细胞总蛋白的制备, SDS-PAGE,Western Blot
Western-blot实验操作步骤
Western-blot实验操作步骤Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
1.配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
SDS-PAGE及Western Blot简明操作指南
SDS-PAGE及Western Blot简明操作指南一．蛋白样品制备✓推荐使用RIPA裂解液。
一般使用强裂解液，对于coIP可用弱裂解液。
1.准备工作：1)取足量裂解液，加入PMSF和（或）蛋白酶抑制剂；若要检测蛋白磷酸化，推荐加入磷酸酶抑制剂。
置于冰上预冷。
2)准备足量PBS，置于冰上预冷。
3)提前打开离心机预冷至4度。
2.裂解样品：（注意保持样品处于冰上，4度离心）1)动物组织：取1g左右置入离心管，加入配制好的裂解液0.5-1ml，置于冰上，用匀浆器充分匀浆；2)悬浮细胞：以6孔板的一个孔为例（面积约10平方cm）；300g离心10分钟，去除培养基，收集细胞；1ml 预冷的PBS重悬后，转移到1.5ml离心管中，300g离心10分钟，去除上清；加入60-200ul裂解液重悬细胞，置于冰上，裂解5-10分钟；裂解期间，每隔一分钟使用涡旋仪震荡5秒或使用移液器吹打5秒。
3)贴壁细胞：以6孔板的一个孔为例（面积约10平方cm）；去除培养基，用1ml PBS洗涤细胞；去除PBS，加入60-200ul裂解液，置于冰上，裂解2-3分钟；用细胞铲刮掉细胞，用移液器转移到1.5ml离心管中；置于冰上，裂解5-10分钟，裂解期间，每隔一分钟使用涡旋仪震荡5秒或使用移液器吹打5秒。
3.收集蛋白：1)将上述裂解样品于4度10000g离心10-20分钟，转移上清至一新的离心管，此即为蛋白样品。
此处样品可于-20或-80度长期保存。
4.蛋白的相对定量：BCA法✓为保证各样品western上样蛋白量一致，须定量蛋白；推荐相对定量；绝对定量需要在本方法基础上额外做BSA标准曲线。
✓备注：每个蛋白要做2个重复，blank对照须使用步骤2中的裂解液。
1)参考说明书，配制足量BCA工作液（多配制10%，以免不足）；2)取一96孔酶标板，在要用到的孔中加入上述BCA工作液，每孔100ul;3)在上述孔中分别加入1-2ul各蛋白样品及blank对照；4)将酶标板于37度孵育10-30分钟，直到出现较明显颜色变化即可；5)测定吸光度；6)计算相对蛋白含量：各吸光度去除blank背景，以吸光度最低者为参考，进行归一化处理，即计算吸光度倍数关系；western上样时，须依据此倍数关系调整各样品上样体积，以保证各样品上样蛋白量一致。
Western Blot
Western Blot (蛋白质印迹)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
WB采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
具体步骤如下：一、蛋白样品的制备贴壁细胞总蛋白的提取: 首先弃尽培养液，以4℃的PBS（pH7.2-7.3）清洗细胞三次，再加入RIPA裂解液（PMSF须现加），来回摇晃数次，裂解持续30min，裂解结束后，用刮棒将细胞置于一侧，用移液枪将细胞和裂解液一并吸入离心管中。
（此前的过程均须在冰上进行）于4℃下12000rpm离心5 min，上清转移放于-20℃保存。
组织中总蛋白的提取：将组织尽量剪碎，拌匀，加入RIPA裂解液（PMSF须现加），混匀后置于冰上。
裂解30 min后用移液枪转移入离心管，于4℃下12000 rpm离心5 min，上清转移放于-20℃保存。
二、蛋白含量的测定（Bradford法）考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
实验记录-Western-Blot之蛋白的提取与定量
细胞蛋白的提取与测定蛋白提取原理：蛋白质是一切生命活动的承担者，为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究，进一步阐明众多疾病的机制，同时为疾病治疗提供理论依据，因此需要提取目的蛋白，由于蛋白质种类繁多，结构复杂，需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。
一、贴壁细胞蛋白的提取：（所有操作均在冰上进行）准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用1.裂解液制备：每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白，使其免于被蛋白酶降解），配好后冰上备用；2.此处以6孔板为例，吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液，清洗 2-3次，吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）；3.加入适当体积的裂解液，让裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min；4.裂解完成后，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞及裂解液吸入离心管，放离心机4℃12000rpm 离心30min（离心机提前预冷），上清即为蛋白溶液，细胞碎片沉降于底部；5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA 定量分析；c.做western blot，需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同，例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。
二、组织中总蛋白的提取：1.将已称重的冷冻组织（约50g）放入预冷好的研钵中，用研杵快速研磨组织，（有的需要加入液氮），直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）；2.裂解液制备：取250ulRIPA裂解液+2.5ul 100mmol/L蛋白酶抑制剂+2.5ul蛋白酶抑制剂复合物Cocktail(多种小分子组成的抑制剂混合物能更好的保护蛋白不被蛋白酶降解)；3.取适量研磨的匀浆放入离心管，加入配好的裂解液，冰上孵育40min；4.离心：4℃ 12000rpm 离心15min 保留上清；5.将蛋白溶液防止于-20℃保存（长期保存放于-80℃）。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。
2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。
共洗三次，每次十分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。
（可不做）5、4℃，12000转离心10min。
6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。
（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。
冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。
2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。
4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。
5、37℃水浴30min。
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。
7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
（三）SDS-PAGE电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
蛋白提取及Western blot 原理及步骤
蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。
方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。
5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。
Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。
WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
western bloting 全攻略
Western Blotting 实验流程基本操作流程：提取细胞或组织蛋白、测定大致含量↓制备SDS-PAGE胶↓蛋白样品变性、电泳↓电泳转膜↓封闭（1小时）↓一抗(3小时左右或4度过夜)↓TBST洗涤（洗三遍）↓HRP标记的二抗（1小时）↓TBST洗涤（洗四遍）↓ECL试剂作用↓X-光片曝光、显影↓结果分析详细操作流程1.试剂配制与订购1.1 .SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X)（公司：全式金）1.2 SDS-PAGE凝胶配制1M Tris-HCl （pH6.8）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至6.8（约14ml），定容至200ml，121oC 20min灭菌，室温保存。
1M Tris-HCl （pH8.0）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至8.0（约8.4ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保存。
1.5M Tris-HCl （pH8.8）:称取36.34g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至8.8（约5ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保存。
10%（W/V）SDS:称取50gSDS，加400ml dd H2O，68℃加热溶解。
滴加浓HCl调节pH 值至7.2，定容至500ml，室温保存。
30%（W/V）Acrylamide:称取29g Acrylamide，1g N，N’-至甲双丙烯酰胺（BIS），加dd H 2O溶解，定容至100ml，用0.45m滤膜滤去杂质，4℃避光保存。
0.02M PH 7.2 PBS：称取Na2HPO4·12H2O 5.8g，NaH2PO4·2H2O 0.59g，NaCl 8.5g，定溶至1000ml蒸馏水中。
10%（W/V）过硫酸铵:称取0.1g过硫酸铵，加1ml dd H2O 充分溶解，4℃保存（有效期约为两周）。
免疫荧光、SDS-PAGE、Western-blot实验技术
小心仔细。
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10-43
12
12-60
10
20-80
8
30-90
操作步骤：采用垂直式电泳槽装置
配制分离胶(12%)（1.0mM的玻璃板）
ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶 1.5M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED
3.3ml 4.0ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 4.0μlห้องสมุดไป่ตู้
三、Western blotting
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的 方法，称为Southern印迹法。
间接法
1.固定 2.通透（选做） 3.封闭（选做） 4.一抗孵育 5.荧光二抗孵育 每步都需要PBS或PBST洗涤3次，每次5分钟。
补体法
利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分 子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯 基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋 白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同 密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用 考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。 因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表
Western blot具体实验操作步骤
一、提取总蛋白1.将皿中上清吸光后，用外用PBS将皿洗3遍，最后一遍将皿内液体吸光（否则会降低蛋白浓度）。
（亦可先将带有PBS的细胞刮入1.5ml EP管，离心后弃去上清）2.配制裂解液:1ml RIPA裂解液（4度冰箱棕瓶）(0.5M Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1%NP40, 0.5% 去氧胆酸钠, 0.1%SDS)加入5μl PMSF（-20度冰柜内矩形盒小管内）(蛋白酶抑制剂，防蛋白降解).根据皿中细胞团块大小加入100-300μl裂解液, 4℃摇床30min3.皿中液体吸至1.5mlEP管，离心机预冷后， 4℃，12000×g（RCF），离心15min后取上清(装于500μlEP管)（可分装后-20℃保存）。
二、BCA蛋白浓度测定1.按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；2.完全溶解蛋白标准品（存于-20℃冰箱第一抽屉），取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml；3.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的标准品孔中，用专用生理盐水补足到20微升;4.加1μL样品到96孔板的样品空中，加生理盐水19微升;5.各孔加入200微升BCA工作液，37℃孵箱放置30分钟;6. 570nm波长测定蛋白。
根据标准曲线计算出蛋白浓度EXCEL详细过程：标曲：上一行吸光度，下一行浓度（0，0.5，1，2，4，6，8，10），以此作标曲，标曲相关系数须达两个9，以这次的样品为例，算得两样品浓度分别为4.09和5.26 因为须上样100μg，所以算得须上样的蛋白体积=100/4.09=24.5μL所以上样须补水30-24.5=5.5μL及βme：6×SDS（2：3）为10μL现此样品蛋白体积足够煮10份，即按照245μL蛋白样品+55μL水+100μLβme：SDS（2：3）来配注意：SDS很粘，须涡旋再低速离心，使用枪时须慢吸三、煮蛋白：加样配制: 总体积:40μL（含蛋白液与dH2O混合物30μL+β-meSDS10μL）1.β-巯基乙醇（β-me）：6×SDS（2：3）样品缓冲液10μL2.蛋白取量取一组蛋白中,样品蛋白加的体积=蛋白浓度最低的浓度*30μL/每个样品浓度3.剩余的体积即30μL-样品蛋白加的体积，即为各管需补加水的体积4.多加一点防煮时蒸发部分混和后file22-start100℃煮沸5 min。
Western_Blot过程步骤详解
做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．蛋白提取：１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。
每次30秒,重复3-5次.（2）离心机1000rpm，4℃离心10min 后，所得上清液转入超速离心管。
(去掉大块组织及结缔组织)（3）100000g，4℃离心1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可)。
沉淀用适量的Buffer B重悬，4度过夜后，分装至EP管，Eppendorf 台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
（4）收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。
westernblot煮蛋白要点
westernblot煮蛋白要点Western blot煮蛋白是一种常用的蛋白质检测技术，通过分离蛋白质、转移到膜上、染色等步骤，可以检测特定蛋白质在混合蛋白质中的存在和表达水平。
下面将详细介绍Western blot煮蛋白的要点。
第一要点：样品制备在进行Western blot煮蛋白实验前，首先需要提取蛋白质样品。
常用的方法包括细胞裂解液裂解、组织研磨、血清、尿液等来源的蛋白质提取。
在提取过程中需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性和活性。
第二要点：SDS-PAGE电泳提取的蛋白质样品需要进行SDS-PAGE电泳分离。
SDS-PAGE电泳是一种以聚丙烯酰胺凝胶为分离介质，通过电场作用将蛋白质按照大小分离的方法。
在电泳过程中，蛋白质会从凝胶上向下迁移，最终形成蛋白质条带。
第三要点：转印完成SDS-PAGE电泳后，需要将分离的蛋白质转移到膜上。
这个步骤称为电泳转印。
常用的转印方法有湿式转印和半湿式转印。
转印过程中，蛋白质会被转移到膜上并固定在上面，为后续的染色和检测提供条件。
第四要点：染色转印完成后，需要对膜上的蛋白质进行染色。
染色可以选择各种染色剂，如Ponceau S染色、Coomassie蓝染色或银染色。
染色后的膜上会出现蛋白质条带，可以根据条带的位置和强度进行进一步的分析。
第五要点：免疫检测Western blot的关键步骤是免疫检测。
在此步骤中，需要将膜与特异性抗体反应，通过抗体与蛋白质的结合来检测特定蛋白质的存在和表达水平。
免疫检测的结果可以通过化学发光或荧光等方法来观察和记录。
第六要点：数据分析最后一步是数据分析。
通过Western blot的结果，可以得到目标蛋白质的表达水平和其他相关信息。
通过比较不同样品之间的差异，可以得出结论并进行进一步的实验设计和研究。
总结：Western blot煮蛋白作为一种常用的蛋白质检测技术，具有高灵敏度和特异性，广泛应用于生物医学研究中。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
提取细胞总蛋白的原理
提取细胞总蛋白的原理细胞总蛋白是指在细胞裂解液中含有的所有蛋白质的总和。
提取细胞总蛋白是生物学研究中非常基础且重要的实验操作，可以用于研究细胞生物学、分子生物学和生物化学等多个领域。
下面我将详细介绍细胞总蛋白提取的原理及其步骤。
细胞总蛋白提取的原理：细胞总蛋白提取的原理主要基于细胞膜的破裂和蛋白质的释放。
细胞膜是由脂质双层和蛋白质组成的，通过物理（如超声波、剪切力等）或化学（如洗涤剂、酸碱溶液等）方法可以破坏细胞膜的完整性，使细胞内的蛋白质释放到溶液中。
细胞总蛋白提取的具体步骤：1. 细胞培养和收获：首先需要选择合适的细胞种类，并将其培养在培养基中。
当细胞达到一定数量和生长状态时，使用适当的方法将细胞收获到离心管中。
2. 细胞裂解：将收获的细胞沉积物加入适量的细胞裂解缓冲液中，并进行细胞的破碎和破裂。
可以使用物理方法如超声波震荡、剪切力等，也可以使用化学方法如洗涤剂（如Triton X-100、NP-40等）或酸碱溶液来破坏细胞膜。
3. 离心：在细胞裂解液中存在着细胞碎片、细胞器和细胞核碎片等杂质。
通过高速离心将这些不溶性物质沉淀下来，得到澄清的上清液。
4. 蛋白质沉淀：将上清液中的蛋白质沉淀下来，有多种方法可以进行，如酒精沉淀法、醋酸沉淀法、盐析法等。
通常情况下，使用酒精沉淀法可以得到较高的蛋白质纯度。
5. 脱脂：将蛋白质沉淀通过洗涤去除各种杂质和溶解剂，以净化蛋白质。
6. 干燥：蛋白质沉淀溶于适量的蛋白溶液中，并将其沉淀沉淀，通过气体吹干或真空干燥的方法干燥蛋白质。
7. 储存：将干燥的细胞总蛋白保存在低温（-20或-80）条件下，以防止蛋白质的降解和氧化。
细胞总蛋白提取的注意事项：1. 在进行细胞裂解时，要选择适当的条件和方法，以保证细胞膜的完整性破裂，并确保蛋白质的完整释放。
2. 在提取过程中要避免发生蛋白质的降解和氧化，可以添加蛋白酶抑制剂和抗氧化剂等。
3. 在细胞提取过程中要注意无菌操作，避免细菌或其他污染物的存在。
细胞总蛋白的制备, SDS-PAGE,Western Blot
医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。
蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。
血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。
细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。
膜蛋白的抽提比较复杂。
膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。
外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。
固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。
在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。
较为理想的增溶剂是去垢剂。
目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。
增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。
纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。
抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。
主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。
常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。
2. Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
Western Blot免疫沉淀
Western Blot/免疫沉淀
Western Blot检测
Western免疫印迹 (Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
实验操作
1、蛋白提取和变性
总蛋白的提取：①细胞样品用PBS清洗，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10min，用细胞刮刮下全蛋白裂解液，收集于离心管；②组织样品用液氮研磨成粉末，加裂解液（含蛋白酶抑制剂）并超声破碎，注意要在冰上进行。
然后12000转，10分钟，4度，离心取上清。
蛋白样品各50μg和5X SDS上样缓冲液混匀后,100℃沸水煮5min。
2、Western Blot步骤
1 胶的制作：制备12%分离胶和4%积层胶；
2 点样：微量加样器上样量：20μg总蛋白；
3 电泳：电泳槽与电源正负极相连，浓缩胶60V电泳30min，分离胶100V电泳70min；
4 转膜：电泳结束后后进行转膜，低温稳流，300mA转100min；
5 封闭：5%BSA/TBST室温，摇床缓慢摇动，封闭60min；
6 一抗孵育：按一定的稀释度稀释抗体，4℃孵育过夜；
7 TBST漂洗三次，每次10min；
8 二抗孵育：使用对应一抗来源的第二抗体孵育，室温120min；
9 TBST漂洗三次，每次10min；
10 ECL检测，暗室曝光10sec至10min，立即以KODAK显影液和定影液，冲洗胶片；
11 结果以培清凝胶成像分析系统拍照分析；。
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医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1.掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1.蛋白质提取常见裂解方法极其原理。
蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。
血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。
细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。
膜蛋白的抽提比较复杂。
膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。
外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。
固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。
在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。
较为理想的增溶剂是去垢剂。
目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。
增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。
纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。
抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。
主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。
常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。
2.Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。
4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
5. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。
由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
（1）浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。
当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。
由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。
电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。
这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。
（2）电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
（3）分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。
图1电泳操作示意图表1凝胶浓度与蛋白质分离范围的相关联系。
6. 转膜(半干转移)法蛋白质带负电，电场中会向正极移动，而PVDF膜在凝胶和正极之间，将蛋白质拦截在膜上，PVDF膜可以牢固吸附蛋白质，使蛋白质保留在膜上。
将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间：－|纸|胶|膜|纸|＋，如图2所示。
图2转膜(半干转移)法示意图三、实验步骤1. 制胶:玻璃板上做好标记（加样孔位置和分离胶位置）→配制分离胶溶液，一旦加入TEMEM就立即灌胶，上加水饱和正丁醇，待凝→弃去正丁醇，蒸馏水冲洗，滤纸吸干多余水分→配制浓缩胶溶液并灌胶，插梳子，待凝→取下制胶器，插入电泳槽中，上槽加电泳缓冲液，没过小玻璃板，下槽加一半量的电泳缓冲液（TGS），拔梳子2. 细胞总蛋白的制备：收集1管细胞，3000rpm 离心5分钟弃上清，沉淀以10mLPBS垂悬洗涤，同上离心，再次以1mLPBS垂悬沉淀并移入1.5mL离心管，再次离心，弃上清→加入5倍体积的4%SDS溶液垂悬，用枪吹打搅匀，沸水浴中加热5分钟→以黄色枪头反复吹打搅匀数十次，以使溶液不再粘稠，10000rpm离心10min→准备2个EP管，分别取上清液15μL，加入5μL 4×上样缓冲液，混匀后沸水加热3分钟，冷却到室温，混匀并短暂离心即可用于上样。
3. 转膜：准备好2.5 ×7cm大小的厚滤纸2张和膜1张，其中膜先用甲醇处理2~3分钟，再浸泡于转移缓冲液中→取下胶，滴加转移缓冲液以起到固定作用，切取相应大小的胶，浸泡于转移缓冲液中平衡15min→转膜条件：200mA，1h；稳流：0.8mA/cm2膜面积。
4. 封闭保存：转移结束，取下胶和膜，胶置于染液中染色；膜做好标记，封闭液中保存于4℃冰箱。
5. 考马斯亮蓝染液检查条带情况：凝胶放入考马斯亮蓝染液中，加盖，在摇床上染色2小时以上→弃染液（可回收重复用），换脱色液慢摇，脱色液变成蓝色的时候更换新的脱色液。
直到凝胶背景无色，蛋白质条带呈清楚的蓝色为止。
6. 抗原抗体反应以及膜的反应性检测：4 ℃封闭过夜，取出预温至室温→将兔抗人c-Myc单抗2.0ml（用封闭液1:1000稀释）加入塑料袋，放入PVDF膜，赶走气泡，用封口机封口，室温平缓摇动1.5小时→PBST洗膜三次，每次10min→将AKP标记的羊抗兔IgG抗体2ml （用封闭液以1:2000稀释）加入塑料袋，放入PVDF膜，赶走气泡，用封口机封口，室温平缓摇动1小时→PBST洗膜三次，每次10min→将PVDF膜放入检测缓冲液中平衡5分钟→将2 ml的检测缓冲液加入新塑料袋中，加入40微升NBT/BCIP浓贮备液，混匀→将2 ml的检测缓冲液加入新塑料袋中，加入40微升NBT/BCIP浓贮备液，混匀→弃去显色液，水冲洗。
四、实验结果A Ba b图3A：电泳结果检查图3B：转膜后转膜情况及抗体标记后检测1. 电泳结果和转膜结果检查：经SDS-PAGE分离得到的蛋白质，经不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后，取下凝胶，其中一半胶经切割，使用考马斯亮蓝染液在培养皿染色，另一半经过半干转移后的胶经过考马斯亮蓝染液染色后的结果在图3显示。
其中可以看到：经过考马斯亮蓝染色的胶（图3Aa）的左边形成蛋白梯度，右边为marker经过染色形成的条带。
经过转膜后的凝胶经过考马斯亮蓝染色后，如图3Ab所示，大部分蛋白和marker都被转到膜上，只剩下一些大分子蛋白残留。
2. 转膜后转膜情况及抗体标记后检测：转膜后，PVDF膜后经一抗、二抗结合后过夜，显色，经过约20min，显色情况如图3B 所示。
可见PVDF经显色后背景呈淡红色，右条带为Markers，左条带未有显示。
五、实验注意事项1.蛋白质样品制备过程中需要注意：（1）制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。
（2）样品处理中使蛋白质充分变性，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。
（3）样品建议分装冻存，避免反复冻融。
2. SDS-PAGE电泳过程中需要注意：（1）加入试剂后摇匀，防止部分胶块聚合不均匀，摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多氧气。
（2）温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀。
（3）加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的拖尾现象。
（4）为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
（5）低电压短时间的预电泳（恒压10-20V，20-30min），清除凝胶内的杂质。
3. 转膜过程中需要注意：（1）滤纸、胶、膜之间不能有气泡。
（2）滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。
胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下。
（4）PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。
4. 影响抗原抗体反应的因素：（1）电解质：电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。
（2）酸碱度：抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般为pH6.0~8.0。
（3）温度：温度升高可使反应加速，但温度高于56℃时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。
六、实验讨论此次讨论重点为：本次试验结果无条带原因：转膜后，经过一抗二抗标记和染色，理论上55-80kDa之间应当显示c-Myc的蛋白条带（图4）。
图4：理论上应该出现的转膜后条带需要考虑的原因有以下几个方面：（1）蛋白样品制备（2）检查胶：考马斯亮蓝染胶（3）检查膜：丽春红S染色（4）抗体滴度太低（5）显色过程中有问题（6）试剂放置太久或存放条件不正确。
从直接考马斯亮染色的未经转膜的胶上可以看出，我们是分离出蛋白质的，和邵红霞老师所做实验相对比，本组条带颜色较浅，在蛋白质提取方面可能出现了问题，使得提取的蛋白量减少，浓度下降。