细粒棘球绦虫基因组测序完成共31页
细粒棘球绦虫DNA损伤修复蛋白Rad50的生物信息学分析
细粒棘球绦虫DNA损伤修复蛋白Rad50的生物信息学分析目录一、内容概要 (3)1. 研究背景与意义 (3)2. 国内外研究现状概述 (4)3. 本论文研究内容与方法 (5)二、Rad50蛋白基本特性分析 (6)1. Rad50蛋白序列比对与结构预测 (7)氨基酸序列相似性分析 (8)三维结构预测与分析 (9)2. Rad50蛋白功能域鉴定 (10)锚定区分析 (12)蛋白蛋白相互作用界面分析 (13)3. Rad50蛋白稳定性与表达分析 (14)亚细胞定位分析 (15)表达水平及稳定性评估 (16)三、Rad50蛋白DNA损伤修复功能研究 (17)1. Rad50蛋白与DNA损伤修复机制概述 (19)DNA双链断裂修复途径 (19)错配修复机制 (21)基因组不稳定性的影响 (22)2. Rad50蛋白在DNA损伤修复中的具体作用分析 (23)与DNA聚合酶的相互作用 (24)促进同源重组修复过程 (26)参与非同源末端连接修复 (28)3. Rad50蛋白调控机制研究 (29)信号通路调控 (30)环境因素对Rad50蛋白活性的影响 (32)四、Rad50蛋白进化分析与系统发育研究 (33)1. 细粒棘球绦虫Rad50蛋白与其他物种Rad50蛋白的序列比对与差异分析342. 同源基因复制与进化分析 (36)3. 系统发育树构建与物种分类 (37)五、Rad50蛋白结构模建与功能预测 (38)1. 基于结构的药物设计思路探讨 (40)2. 分子对接技术应用于Rad50蛋白抑制剂筛选 (41)3. 药物分子对接模型的验证与优化 (42)六、结论与展望 (43)1. 研究成果总结 (44)2. 存在问题与不足 (45)3. 未来研究方向与应用前景展望 (46)一、内容概要本文档旨在进行细粒棘球绦虫DNA损伤修复蛋白Rad50的生物信息学分析。
分析内容包括对Rad50蛋白的基本性质、结构特征、进化关系以及功能预测等方面的研究。
细粒棘球绦虫锌指蛋白基因的克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达分析
细粒棘球绦虫锌指蛋白基因的克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达分析徐梦飞;卢平萍;马勋;张艳艳;王炜烨;孟季蒙;王正荣;薄新文【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2018(027)012【摘要】旨在分析并预测细粒棘球绦虫锌指蛋白(Echinococcus granulosus zinc finger peotein,Eg-ZFP)结构、功能及其在细粒棘球绦虫发育过程中的表达模式,预测其在细粒棘球绦虫防治中潜在的作用.通过对前期细粒棘球绦虫原头蚴(protoscolex,PSC)转录组高通量测序结果中Unigene进行筛选,克隆Eg-ZFP基因并进行序列分析,实时荧光定量PCR(Reahime fluorescence quantitative PCR,qPCR)分析Eg-ZFP在原头蚴及成虫中的表达特征,利用全量组织原位杂交(Whole mount in situ hybridization,WISH)检测该蛋白mRNA在原头蚴和成虫组织中的分布情况.结果显示,细粒棘球绦虫Eg-ZFP基因的CDS序列长852 bp,具有完整的开放阅读框(852 bp),编码283个氨基酸,预测表明Eg-ZFP分子质量大小及等电点为31.6 ku和8.89;qPCR检测发现,Eg-ZFP在原头蚴及成虫阶段均有表达,且在成虫阶段表达量高;全量组织原位杂交检测结果表明,Eg-ZFP mRNA在原头蚴及成虫中分布广泛,且在成虫的生殖系统中丰度较高,提示Eg-ZFP与虫体生殖发育有关.结果表明Eg-ZFP在细粒棘球绦虫发育过程中具有重要作用,为进一步研究Eg-ZFP在E.granulosus防治中的作用奠定基础.【总页数】9页(P1707-1715)【作者】徐梦飞;卢平萍;马勋;张艳艳;王炜烨;孟季蒙;王正荣;薄新文【作者单位】石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室,新疆石河子832000【正文语种】中文【中图分类】S855.9【相关文献】1.细粒棘球绦虫EgM123基因序列分析及EgM家族基因在虫体不同发育阶段的差异表达分析 [J], 毛丽萍;王正荣;王伟;魏玉圆;翟少华;甘尚权;简子健2.红铃虫性信息素合成激活肽基因克隆、序列特征及在不同发育阶段的表达分析[J], 许冬;王玲;丛胜波;王金涛;李文静;万鹏3.细粒棘球绦虫脂肪酸去饱和酶1基因序列及不同发育阶段表达分析 [J], 徐梦飞;卢平萍;马勋;张艳艳;王炜烨;孟季蒙;王正荣;薄新文4.小麦锌指蛋白基因的克隆、序列与表达分析(英文) [J], 万平;令利军;周文娟;张文俊;凌宏清;朱立煌;张相岐5.新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段95抗原基因克隆及序列分析 [J], 林仁勇;丁剑冰;温浩;张文宝;李君;卢晓梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
寄生虫检验细粒棘球绦虫
②畜牧型，流行细粒棘球绦虫欧洲株。
受人生产活动影响，分布遍及世界各大洲
牧区，主要以犬和偶蹄类家畜之间循环为
特点。畜牧型中，又有羊／犬、牛／犬和
猪／犬等不同类型。在我国分布较广的是
绵羊／犬动物循环。其次是牦牛／犬循环，
仅见于青藏高原和甘肃省的高山草甸和山 麓地带。
• 我国主要流行在西北广大农牧区，即新 疆、青海、甘肃、宁夏、西藏和内蒙6省、 区。 • 其次是陕西、河北、山西和四川；另外 在东北三省、河南、山东、安徽、湖北、 贵州和云南等省有散发病例。
孕节及 虫卵
六钩蚴
血液
棘球蚴
人食入 棘球蚴（肝、肺等）
食肉动 物食入
成虫（小肠）
生活史要点
• 终末宿主为犬、狼等食肉动物
• 中间宿主是牛、羊及人。
• 感染期是虫卵。虫卵粘附于犬及牛羊的皮毛、 牧草或污染水源，中间宿主经口食入而受染。
• 棘球蚴主要寄生于肝（70%），其次是肺 （20%），也可寄生于任何组织，常为单发，且 生长速度缓慢，在人体可存活40年以上
• 若因棘球蚴破裂进入人的体腔，生发层或原头 蚴又可发育为新的棘球蚴（多个）。
三.致病
棘球蚴对人体的危害以机械损害为主。
包虫病的严重程度取决于棘球蚴的体积、
数量、寄生时间和部位。因棘球蚴生长缓
慢，往往在感染5～20年才出现症状，原发
的棘球蚴感染多为单个；继发感染常为多
发，可同时累及几个器官。
• 棘球蚴在人体内可发现于几乎所有部位。
流行严重的因素主要有以下3点：
1.虫卵对环境的严重污染 牧区犬感染通常较重，使犬粪中虫卵 量很大，随动物的活动以及尘土、风、水 等播散，导致虫卵严重污染环境。
虫卵对外界低温、干燥及化学药品有很 强抵抗力。在2℃水中能活2.5年，在冰中 可活4个月，经过严冬（－12～－14℃仍保 持感染力。一般化学消毒剂不能杀死虫卵。
都兰县家牧犬细粒棘球绦虫感染情况调查
中国动物检 疫 ２ ０ １ ３年 第 ３ ０卷第 ５期
— ４ １ 一
过 的经历 。农 业 区调 查 的 ２ ０户 中 ，有 ２ ４条 家牧 犬 ，
随意 处置 病死 狗 尸 ，污染 生活 及生 产环 境 。
都 进 行栓 养 。所有 的调查 户都 没有 给 饲养 犬 驱 虫 的历 ３ ． ３ 为 有 效 防控 犬细粒 棘 球绦 虫病 ，必 须采 取综 合 防 史 ，都有 生喂 动物 内脏 和 病死 动物 尸体 的 习惯 ，对犬 治 措 施 。一是 加 强广 泛 的宣 传 ，使广 大农 牧 民认 识 到 排 泄 出 的粪便 从 不收 集进 行 无害 化 处理 ，没 有接 触 犬 细 粒 棘球 绦 虫病 和 棘球 蚴病 对 人 畜的危 害 ，使他 们 能 后 洗 手 的习惯 。 ２ ． ２ 感 染结 果 够 积 极 自觉 的进 行 细 粒 棘 球 绦 虫 病 和 棘 球 蚴 病 的 防 共 检测 ３ ０条 ，阳性 数 １ ６条 ，感染 率 治 ；二 是通 过宣 传 ，改 变农 牧 民饲 喂生 食 、不及 时 处
定钳 。
是 寄生 于犬 、狐 狸 、狼 等 动物 小肠 中的寄 生虫 ，其 幼 １ ． １ ． ４ 投 药及 检虫用 品 虫． 棘 球蚴 可 寄 生于 人或 多 种动 物 致囊 性棘 球 蚴病 。
登记表 、生 理盐 水 、３ ０ ｃ ｒ ｎ Ｘ
２ ０ ｃ ｍ 搪 瓷盘 、１ Ｌ搪 瓷杯 、水 桶 、自制木 片 、挑 虫针 、
作 提供 基 础 数 据 和 科 学 依据 ，于 ２ ０ １ ２年 ７月 份 在 该 内排 便 ，收集 粪 样 ，至 于磁 盘 中加生 理 盐水 澄 清后 ，
县分 农业 区、牧业 区、农 牧业 结合 区进行 了家 牧犬 细 仔细 挑拣 成 虫并 计数 。 粒棘 球绦 虫综 合调 查 。
细粒棘球绦虫PPT课件
子囊 孙囊
生发囊
(棘球蚴砂） 原头蚴 囊液
10
囊壁：分两层
1.外层为角皮层（laminated layer）， 厚约1-4mm，乳白色、半透明，似粉皮状， 较松脆，易破裂。光镜下无细胞结构而呈 多层纹理状。
2.内层为生发层(germinal layer)亦称胚层， 厚约20µm，具有细胞核。生发层紧贴在角 皮层内，电镜下可见从生发层上有无数微 毛延伸至角皮层内。
虫。 头节有顶突、两圈小钩 和四个吸盘。
3
细粒棘球绦虫成虫、头节
4
头节：
头节呈梨形，有顶突和4个吸盘。顶突上有 两圈大小相间的小钩共28～48个，呈放射 状排列。顶突顶端有一顶突腺（rostellar gland），分泌物有抗原性 颈部：具有生发能力。 链体：幼节、成节、
孕节各1节。
5
细粒棘球绦虫头节
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• 我国主要流行在西北广大农牧区，即新 疆、青海、甘肃、宁夏、西藏和内蒙6 省、区。
• 其次是陕西、河北、山西和四川；另外 在东北三省、河南、山东、安徽、湖北、 贵州和云南等省有散发病例。
• 迄今全国已有23个省、市、区证实有当 地感染病人。
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• 在西北5省区流行区，据近年普查，人群 患病率在0.6%～4.5%之间，主要动物 中间宿主绵羊的棘球蚴感染率在3.3%～ 90%之间，家犬的成虫感染率在7%～ 71%之间，人群中最易感染者是学龄前 儿童(新疆15298例病人中，15岁以下者 占32.1％)。流行严重的因素主要有以下 3点：
绦虫也因此通过突变，形成了两大遗传 株系：
①森林型，流行细粒棘绦虫北方株。受 北极和全北区地理景观条件影响，主要在 犬、狼和鹿之间形成野生动物循环。
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细粒棘球绦虫基因型与抗原研究进展
２ Ａ ｉ ｌ ｃ ｎｅ ｎ ｔｕｅ ｆ ａ ｚＳａｅＫ ｎ ｄｎ ６ ０， ｈｎ ． ｎｍａ Ｓｉ ｃ ｓｉ ｔｏ Ｇ ｎ ｉ ｔｔ ａ ｇ ｉ ６ ０ ０ Ｃ ｉ ｅ Ｉ ｔ ， ｇ ２
２ ０ ，７３：５ — ６ ． ００ｒ Ｗ ｏ ｃ ｅ ａｖ ｖｒ ｓ ｒｐｉａ ｏ ２ ３ ｄｎ ， ｌ ｏ Ｈａ Ｍ ｔ Ｔ Ｐ ｒｉ ｒｏ ｉ ：ｅ ｌ ｔ ｎ ｎ ｐ ｕ ｃｉ
ｉ ｄｉｈ ｂ ｔ ｎｏ ｓ ｌｃｅ ｅｌｌｒ ｕ ｃｉｎ ｆ ｗｉ ｅ ｌ ｅ ｌｒ ｎ ａ ｉ ｉ ｏ ｆ ｅｅ ｔ ｄｃ ｌ ａ ｎ ｔ ｓ ｓ ｎ ｖ ｏａ ｎ ｎ ｉ ｕ ｆ ｏ ｏ ａ
收 稿 日期 ：２ ０９ ０ １ ０ ． ９— ０ 基 金项 目 ：国家 “ 一 ”支 撑 计 划项 目 （０ ６ Ａ ０ Ｂ ６ 十 五 ２０ Ｂ １６ ０ ）； 教育 部 《 江 学者 和 创 新 团 队发展 计 划 》创 新 团 队项 目 长
（Ｒ Ｏ８ ８ ＩＴ ４ ）和 国 家质 检 总局 科 技 计划 项 目 （ ０９Ｋ １ ） ２ ０ Ｉ ０ ９ 作 者 简介 ：王颖 旺 ，男 ，硕 士 ，土 要从 事动 物 寄生 虫 病 学研 究 。 通 讯作 者 ：杨光 友 ，Ｅ ｍａ ：ｇ ａｇ ｏ １６＠ｙ ｈｏｃｒ． ． ｉ ｕ ｎｙ ｕ ３ ａｏ ， ｎ ｃ ｌ ９ ｏ ｎ
ｄ ｅ ｓ ｉ ｐｇ ｆｃ ｄ ｉ ｒｉ ｒｏ ｉ ｓ Ｐ Ｖ ２ ［］ ｉ ａｅ ｎ ｉｓｎ ｅｔ ｔ ｐ ｃ ｅ ｉ ｖｒ 一 Ｃ －） Ｊ ． ｓ ｉ ｅ ｗ ｈ ｏ ｎ ｃ ｃ ｕ ２（ ｅ Ｐ ｔ ｌ ０， ８１ １ ４ ． Ｖ ｔ ａ ｏ， ０ １３ （）３ — ２ ｈ ２ ：
细粒棘球绦虫miRNAs的鉴定及分析
９９６０３ ， １ ８ 条 占高 质量 序列 总数 的 ４ ．２ ， 明 ９６ ％ 说 得 到 的数 据质 量 较 高 。 如 表 ２所 示 ， １ ８ 在 ９９４ ８５条 高质 量序列 中进 一 步去 除 ｒＮ ｓ Ｒ Ａ ， ２ Ｒ Ａ ，ｔＮ ｓ ｓｏ Ｎ ｓ ｎＲ Ａ 以及 ｍ Ｎ 降解 片段 对应 的序列 后 ， ＲＡ 剩
主要 包括 ： Ｐ ｔ ａ 用 ａｓ ｎ程 序 将 与 基 因组 完 全 匹 配 ｃ
的序 列和 Ｓｎｅ Ｒ ａｅ数 据 库 中 的 序 列 进 行 ａｇｒｍｉＢ ｓ 比对 ， 前体 的预测 ， 级 结构 预 测 ， 补 序列 的存 二 互
在 等 。其 中保 守 ｍ Ｒ Ａ 的认定 标准 为允 许 ２个 ｉＮ ｓ ２ ２ 细粒棘 球绦 虫种 间保 守 ｍｉ Ｎ ． Ｒ Ａ 总共鉴定 出 ２ ６条保守 ｍ Ｒ Ａ ， ３中列出了 ｉ Ｎ ｓ表
有。
关键词 ： 细粒棘球绦虫 ； Ｒ Ａ ； ｏ ｘ 高通量测序技术 ｍｉＮ ｓ Ｓ ｌ ａ ｅ
中图分类号 ： ５ ． ｓ８ ２７ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ４—１２ （０ ２ ０ ０ ５ ｏ １０ ５４ ２ １ ）４－ ６４一 ４
Ｉ ｅ ｉｆｃ ｔｏ ｎｄ ａ ｌ ｓｓｏ ｉ ｄ ｎｔｉ ａ ｎ ａ ｎａ ｙ ｉ ｆｍ ＲＮＡｓｉ Ｅｃ ｉ ｃ ｃ ｕ ａｎｕ ｏ ｕ ｉ ｎ ｈ ｎｏ ｏ ｃ ｓｇｒ ｌｓ ｓ
配 的独 立 序 列 有 ２ ８ ０ ９条 ， ５ ０ 占所 有 独 立 序 列 ２ ． ５ ， 后 完 全 与 基 因 组 匹 配 的 序 列 为 ２３ ％ 最
水 溶解 ， 测合 格 的样 品 一 ０Ｃ 存 。 检 ８ ￣保
Ａ是真核生物 内存在 的非常重要 的调 控因子 ， ｉＮ 本研究采用 Ｓｌ ａ高通量测 序技术 ， Ｇ ｏｘ ｅ 对 ｌ株原头 蚴 ｍｉ － ｃｏ Ｎ ｓ ｒＲ Ａ 进行 了鉴定和分析 ， 总共发现 了 １８条 ｍ Ｒ Ａ ， 中 ２ 属于保 守家 族 ， ２条是 细粒棘球 绦虫 特 ０ ｉＮ ｓ其 ６条 ８
细粒棘球绦虫TSP8 基因在其不同发育阶段的差异表达及生物信息学分析
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为研究细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus , E.g ）TSP8基因的分子特性以及其在虫体不同发育阶段的差异表达，根据NCBI GenBank 数据库中的TSP8基因设计1对特异性引物，对TSP8基因进行PCR 扩增，将PCR 产物克隆到pMD19-T 载体后测序，通过生物信息学软件分析预测TSP8基因的结构与功能，并通过SYBR Green Ⅰ qRT-PCR 方法分析TSP8基因在虫体原头蚴、包囊壁以及成虫mRNA 相对转录情况。
结果显示：成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因序列，与细粒棘球绦虫跨膜蛋白（GenBank 登录号：CDS17460.1）同源性为100%；进一步生物信息学分析显示，TSP8基因全长669个核苷酸，编码222个氨基酸，理论等电点为5.06，为稳定蛋白分子；TSP8基因编码的氨基酸序列共含有5个跨膜区域，含有4个优势B 抗原表位；qRT-PCR 结果显示TSP8基因在原头蚴及成虫阶段均有表达，差异显著，具有统计学意义（P <0.05）。
本研究对细粒棘球绦虫TSP8基因的分子特性进行了初步研究，为进一步揭示其生物学功能奠定了基础。
关键词：细粒棘球绦虫；基因克隆；差异表达；生物信息学分析中图分类号：S852.734文献标志码： A 文章编号：1674-6422（2022）01-0157-09Differential Expression and Bioinformatics Analysis of TSP8 Gene ofEchinococcus granulosus at Different Developmental StagesWANG WeiYe 1,2, WANG YunFei 1,2, LU BaoYan 1,2, Ma Xun 1,ZHANG Yanyan 2, MENG Jimeng 2, WANG Zhengrong 2, BO Xinwen 1,2(1. College of Animal Science and T echnology, Shihezi 832000, China; 2. State Key Laboratory of sheep Genetic Improvement and Healthy Production/Institute of Animal Husbandry and V eterinary, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, Shihezi 832000, China)收稿日期：2019-08-16基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（2015CB150300）；国家自然科学基金（31860701, 31360608）；新疆生产建设兵团国际科技合作（2017BC003）作者简介：王炜烨，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：王正荣，E-mail：*****************；薄新文，E-mail：****************细粒棘球绦虫TSP8基因在其不同发育阶段的差异表达及生物信息学分析王炜烨1,2,王云菲1,2，陆宝燕1,2，马 勋1，张艳艳2，孟季蒙2，王正荣2，薄新文1,2（1.石河子大学动物科技学院，石河子832000；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室 ，石河子832000）2022,30(1): 157-165Abstract: In order to study the molecular characteristics of the TSP8 gene of Echinococcus granulosus and its differential expression at different developmental stages, a pair of specifi c primers was designed according to the TSP8 gene in the NCBI GenBank database, and the TSP8 gene was amplified by PCR. The PCR product was cloned into the pMD19-T vector and sequenced for bioinformatics analysis. The relative transcription level of TSP8 gene in the hydatid protoscolex, cyst and adult mRNA was analyzed by SYBR Green Ⅰ qRT-PCR. The results showed that the TSP8 gene sequence of E. granulosus was successfully cloned. The gene sequence showed 100% identity with the TSP8 (CDS17460.1) as reported. Further bioinformatics analysis showed that the TSP8 gene was 669 nucleotides in length and· 158 ·中国动物传染病学报2022年2月encoded 222 amino acids. The theoretical isoelectric point was 5.06, which was a stable protein. The amino acid sequence encoding the TSP8 gene contained fi ve transmembrane regions, presumably contained four dominant B epitopes. Additionally, the qRT-PCR results showed that the TSP8 gene was expressed in both the protozoa and adult stages with signifi cant difference (P<0.05). In conclusion, the present study revealed the molecular characteristics of the TSP8 gene of E. granulosus and provided a foundation for further research on its biological functions.Key words:Echinococcus granulosus; gene cloning; differential expression; bioinformatics细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus, E.g）是包虫病（hydatidosis）的主要病原，是造成我国西部地区“因病致贫，因病返贫”的主要原因之一[1-3]。
细粒棘球绦虫泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析
畜牧兽医学报 2023,54(6):2605-2618A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.037开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):细粒棘球绦虫泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析杜小迪1,侯 巍2,苏中华3,马青梅4,何 雪1,华瑞其1,阳爱国2*,杨光友1*(1.四川农业大学动物医学院,成都611130;2.四川省动物疫病预防控制中心,成都610041;3.西藏自治区动物疫病预防控制中心,拉萨850000;4.青海省海北州海晏县畜牧兽医站,海晏810200)摘 要:本研究对细粒棘球绦虫泛素结合酶(E gE 2s )基因家族进行鉴定㊁生物信息学分析以及检测其在不同发育阶段的转录水平,为其功能研究和构建优势抗原表位疫苗奠定基础㊂本研究基于数据库中细粒棘球绦虫基因组学信息,对E gE 2s 基因家族进行T -A 克隆㊁生物信息学分析以及采用q R T -P C R 法检测了这些基因在原头蚴(P r o t o -s c o l e x ,P S C s )和28日龄童虫中的转录水平㊂结果成功克隆并测序19个E gE 2s 基因,更正了两个原序列有误的E g E 2s ,分别为E g E 2L 3(登录号:M Z 277618);E g E 2J 1(登录号:M Z 277619)㊂三级结构和保守基序预测结果表明E g E 2s 高度保守㊂q R T -P C R 结果显示,E g E 2s 的转录水平在P S C s 和28日龄童虫中存在差异,其中E g E 2A (P <0.001)㊁E g E 2J 1(P <0.01)在P S C s 阶段高表达㊂B 细胞抗原表位预测表明E g E 2N 的139-157区域位于E g E 2s 保守基序外㊂同时,T 细胞抗原表位预测表明E g E2N 与人和犬MH C Ⅰ类分子各有两个强结合位点,且有一个共同的抗原表位位点104-113㊂综上,E g E 2A 和E g E 2J 1可能在P S C s 的生长发育中起重要作用㊂E g E 2N 的139-157和104-113区域可能是药物研究和疫苗开发的靶序列㊂关键词:细粒棘球绦虫;泛素结合酶基因家族;生物信息学;转录水平分析中图分类号:S 852.734 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2605-14收稿日期:2022-06-29基金项目:四川省科技厅重点研发项目(2022Y F N 0013)作者简介:杜小迪(1996-),女,四川绵阳人,硕士,主要从事动物寄生虫病学研究,E -m a i l :187********@163.c o m*通信作者:阳爱国,主要从事动物寄生虫病学研究,E -m a i l :285689114@q q .c o m ;杨光友,主要从事动物寄生虫病学研究,E -m a i l :g u a n g y-o u 1963@126.c o mB i o i n f o r m a t i c s a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i s o f U b i q u i t i n -c o n j u g a t i n g E n z ym e G e n e F a m i l y of E c h i n o c o c c u sg r a n u l o s u s D U X i a o d i 1,HO U W e i 2,S U Z h o n g h u a 3,MA Q i n g m e i 4,H E X u e 1,HU A R u i qi 1,Y A N G A i g u o 2*,Y A N G G u a n g yo u 1*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,S i c h u a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,C h e n g d u 611130,C h i n a ;2.S i c h u a n C e n t e r f o r A n i m a l D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n ,C h e n gd u 610041,C h i n a ;3.T i be t A u t o n o m o u s R e g i o n C e n t e r fo r A n i m a l D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n ,L h a s a 850000,C h i n a ;4.A n i m a l H u s b a n d r y a n d V e t e r i n a r y S t a t i o n o f H a i y a n C o u n t y ,H a i b e i P r e f e c t u r e ,Q i n gh a i P r o v i n c e ,H a i ya n 810200,C h i n a )Ab s t r ac t :T o f u r t h e r e x p l o r e t h e g e n e f u n c t i o n a nd c o n s t r u c t t he d o m i n a n t e p i t o pe v a c c i n e ,s e -q u e n c e s i d e n t if i c a t i o n ,b i o i n f o r m a t i c s a n d t r a n s c r i p t i o n a n a l y s i s o f u b i q u i t i n -c o n j ug a t i n g e n z ym e g e n e f a m i l y o f E c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s s e n s u l a t o (E gE 2s )w e r e c o n d u c t e d .B a s e d o n t h e g e -n o m i c d a t a o f E c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s p u b l i s h e d b e f o r e ,t h e E gE 2s g e n e f a m i l y w a s c l o n e d a n d畜牧兽医学报54卷a n a l y z e d b y b i o i n f o r m a t i c s.I n a d d i t i o n,t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l s o f E g E2s i n p r o t o s c o l e x (P S C s)a n d28-d a y s t r o b i l a t e d w o r m s w e r e d e t e c t e d b y q R T-P C R.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t,19E g E2s g e n e s w e r e c l o n e d a n d s e q u e n c e d s u c c e s s f u l l y.C D S s e q u e n c e s a m o n g t w o o f t h e m w e r e o r i g i n a l l y w r o n g h a d b e e n c o r r e c t e d a n d s u b m i t t e d t o N C B I t o o b t a i n a c c e s s i o n n u m b e r (E g E2L3:M Z277618;E g E2J1:M Z277619).T h e p r e d i c t i o n o f t e r t i a r y s t r u c t u r e s a n d c o n s e r v a-t i v e m o t i f s i n d i c a t e d t h a t E g E2s w e r e h i g h l y c o n s e r v e d.q R T-P C R s h o w e d t h a t t h e t r a n s c r i p t i o n-a l l e v e l s o f E g E2s i n P S C s d i f f e r e d f r o m28-d a y s t r o b i l a t e d w o r m s,E g E2A(P<0.001)a n d E g E2J1(P<0.01)w e r e h i g h l y e x p r e s s e d i n P S C s.T h e p r e d i c t i o n o f B c e l l e p i t o p e s s h o w e d t h a t t h e139-157r e g i o n o f E g E2N w a s l o c a t e d o u t s i d e t h e c o n s e r v e d m o t i f s o f E g E2s.M e a n w h i l e, t h e T c e l l e p i t o p e s p r e d i c t i o n s h o w e d t h a t E g E2N h a d t w o s t r o n g b i n d i n g s i t e s w i t h h u m a n a n d c a n i n e MH C I m o l e c u l e s,r e s p e c t i v e l y,i n c l u d i n g a c o mm o n e p i t o p e r e g i o n104-113.I n c o n c l u-s i o n,E g E2A a n d E g E2J1m a y p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f P S C s. T h e139-157a n d104-113r e g i o n s o f E g E2N m a y b e t h e t a r g e t s e q u e n c e s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f d r u g s a n d v a c c i n e s.K e y w o r d s:E c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s;u b i q u i t i n-c o n j u g a t i n g e n z y m e g e n e f a m i l y;b i o i n f o r m a t i c s; t r a n s c r i p t i o n l e v e l a n a l y s i s*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:Y A N G A i g u o,E-m a i l:285689114@q q.c o m;Y A N G G u a n g y o u,E-m a i l: g u a n g y o u1963@126.c o m囊型棘球蚴病(C y s t i c e c h i n o c o c c o s i s,C E),又称囊型包虫病,是被忽视的热带人畜共患寄生虫病之一㊂该病呈世界性分布,造成了严重的公共卫生问题和畜牧业的经济损失[1]㊂该病的病原主要是细粒棘球绦虫(E c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s s e n s u l a t o)的中绦期幼虫,其主要以包囊的形式生长在中间宿主(绵羊㊁山羊和牛等)的肝和肺[2]㊂终末宿主(犬科动物)误食含有可育包囊的肝和肺后,原头蚴(P r o t o-s c o l e x,P S C s)在其肠道中外翻并附着在肠黏膜上,经过45d左右发育为成虫㊂每条成虫每天产生上千个虫卵,虫卵随粪便排出体外㊂中间宿主误食虫卵后,六钩蚴从虫卵中孵化出并穿透肠黏膜,通过血液移行到肝等器官,最终长成数量㊁大小不等的包囊[3]㊂泛素化是蛋白质翻译后修饰的重要过程,广泛存在于真核生物中,它调节蛋白质的稳定性和活性,从而调节多条信号通路[4]㊂蛋白质泛素化需要三种关键酶:泛素激活酶(u b i q u i t i n-a c t i v a t i n g e n z y m e, E1)㊁泛素结合酶(u b i q u i t i n-c o n j u g a t i n g e n z y m e, E2)和泛素连接酶(u b i q u i t i n l i g a s e,E3)㊂E1的半胱氨酸残基在A T P的能量供应下与泛素(u b i q u i t i n, U b)的C端甘氨酸残基结合,随后E1将激活的U b 转移到E2上,E2单独或通过E3协作将U b转移到靶蛋白上㊂U b以这样的方式不断转移到靶蛋白上形成单泛素化㊁多单泛素化或聚泛素化[5],聚泛素化常见的泛素连接方式是L y s11㊁L y s48和L y s63,这是由E2s决定的㊂L y s11和L y s48通常参与蛋白酶体降解过程,而L y s63参与非蛋白水解过程,如免疫调节㊁D N A修复和信号转导等[6]㊂在人类中,部分E2s的下调会增加p53蛋白的稳定性从而引起细胞凋亡,同时,它们也可能通过修饰蛋白分子(T R A F2/5/6㊁R I P1㊁I K Kγ等)而调节某些重要的信号通路(N F-κB)[7]㊂目前,高粱[8]㊁玉米[9]㊁水稻[10]㊁葡萄[11]和龙眼[12]等植物E2s基因家族的鉴定分析已完成,而寄生虫E2s基因家族的研究还局限于曼氏血吸虫[13]㊂2013年以来陆续出现了细粒棘球绦虫的组学研究报道,其测序多为二代测序如:R o c h e454[14]和I l l u m i n a S o l e x a[15-16],但其准确率不高,且难以检测序列的变异情况[17]㊂因此,本研究通过T-A克隆对细粒棘球绦虫泛素结合酶(E g E2s)家族进行序列鉴定和生物信息学分析,通过q R T-P C R分析E g E2s在P S C s和28日龄童虫中的转录水平,为探索E g E2s可能的生物学功能㊁发挥功能的调节机制以及构建优势表位疫苗等研究奠定基础㊂1材料与方法1.1材料1.1.1虫体材料细粒棘球绦虫包囊取自中国四川省的某屠宰场,从自然感染的绵羊肝和肺中无60626期杜小迪等:细粒棘球绦虫泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析菌采集包囊㊂囊液和P S C s的分离和处理如前所述[18-19]㊂采用0.4%台盼蓝染液检测P S C s的活力,将活性大于95%的P S C s用于后续试验[20]㊂收集的虫体统一进行基因型鉴定为G1型[21]㊂28日龄童虫由四川农业大学寄生虫病研究中心提供㊂1.1.2主要试剂总R N A提取试剂盒㊁琼脂糖凝胶回收试剂盒㊁G o l d V i e w T M核酸染料㊁2ˑT a q P C R M a s t e r M i x㊁D2000M a r k e r和D H5α感受态细胞均购自天根生化科技(北京)有限公司;p M D19-T C l o n i n g K i t㊁2ˑP r i m e S T A R M a x P r e m i x和T B G r e e n T M P r e m i x E x T a q T MⅡ均购自大连宝生物工程有限公司;P B S干粉㊁0.4%台盼蓝染液和氨苄青霉素干粉均购自北京索莱宝科技有限公司;八联管购自爱思进生物技术(杭州)有限公司;R e v e r t A i d R T逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技公司;L B肉汤购自青岛海博生物技术有限公司㊂1.2方法1.2.1总R N A的提取和c D N A合成将P S C s 和28日龄童虫置于灭菌和过夜冷冻的研钵中,加入适量液氮分别进行研磨㊂参照总R N A提取试剂盒说明书进行R N A的提取,采用N a n o D r o p2000分光光度计测定其浓度㊂以提取的R N A作为模板,反转录合成c D N A置于-20ħ备用㊂1.2.2E g E2s基因家族的克隆测序根据G e n eD B(h t t p s:ʊw w w.g e n e d b.o r g/)和N C B I(h t t p s:ʊw w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/)已发表的E g E2s的m R N A 序列,使用S n a p G e n e v e r s i o n2.3.2设计引物,引物序列(表1)交由上海生工生物工程有限公司合成㊂表1E g E2s基因家族引物T a b l e1P r i m e r s o f E g E2s g e n e f a m i l y基因名称G e n e n a m e上游引物(5'ң3')F o r w a r d p r i m e r(5'ң3')下游引物(5'ң3')R e v e r s e p r i m e r(5'ң3')根据N C B I数据设计D e s i g n e d b y t h e d a t a i n N C B IE g E2R1A T G G C G G C T G G T G C T A A T G T T A G C T T T T A A A A G A T G T G G A G G G C G E g E2G2A T G T C C G G G A G C G C G C T T A A A A G C T A A T T G A C A T C G C C C T C T G C GE g E2G1A T G A C G A G C T C T G C G T C T C A C T C G A A G G A T T C T T G G CE g E2J2A T G C C T C C T A C T C A C A A A G G A G T T A G C C G A T C G A A T C C C C A A GE g E2Z A T G A T G G A A G T T A C C A A C T G C T A G A A T T T T G C C T T C A G T G CE g E2I A T G G G T G A T T A C A G T G A G T T A A G A G A G A T T T G G G T T A C GE g E2C A T G A A G T G G T T A G C T A C A A T C T T A A T G C T C G A G G T T A C C A GE g E2B A T G T C G A C G C C T G C G C A A C C T A G G T G T C C G T A T C A T C C C A G C E g E2A A T G T C T A C G A G A G C A A G G C C T A G G A T G G G T C C A G T G G A T CE g E2S A T G G A A A A T G T G T A T C C A C A C T T A T A G G C G T C G T A T C A T C T T CE g E2N A T G A G T G G A C A T C T T C C T A C A C C T A G C G G A A G T C G G A A G T GE g E2-25A T G G C T G G C T C A A G T C T T G C T A T T T G A T A A G A A A C T C C G C A G C E g E22A T G G G T T T T G C C A A T G A T A C T G T T A G A C A A T G C A G T C A G G G A T T G E g E2D2A T G G C C C T G A A G A G G A T T C C T A C A T T G C G T A C T T C T G A G T CE g E2-24A T G T C T C G G C A A C A A G G C T C A T T G G T T T C C A T T C G A A G A T T C E g E2V2A T G A G C C A G A C C G T G A C C T A G T A G C A C G A G C C G T CE g E2L3A T G T G T G C A G C A A C A A G A C G T C A G C G C T T G A G G G C A T A CE g E2J1A T G A T G A C G G C C T A C A A C A C C T A G C T G A G C C C A G T G G T GE g E2-17A T G G A C C A T T G T C T A T A T C C G T T A T T T T T T G T C C T T T T T G G A A A C E g U B C12A T G A C T T G T C C A A C A A C T C T T A G A T C T C G T C G A G G T C GE g E2I A T G G G T G A T T A C A G T G A G T T A A G A G A G A T T T G G G T T A C GE g E2F A TG C T T C G T T T G G C T G A C T C A A C G A A G G A A T A T T G T G A G 根据G e n e D B数据设计D e s i g n e d b y t h e d a t a i n G e n e D BE g E2H A T G T C T T C G C C G G G T C C A G G A G G C T C G A G A T A T G G A G C T C T A G E g E2-17A T G G A C C A T T G T C T A T A T C C G T G T C A A T C A T T C C C T C G C T G A G TE g E2Z A T G G A A G T T A C C A A C T G G G A T C C T A G A A T T T T G C C T T C A G T G C C7062畜牧兽医学报54卷目的基因的克隆方法参照文献[22]所述,将连接有p M D19-T载体的质粒转化至D H5α感受态细胞中,置于37ħ恒温摇床以150r㊃m i n-1培养90m i n后涂于含A m p的固体L B培养基表面, 37ħ倒置培养12h㊂每个基因挑取8个单菌落于1m L的含A m p的液体L B中培养6h后进行P C R 鉴定,将阳性样品送公司测序㊂将测序结果与N C B I下载的E g E2s序列进行比对,若有问题则重复进行以上试验过程,以确定最终序列㊂1.2.3E g E2s家族氨基酸序列的分析从G e n e D B和N C B I中下载细粒棘球绦虫基因组数据,并根据克隆测序的情况进行适当修正㊂开放阅读框㊁分子量㊁理论等电点㊁信号肽㊁跨膜区㊁亚细胞定位的预测参照文献[23]所述方法进行㊂1.2.4E g E2s家族蛋白的二级结构和三级结构分析将E g E2s家族的氨基酸序列提交至在线网站(h t t p s:ʊn p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/n p s a_a u t o-m a t.p l p a g e=/N P S A/n p s a_s o p m a.h t m l)预测其二级结构㊂于在线网站(h t t p:ʊw w w.e b i.a c.u k/ i n t e r p r o/)预测E g E2s的活性位点半胱氨酸位置㊂S W I S S-MO D E L在线网站(h t t p s:ʊs w i s s m o d e l.e x-p a s y.o r g/i n t e r a c t i v e)预测其三级结构㊂1.2.5E g E2s家族的多序列比对和系统发育分析通过C l u s t a l O m e g a(h t t p s:ʊw w w.e b i.a c. u k/T o o l s/m s a/c l u s t a l o/)进行E g E2s的多序列比对,手动裁减两端非保守序列㊂从U n i P r o t(h t t p s:ʊw w w.u n i p r o t.o r g/)和N C B I中下载多房棘球绦虫E2s(E c h i n o c o c c u s m u l t i l o c u l a r i s,E m E2s)㊁亚洲带绦虫E2s(T a e n i a a s i a t i c a,T a E2s)㊁曼氏血吸虫E2s(S c h i s t o s o m a m a n s o n i,S m E2s)和秀丽隐杆线虫E2s(C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s,C e E2s)的氨基酸序列㊂利用M E G A7.0软件对其进行多序列比对,T B t o o l s v e r s i o n1.09832自动删除歧义比对的序列以产生140个氨基酸的比对,用于随后的邻接法(N e i g h b o r-j o i n i n g,N J)分析并构建系统进化树,B o o t s t r a p值设置为1000㊂1.2.6E g E2s家族的基因结构和蛋白保守基序分析提取E g E2s基因组序列和编码序列(C o d i n g s e q u e n c e,C D S),将其与E g E2s家族的树文件输入在线网站G S D S(h t t p:ʊg s d s.g a o-l a b.o r g/)进行基因结构图的绘制㊂使用在线网站M E M E v e r s i o n5.3.3(h t t p s:ʊm e m e-s u i t e.o r g/m e m e/t o o l s/m e m e)分析E g E2s 基因家族的保守基序,参数设置:m o t i f最大查找数为7,其他参数为默认值㊂1.2.7 E g E2s的组织特异性表达分析以Z h e n g等[24]测得的细粒棘球绦虫4个发育阶段(成虫㊁六钩蚴㊁原头蚴㊁包囊)的转录组数据为准,获取E g E2s基因的R P KM(R e a d s P e r K i l o b a s e M i l-l i o n)值,用以表示基因的表达丰度㊂为方便统计,对每个表达数值取以2为底数的对数(l o g2),使用T B t o o l s v e r s i o n1.09832绘制基因表达热图㊂1.2.8q R T-P C R检测E g E2s在P S C s㊁28日龄童虫中的转录水平为测定和分析E g E2s在不同发育阶段的转录水平,筛选P S C s阶段特异性表达的E g E2s㊂将E g E2s序列上传至生工生物工程(上海)股份有限公司网站(h t t p s:ʊw w w.s a n g o n.c o m/u s e r L o g i n)设计特异的q R T-P C R引物(表2)㊂B L S A T(h t t p s:ʊb l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/B l a s t.c g i)检查引物是否特异㊂表2E g E2s基因家族q R T-P C R引物T a b l e2q R T-P C R p r i m e r s o f E g E2s g e n e f a m i l y基因名称G e n e n a m e上游引物F(5'ң3')F o r w a r d p r i m e r(5'ң3')下游引物R(5'ң3')R e v e r s e p r i m e r(5'ң3')E g E2R1G T T C C G C T G T C A A G G C T C T T C A G A A C C G C C C T C G T A G A G T G T C T G E g E2G2G G G A T T G T T G C G G G T C C A G T T G A G G C G A A A G T G G G T A G T C A G G A G E g E2G1T G G C A T C C C A A C A T T T C T C C T T C C G C G T T C C T C G G G T C T T T C A T A G C E g E2J2C C C T G T C C T C C T C C C G A A G T G G C C T C T A C C A C C G C C A G T C CE g E2Z T G T G C T T T G A T G C C C A G T G C T C A G G A C C A T T G A T G A C G G C G T A A A C E g E2I C G C T G A T G G C A C T C T T G A C C T C A A A G C C C A C C T T C C C A C A A A G T C E g E2H T G A T G A A G C G T C T G G G A C T G T T T G G G T T C G G A T A G G C C A A G A G T T G A G 80626期杜小迪等:细粒棘球绦虫泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析(续表2 C o n t i n u e d)基因名称G e n e n a m e上游引物F (5'ң3')F o r w a r d p r i m e r (5'ң3')下游引物R (5'ң3')R e v e r s e p r i m e r (5'ң3')E g E 2B A C A G T G T T G C C G C T C A G T T A T A C GT C C C A G C T A T C C T C C A C A C A T G C E g E 2A G C T G A T G G C A C A C C C T T C G C T T T G A C C G T A G G A G G C A A G T T T G G E gE 2S G C T C G G C T G T T C A C T G A G G T T C A G A A T C A C G A A G T G C G G A T G A C G E g E 2N C C C G G A T G A T C C T C T C G C A A A T G C G G A A G T C G G A A G T G T C A C C A A G E g E 2-25A C C A A T G G G C G G C T G C A A T G C A A C G G C G T C C T G T G G A T C A T C E g E 22T G C C G T A T A T G C C A T G C T T T C C T C T C C T C C G T C C C G C T G T C A T T A G E g E 2D 2G G T C G A G A T C C A C C T G C A C A A T G G T C T G A G G G A C C C A T T A T C G T T G C E g E 2-24A C T A C T C T G G T G C C T C T T C T C G T C A T C G T C A A C T T C G G G A C T G C T T T G E g E 2V 2G G G C T T G G C G T C G A G G A A T G G T C C G G T G G C T G A T C C A A C T T A G E g E 2L 3G A T G A A G G A G C C G C C T G T G A A G G G G G A C T G T C A G G G T A A A G G A G A C E g E 2J 1A G A G G A G C C G T C A G G T T G T C G G T C T G C T A C C A C C A C C A C T G T A A C E g G A P DH A C T C C G T C A A T G T T G T C G C T G T C G T C A A T A A C C A A C T T G C C G C C A T C E gE F αT C G C C G T A C T G G T C A G G T C A A GG G A A C T C C G A G A A C A C C T C A A C A C以各阶段虫体c D N A 为模板进行q R T -P C R 扩增,E g G A P DH 和E gE F α作为内参基因进行分析,反应体系及反应条件参考前人所述[21]㊂结果采用ΔΔC t (Q r =2-ΔΔC t)法进行分析㊂1.2.9 E g E 2D 2和E g E2N 的B /T 细胞抗原表位预测 抗原表位的研究对疾病的诊断㊁免疫治疗及疫苗分子结构的设计等具有重要意义㊂细粒棘球绦虫组学文献表明,E g E 2D 2和E g E 2N 通过外泌体[25]/胞外囊泡[26]分泌出去㊂故本研究通过在线网站I D B E (h t t p :ʊt o o l s .i mm u n e e p i t o p e .o r g/m a i n /)和A B C p r e d (h t t p s :ʊw e b s .i i i t d .e d u .i n /r a g h a v a /a b c pr e d /A B C _s u b m i s s i o n .h t m l )对其B /T 细胞抗原表位进行了预测㊂T 细胞抗原表位预测分别选择H L A -A*0201(人类)与D L A -88*50101(犬),%R a n k <0.5%与%R a n k >2%的分别为强结合MH C Ⅰ类分子和弱结合MH C Ⅰ类分子[27]㊂2 结 果2.1 E gE 2s 基因家族的克隆测序结果成功克隆测序了19个E gE 2s 基因,其中E g E 2I 为相扑结合酶(S UMO -c o n j u g a t i n g e n -z y m e ),E g E2V 2为泛素结合酶突变体㊂所有E g E2s 有完整的O R F 框,P C R 结果条带清晰,较为单一(图1),其C D S 序列在350~1600b p 之间㊂E gE 2L 3的C D S 序列与数据库序列相差了12个碱基,E g E 2J 1的C D S 序列与数据库序列两端有差异,本团队向N C B I 重新上传了其C D S 序列,登录号分别为E g E 2L 3:M Z 277618;E gE 2J 1:M Z 277619,且E gE 2J 2的C D S 序列(X M _024496294.1)与N C B I 数据库序列一致㊂1~19.分别为E g E 2R 1㊁E g E 2G 2㊁E g E 2G 1㊁E g E 2J 2㊁E g E 2Z ㊁E g E 2I ㊁E g E 2H ㊁E g E 2C ㊁E g E 2B ㊁E g E 2A ㊁E g E 2S ㊁E gE 2N ㊁E g E 2-25㊁E g E 22㊁E g E 2D 2㊁E g E 2-24㊁E g E 2V 2㊁E g E 2L 3㊁E gE 2J 1;M.基因分子量标准1-19.R e p r e s e n t E g E 2R 1,E g E 2G 2,E g E 2G 1,E g E 2J 2,E g E 2Z ,E g E 2I ,E g E 2H ,E g E 2C ,E g E 2B ,E g E 2A ,E gE 2S ,E g E 2N ,E g E 2-25,E g E 22,E g E 2D 2,E g E 2-24,E g E 2V 2,E g E 2L 3,E g E 2J 1,r e s p e c t i v e l y .M.M a r k e r 图1 E g E 2s 家族基因P C R 结果F i g .1 P C R r e s u l t s o f E g E 2s g e n e f a m i l y9062畜牧兽医学报54卷2.2E g E2s基因家族的序列分析将19个E g E2s的氨基酸序列提交至E x P A S Y 等软件进行蛋白质的长度㊁分子量㊁等电点㊁跨膜区㊁信号肽和活性位点等进行分析(表3)㊂结果显示, E g E2s的C D S序列在354~1605b p之间,氨基酸长度在117~534a a之间,对应的分子量为13.39~57.17k u㊂E g E2s的等电点为4.41~9.06,除了E g E2-25㊁E g E2S㊁E g E2I外,其余蛋白质的等电点均小于7.00㊂信号肽预测显示E g E2s均没有信号肽㊂跨膜位点预测显示,只有E g E2J1和E g E2J2具有跨膜区,分别位于第505~527和214~236位氨基酸㊂E g E2s蛋白大部分位于细胞质和细胞核中;分布于细胞膜的有E g E2L3㊁E g E2J1和E g E2C;分布于内质网的只有E g E2G2㊂使用I n t e r P r o在线网站预测了E g E2s的半胱氨酸活性位点的位置(表3)且标注在了三级结构中(图2)㊂E g E2V2与泛素结合酶在氨基酸序列和结构上高度相似,但其不具有活性位点半胱氨酸,因而缺乏催化活性㊂2.3E g E2s家族蛋白的二级结构和三级结构预测E g E2s家族蛋白二级结构预测(表3)表明: 19个E g E2s蛋白均含有α-螺旋(17.14%~ 51.47%),除E g E2V2和E g E2J1的α-螺旋占比分别为17.14%和28.65%外,其余E g E2s的α-螺旋占比均大于30%㊂E g E2s的β-转角占比在2.61%~6.88%之间,延伸链占比在10.58%~ 21.05%之间,无规则卷曲占比在29.90%~ 58.57%之间㊂三级结构预测显示:19个E g E2s蛋白基本上都含有4个α-螺旋,4个β-折叠,构成了E g E2s家族的保守催化 核心 结构域(U B C结构域)(图2)[28]㊂结合三级结构的预测及相关文献对E2s的分类[29],认为E g E2A㊁E g E2B㊁E g E2D2㊁E g E2G1㊁E g E2G2㊁E g E2I㊁E g E2L3㊁E g E2N㊁E g E22㊁E g E2-24属于C l a s sⅠ,E g E2C㊁E g E2V2属于C l a s sⅡ,E g E2H㊁E g E2J1㊁E g E2J2㊁E g E2R1㊁E g E2S㊁E g E2-25属于C l a s sⅢ㊂2.4E g E2s基因家族的多序列比对和系统进化分析将E g E2s氨基酸序列进行了多序列比对,发现该家族内部的氨基酸序列相似性较低(图3)㊂然而,这并不影响其具有150~200个氨基酸组成的U B C结构域㊂为探究细粒棘球绦虫与其他物种E2s家族的进化关系,本研究下载了多房棘球绦虫E2s(E c h i-n o c o c c u s m u l t i l o c u l a r i s,E m E2s)㊁亚洲带绦虫E2s (T a e n i a a s i a t i c a,T a E2s)㊁曼氏血吸虫E2s (S c h i s t o s o m a m a n s o n i,S m E2s)和秀丽隐杆线虫E2s(C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s,C e E2s)各19㊁11㊁20和16条氨基酸序列㊂根据与曼氏血吸虫E2s蛋白的同源性[30],对细粒棘球绦虫的E2s的名字进行了标注并构建了系统发育树(图4)㊂结果表明,细粒棘球绦虫㊁多房棘球绦虫和曼氏血吸虫的E2s之间亲缘关系较近㊂2.5E g E2s家族基因结构和蛋白保守基序分析为更好地了解E g E2s基因的结构多样性,本研究将E g E2s基因的内含子/外显子排列和保守基序做了比较㊂结果显示,E g E2A和E g E2B只含有1个外显子,且无内含子,E g E22含有2个外显子,其余E g E2s基因都含有3~7个外显子㊂不同E g E2s成员的基因结构差异较大㊂E g E2R1含有下游结构,E g E2I和E g E2C含有上游结构,其他E g E2s无上㊁下游结构(图5)㊂E g E2s家族蛋白的保守基序预测表明(不同颜色的方块表示不同的m o t i f)(图5):该家族蛋白序列含有的保守基序较为一致,大部分E g E2s都含有6个保守基序㊂E g E2s最少,只含有3个㊂2.6E g E2s在4个发育阶段中的表达谱分析从转录组数据提取了19个E g E2s在细粒棘球绦虫4个发育阶段中的基因表达谱㊂结果表明,E g E2s的表达量在不同发育阶段有较大的差异(图6)㊂值得注意的是,E g E2D2在4个发育阶段均呈现出了极高的表达水平㊂E g E2J1和E g E2J2在4个阶段的表达量都较低甚至在六钩蚴(O n c o s p h-e r e s)时期不表达,E g E2A㊁E g E2V2和E g E2L3在六钩蚴时期也不表达㊂同时,E g E2G2在P S C s中不表达㊂2.7q R T-P C R检测E g E2s在P S C s、28日龄童虫中的转录水平以P S C s㊁28日龄童虫的c D N A为模板,对19个E g E2s基因进行q R T-P C R扩增,采用内参基因E g G A P DH㊁E g E Fα的几何平均值进行分析[31],表明E g E2s的转录水平在各个阶段存在差异,其中E g E2A㊁E g E2J1在P S C s阶段相对于28日龄童虫阶段高表达,具有显著的统计学差异(P< 0.001,P<0.01,图7)㊂01626期杜小迪等:细粒棘球绦虫泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析E gE 2s 基因家族的基本信息e 3 B a s i c i n f o r m a t i o n o f E g E 2s g e n e f a m i l y因e起始位点I n i t i a t i o ns i t e 终止位点T e r m i n a t i o n s i t e 外显子数目E x o n c o u n t 开放阅读框/b p O p e n r e a d i n g f r a m e蛋白长度/a aF u l l l e n g t h pr o t e i n 蛋白分子量/k u P r o t e i nm o l e c u l a r w e i gh t 等电点(pI )I s o e l e c t r i c p o i n t 跨膜区(位置)T r a n s m e m b -r a n e d o m a i n 信号肽S i g n a l p e p t i d e 亚细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n α-螺旋/%α-h e l i x β-转角/%β-t u r n 延伸链/%E x t e n s i o n c h a i n 无规则卷曲/%R a n d o n c o i l活性位点(C ys )位置A c t i v e s i t e E 2R 121875362189181483127631.354.46C 40.586.8815.5836.9697E 2G 2164344166766551917219.014.60E ㊁N 32.566.4016.8644.1989E 2G 151831965183852450716819.104.79C ㊁N 34.524.7615.4845.2490E 2J 222251812226888372324026.496.43+(214-236) C35.835.0016.2542.9293E 2Z 64768506477735373824527.335.30C40.003.6714.2942.04109E 2I 29971112997713464221324.568.31 N36.153.2911.7448.83145E 2H 1109639511099760655518420.664.41C41.304.3516.8537.5087E 2C 17139131716147335411713.396.82C ㊁N ㊁C M34.195.1317.9542.7455E 2B 90821039082564146215317.304.62C38.562.6116.9941.8387E 2A 14564991456975147715817.864.74C ㊁N36.083.1618.3542.4188E 2S 54130435413788461520422.889.06C 51.474.9013.7329.9092E 2N 3996240697448616118.306.83C ㊁N39.754.9716.7738.5188E 2-2543468694349644571723826.317.74C 49.583.3614.7132.35131E 22695442469559942125141647.516.53C ㊁N40.383.8510.5845.19335E 2D 2179390180021544414716.646.39N37.414.7617.6940.1485E 2-24849313851005575325027.276.06N36.804.0012.8046.40134E 2V 243613094363991442314015.695.06C ㊁N 17.143.5720.7158.57E 2L 363053296307138445915217.186.83C ㊁N ㊁C M 36.183.2921.0539.4787E 2J 174005784987160553457.175.38+(505-527) C ㊁N ㊁C M28.652.6214.0454.6890胞质;N .细胞核;C M .细胞膜;E .内质网y t o p l a s m ;N .N u c l e u s ;C M .C e l l m e m b r a n e ;E .E n d o pl a s m i c r e t i c u l u m 1162畜 牧 兽 医 学 报54卷方框圈注为活性位点位置T h e b o x i s t h e p o s i t i o n o f a c t i v e s i t e 图2 E g E 2s 三级结构预测F i g.2 T h e t h r e e d i m e n s i o n a l (3D )s t r u c t u r e s o f E g E 2s 不同颜色矩形中的氨基酸序列对应图5的保守基序T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e s i n d i f f e r e n t c o l o r r e c t a n g l e s c o r r e s p o n d t o t h e c o n s e r v e d m o t i f s i n F i g .5图3 E g E 2s 氨基酸序列比对F i g .3 A l i g n m e n t o f E g E 2s a m i n o a c i d s e qu e n c e s 21626期杜小迪等:细粒棘球绦虫泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析图4 E g E2s 的系统进化树(N J 树)F i g .4 P h y l o g e n e t i c t r e e o f E g E 2s (N e i g h b o r -j o i n i n g,N J)图5 E g E2s 基因结构和保守基序F i g.5 G e n e s t r u c t u r e a n d c o n s e r v e d m o t i f s o f E g E 2s 2.8 E g E 2D 2和E gE 2N 的B /T 细胞抗原表位预测将A B C pr e d 预测阈值>0.8[32]与I E D B 预测的氨基酸序列区域整合后确定为最终E g E 2D 2㊁E g E2N 的优势B 细胞抗原表位区域分别为:38-54㊁59-63㊁70-86㊁114-119㊁129-137;14-21㊁36-48㊁57-65㊁117-122㊁139-157㊂I E D B 预测E g E 2D 2㊁E g E2N 与人MH C Ⅰ类分子强结合的位点分别为:91-99(0.52%);58-663162畜牧兽医学报54卷(0.07%)㊁104-113(0.34%)㊂E g E2D2㊁E g E2N与犬MH CⅠ类分子强结合的位点分别为:5-13 (0.38%);8-16(0.09%)㊁104-113(0.35%)㊂图6E g E2s在4个发育阶段中的表达谱F i g.6E x p r e s s i o n p r o f i l e o f E g E2s i n f o u r d e v e l o p m e n t a l s t a g e s3讨论在N C B I和D B数据库中各提取到22条[24]和19条[30]E g E2s序列,通过D N AMA N进行序列比对后整合为22条E g E2s序列㊂在本研究中,对E g E2-17㊁E g E2F㊁E g U B C12更换引物多次均未能克隆出正确序列,这可能是因为二代测序技术本身的缺点,即P C R扩增前后的D N A会发生相对频率和丰度的改变,且该技术难以检测变异的碱基,从而影响了测序结果的准确性[33];且不能完全避免序列的拼接错误㊂因此,根据研究需求组合多种测序技术[34]以及运用多种识别错误拼接的方法[35]对提高序列的准确性是有必要的㊂泛素结合酶是泛素蛋白酶体系统的核心,它决定了靶蛋白的泛素连接类型而影响靶蛋白的生物学活性[36]㊂有研究表明癌细胞中高表达的E2s活跃调节各个信号通路,从而认为这些E2s可能为潜在的癌症诊断标志物[37]和治疗靶点[38],例如:抑制人肺癌细胞的E2D可稳定p53,从而促进肺癌细胞凋亡[39];E2D2通过修饰T R A F2/5以及IκBα参与N F-κB信号的传递,从而调节炎症反应和免疫应答[4]㊂本研究表明,E g E2s拥有与哺乳动物相似的U B C结构域和活性位点,在细粒棘球绦虫的4个发育阶段中E g E2D2均呈现出了极高的表达水平,说明E g E2D2可能在细粒棘球绦虫各个生长发育阶段起着抗凋亡的功能,还可能参与了抵抗宿主免疫反应的调节㊂仅有的几项寄生虫E2s功能研究表明,旋毛虫E2L3被分泌到宿主成肌细胞,影响宿主的泛素蛋白酶体系统,从而有利于寄生虫的生存[40];阿米巴原虫E2G2的失活显著抑制其噬红细胞功能[41];布氏锥虫E2R1的失活导致胞质分裂受阻而影响其在小鼠体内的生存[42]㊂这说明,目前寄生虫E2s的功能研究主要集中在其如何促进寄生虫在宿主体内生存,推测E g E2D2的功能也是如此㊂P l a t t s等[43]表明,泛素蛋白酶体系统的组成部分是畸精症患者精子中差异表达较强的部分㊂E2A 的突变或缺乏主要与X连锁智力障碍有关[44],而敲除E2J1使雄性小鼠精细胞胞质去除不完全,影响成熟精子细胞向生精小管腔的释放而导致不育,且E2J2不能弥补这种效应[45]㊂本研究发现,E g E2A 和E g E2J1在P S C s时期的转录水平相对于28日龄童虫高表达,且有显著性差异㊂因此推测, E g E2A和E g E2J1在原头蚴生长发育中可能有重要作用㊂寄生虫病仍是发展中国家亟待解决的公共卫生问题,尤其是我国西部地区,犬的放养及其感染后无明显临床表现使其成为细粒棘球绦虫传播的重要原因[46]㊂目前,预防包虫病较好的疫苗源于细粒棘球绦虫(G1型)的E G95基因工程亚单位疫苗,由于其对G6/G7型的交叉保护作用减少或消失[47],且免疫中间宿主的人力和时间消耗较大,研制预防终末宿主感染的疫苗迫在眉睫㊂反向疫苗学缩短了疫苗开发的时间和成本,其第一步是通过基因组信息寻找优势抗原表位[48]㊂因此,本研究通过B细胞抗原表位预测发现,E g E2N的139-157区域位于E g E2s 保守区域外㊂同时,E g E2N的T细胞抗原表位预测对人和犬MH CⅠ类分子各有2个强结合位点,且有一个共同的抗原表位位点104-113,二级结构显示β转角和无规则卷曲的比例达到45%,表明这两段区域可能是药物研究和疫苗开发的靶序列[49]㊂4结论基于细粒棘球绦虫基因组数据,本研究在细粒41626期杜小迪等:细粒棘球绦虫泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析n s.差异不显著;*.P<0.05;**.P<0.01;***㊁****.P<0.001n s.N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e;*.P<0.05;**.P<0.01;***,****.P<0.001图7E g E2s在不同发育阶段的转录水平F i g.7T r a n s c r i p t i o n l e v e l s o f E g E2s a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s棘球绦虫中成功克隆并测序19个E g E2s基因,更正了两个原序列有误的E g E2s,登录号分别为E g E2L3:M Z277618;E g E2J1:M Z277619㊂三级结构和保守基序预测结果表明E g E2s高度保守㊂q R T-P C R结果显示E g E2s的转录水平在P S C s和28日龄童虫中存在差异,其中E g E2A㊁E g E2J1在P S C s阶段高表达㊂B细胞抗原表位预测表明E g E2N的139-157区域位于E g E2s保守基序外㊂同时,T细胞抗原表位预测表明E g E2N与人和犬MH CⅠ类分子各有两个强结合位点,且有一个共同的抗原表位位点104-113㊂综上,E g E2A和E g E2J1可能在P S C s的生长发育中起重要作用㊂E g E2N的139-157和104-113区域可能是药物研究和疫苗开发的靶序列㊂本研究将为细粒棘球绦虫的生长发育和疫苗研发提供新的思路㊁新的方向㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E P L A Z E S P,R I N A L D I L,A L V A R E Z R O J A S CA,e t a l.G l o b a l d i s t r i b u t i o n o f a l v e o l a r a n d c y s t i ce c h i n o c o c c o s i s[J].A d v P a r a s i t o l,2017,95:315-493.5162畜牧兽医学报54卷[2] A G U D E L O H I G U I T A N I,B R U N E T T I E,M C C L O S K E Y C.C y s t i c e c h i n o c o c c o s i s[J].J C l i nM i c r o b 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细粒棘球绦虫课件
一、形態
1.成蟲
2.蟲卵：與豬帶絛蟲相似 3.幼蟲（棘球蚴）：
棘球蚴 hydatid
cyst
角皮層 囊壁
生髮層（胚層）： 原頭蚴 (原頭節） 生髮囊（育囊） 內含物 子囊 孫囊 棘球蚴砂 囊液
棘球蚴砂(hydatid sand)：
從胚層上脫落的原頭蚴、生髮囊、子囊 碎片等懸浮在囊液中。
成蟲
ABC-ELISA、doc-ELISA
綜合診斷，忌穿刺！
五、流行防治
（一）流行
1.特點：地方性；職業性； 2.傳染源、傳播途徑和易感人群：
人由於接觸犬、剪羊毛、擠羊奶、 加工皮毛，食入污染的食物而感染
（二）防 治
1.宣傳教育，防病從口入 2.定期給犬驅蟲,以免牧草、水源污染 3.嚴格處理病畜屍體、內臟並根除以
三、致 病
（一）致病機理
1.機械壓迫(主要損害)——引起組織 萎縮壞死 2.變態反應:棘球蚴內含物溢出致過 敏反應 3.繼發性棘球蚴感染
（二）常見臨床症狀
1.肝棘球蚴病 若破裂： 過敏性休克
2.肺棘球蚴病
3.顱腦棘球蚴病 4.骨棘球蚴病 5.眼棘球蚴病
四、診 斷
• 詢問病史：犬、羊等接觸史 • X線、B超、CT、同位素掃描 • 免疫診斷：ELISA、IHAT動物內Leabharlann 喂犬治療：外科手術 阿苯達唑
犬、狼小腸上段
二、生活史
被食肉動物食入
棘球蚴
到達肝、肺、 腹腔、脾、腦
犬羊污染水源、牧草
孕節（蟲卵）
隨糞排出
被食草動物食入
六鉤蚴
污染水源、食物，被人食入
隨血流
六鉤蚴
棘球蚴
要點
1.終宿主：食肉動物 中間宿主：食草動物、人
细粒棘球绦虫成虫基因表达谱分析及抗包虫药物筛选
细粒棘球绦虫成虫基因表达谱分析及抗包虫药物筛选研究背景：包虫病(Echinococcosis)是由棘球绦虫(Echinococcus)后绦幼虫棘球蚴寄生于人体或宿主动物而引起的严重疾病。
我国是包虫病发病率较高的国家,同时有囊型和泡型两种类型的包虫病。
阿苯达唑是目前临床应用最广泛的抗包虫病药物,但是该药肠道吸收率差,其只能抑制寄生虫生长,而不能有效杀灭寄生虫,患者必须长期大量服用该药物才能达到治疗效果。
临床研究发现其平均治愈率仅有30%,并且该药可引起多系统的严重药物不良反应(serious adverse drug reactions, SADR),如脑炎综合征(急性脱髓鞘脑炎)、消化功能紊乱、急性肝损伤、癫痫、溶血性贫血、肾衰、过敏性休克、严重药疹等。
另外,持续几十年的使用,包虫对阿苯达唑产生耐药性的问题也愈来愈严重。
因此,寻找或开发疗效显著且副作用小的包虫病治疗新药物具有重大的意义,是当务之急。
新的治疗药物的研制有赖于对寄生虫虫体生物学的全面解析。
目前,细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, E.granulosus)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis, E.multilocularis)全基因组测序工作已经完成,另外Genbank (NCBI)数据库中亦包含了多条来源于E.granulosus和E.multilocularis原头节和生发层组织的表达序列标签(Expressed Squence Tag, EST)。
包虫基因组学和功能基因组研究为完全解析虫体的生物学特性奠定了基础,同时也加快了寻找或开发新的抗包虫病药物的进程。
在包虫生活史中,通过人为阻断或抑制虫卵入侵至虫卵成熟之间的任何发育阶段,都具有控制或减轻病情和阻断传播的实际意义,包虫生活史的各个阶段,如虫卵、幼虫、成虫等均可作为包虫病药物作用的靶标。
吕刚等人构建了E.granulosus成虫全长cDNA质粒文库,这为开展对E.granulosus成虫阶段基因的研究和筛选、分离、鉴定E.granulosus生长发育关键分子及潜在药物靶点奠定了基础。
细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达谱分析
细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达谱分析
王正荣1，薄新文1*，张艳艳1，马 勋1,2，王智欣1,3，卢平萍1,2
2.College of Anim al Science and Technology ,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 3. C ollege of Veterinary Medicine,China Agricultural University,B eijing 100193,China）
原头蚴顶突的小刺以及散在的细胞中，同时其相对转录量在体外培养0～10d的过程中呈递减趋势。综上，本研究
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
解析了细粒棘球绦虫原头蚴的蛋白质表达元件，揭示了原头蚴主要的调控信号通路，为虫体的生长发育机制以及
包虫病的有效防控提供了理论依据。
关键词：细粒棘球绦虫；原头蚴；蛋白；表达谱；信号通路
中图分类号：S852.734
示虫体的发育调控、筛选疫苗以及药物靶标奠定基础。本试验采用LC-MS/M S技术对虫体原头蚴表达的蛋白质
进行研究，然后对获得数据进行GO、KOG以及KEGG 等分析；最后采用qRT-PCR 和原位杂交技术对鉴定得到的
W nt信号通路的关键基因β-catenin进行了差异表达和组织定位研究。结果显示，本研究共鉴定得到7172个肽
常规的Bradford定量方法定量总蛋白质。 1.2.3 LC-MS/MS质谱检测与数据处理 将样
w w w /）公开的操作方法以及相关文 献提供的方法[21-23]进行。主要包括以下步骤：（1）
细粒棘球绦虫ppt课件
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四、实验诊断
（一）病原学诊断 手术取出棘球蚴可确诊，或从痰、胸腔积 液等检获棘球蚴碎片或原头蚴等。 （二）询问病史及 X 线、 B 超、 CT、MR（核 共振）等物理诊断方法作辅助诊断。 （三）免疫学诊断可作为辅助诊断。
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五、流行
（一）分布 呈世界性分布，在自然界中主要在食肉动物 如犬、狼和食草动物如牛、羊等之间传播， 有自然疫源性特点，主要流行于牧区。
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棘球蚴寄生于脑
棘球蚴
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动物腹腔中的棘球蚴
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棘球蚴
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角质层
生发层 生发囊
棘球蚴
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母囊与子囊
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（三）虫卵 形态与猪带绦虫和牛带绦虫卵在显微镜下 难以区别。
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二、生活史
中间宿主：主要是羊、牛等食草动物，人也 可受感染，棘球蚴寄生于肝、肺等内脏。 终宿主：主要是犬、狼等食肉动物，成虫寄 生于小肠上段。
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三、致病机制与临床表现
人因棘球蚴的寄生而患棘球蚴病 ( 包虫病 ) 。 致病作用以机械性压迫和占位性损伤为主， 以肝损害为多见。有的可出现过敏反应， 若囊壁破裂，囊液溢出，可引起过敏性休 克，甚至死亡。
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棘球蚴病的临床表现： 1.局部压迫和刺激症状 2.过敏症状、中毒和胃肠功能紊乱 3.继发性感染：由棘球蚴囊破裂引起
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成虫寄生于终宿主的小肠上段，其孕节或虫 卵随粪便排出体外，污染牧草等。 中间宿主吞食后，在小肠中孵出六钩蚴，后 者钻入肠壁血管，经血流到达肝、肺等器官， 约经3～5个月后发育成棘球蚴。 终宿主若吞食了棘球蚴，其每个原头蚴都可 在小肠中发育成一条成虫。
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