 4 T he hemagglutinating activit y of CM L guanidine -hy drochlo ride盐酸胍(mol/L )凝集素浓度(@10-4g/mL)7.16 3.58 1.790.8950.4480.2240.1120+++++++0.5+++++--1.0++++--+3.0++++---6.0++-----8.0-------/+0表示凝血/-0表示不凝血蛋白质变性经历不同的中间构象阶段.以上不同条件下的研究结果表明,CM L 的变性过程至少经历两个阶段,先是整体构象的变化,凝血活性变化有限.然后是活性中心构象的变化,CM L 丧失活性.对比183第1期赵曦等:金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响CM L 在不同变性条件下的远紫外圆二色谱,发现在变性过程中都有一个B -折叠向A -螺旋转变的状态,这个状态可能就是CM L 变性的一个中间状态,这也为CML 的变性过程具有阶段性提供了证据.2.6 CM L脲变性的时间扫描荧光光谱图8 CML 的时间扫描荧光光谱 Fig.8 T ime -scanning F luorescence intensify of CM L 从图8是CML 的时间扫描荧光光谱,激发光波长295nm,发射波长335nm,1:从水溶液到8.0mol/L 的脲;2:从8.0mol/L 的脲到水溶液.可以看到,相对荧光强度的变化表明CML 在8.0mol/L 脲中的变性过程是一个相对较快的的过程,而脲变性的复性过程则是一个相对缓慢的过程.参考文献:[1] 孙册.生物化学与生物物理进展,1981,1:136.[2] 周红,曾仲奎.生物化学杂志,1997,13:546-551.[3] 汪新艳,周红.四川大学学报,2001,38:752-756.[4] 曾仲奎,杨静平.生物化学杂志,1988,4:489-494.[5]Low ry O H,Rosebr ough N J,F arr A L ,et al .J.Biol.Chem,1951,193:265-275.[6] 孙册,朱政.凝集素[M].北京:科学出版社,1996.15-21.[7] L itman G W ,Frommel D,Rosenberg A,et al .Biochim Biophys A cta,1971,236(3):647-654.[8] 鲁子贤,崔涛,施庆洛.圆二色性和旋光色散在分子生物学中的应用[M ].北京:科学出版社,1987.[9] 曾仲奎,邓俊林.四川大学学报(自然科学版),1995,32:720-724.[10] 孙建忠,王克夷.生物化学与生物物理学报,1994,26:649-655.[11] 周红,曾仲奎,鲍锦库.生物化学杂志,1996,12:564-568.[12] Brown R D,Brewer C F,K oenig S H.Biochemistry ,1982,21:465-469.[13] Brown R D,Brewer C F,K oenig S H.Biochemistry ,1977,16:3883-3896.The Effects of Metal Ions and Denaturants on the Conformation andHemagglutinating Activity of Crotalaria mucronata lectinZHA O X i,RON G Yan -z en ,CH ANG L i -qing,GA O Shun ,W U Chuan -f ang ,L I Yi -in ,WAN G Chen -j i,BAO J in -ku(College of Life Science Sichuan University,Chengdu 610064,China)Abstract:To elucidate the relationship between conformational change and hemagglutinating activity of Cro -talaria mucronata lectin (CM L),the effects of metal ions and denaturants on conformation and hemag glut-ination of CM L w ere studied.T he agglutinating activity of CM L decreased obv iously after removing metal ionsfrom CML.Incubation of the deionized CML with Ca 2+,M g 2+,Mn 2+,Zn 2+respectively,recovered the ag -g lutinating activity of CM L to its natural level.It show ed that some ions w ere helpful to stabilize the confor -mation of CML.Circular dichroism (CD)spectrum of natural CML indicated that B -sheets dominated in its secondary structure.The chang e of CD spectrum and hemagglutination of CML at different pH ,temperature and guanidinium hydrochloride concentration indicated that CM L had a comparably stable structure despite of containing high B -sheet and lack of disulfide bond.The denaturation w as a tw o -step process.First,CM L didn .t lose activity despite of its structural changes because these changes were out of the activity center.Sec -ond,the activ ity center w as destroyed and CML lost its agglutinating activity completely.And the fluores -cence spectra (FLS)of CM L at different temperature also revealed that there were tw o steps during the de -naturation.Key words:Crotalaria mucronata le ctin;metal i o n;circ ular dichroism;fluore sc ence spec tra ;hemagglutina ting activity184四川大学学报(自然科学版)第42卷。