钙离子处理对肌细胞组织特异性钙激活中性蛋白酶calpain3的影响

钙离子处理对肌细胞组织特异性钙激活中性蛋白酶calpain3的影响朱燕1，2 童敏1 罗欣1，2徐幸莲1 周光宏1∗（1南京农业大学农业部农产品加工重点开放实验室210095，2山东农业大学食品科学与工程学院271018）摘 要：本研究利用RT-PCR和Western blot方法研究钙离子处理对成肌细胞L6形态、分化的影响以及calpain3基因mRNA水平表达和蛋白水平降解的调控。

结果表明，成肌细胞L6的细胞分化程度随着钙离子浓度的增加而增大，且死亡细胞明显增多。

RT-PCR和Western blot结果表明钙离子处理后calpain3mRNA个样品之间的表达无明显差别，但是免疫印迹图谱却发现，钙离子处理组与对照组相比，94kDa处的条带颜色稍有降低，55kDa处的条带颜色加深，说明有更多的小片段生成，且钙离子浓度大于200μM时94kDa处的条带消失。

关键词：RT-PCR L6成肌细胞 Western blot骨骼肌特异性钙激活中性蛋白酶，P94是calpain超家族的一员，虽然其在活体中的功能不详，但可能对骨骼肌功能的发挥起到必不可少的作用[1]（Sorimachi 2000）。

Calpain3蛋白分子由四个结构域组成，这与Calpain1 和Calpain2的大亚基有较高的同源性[2]。

除此以外，Calpain3还具有3个特异性的结构，分别是N-端延伸亚基（NS）和两个插入序列：结构域Ⅱ内的插入序列IS1和结构域Ⅲ和Ⅳ之间的插入序列IS2，而IS2与核转导信号具有相似序列。

由于研究发现Calpain3的mRNA表达水平大约是Calpain1 和Calpain2的十倍之多，因而calpain3对于肌肉功能的作用引起人们的极大兴趣。

Richard[3]（1995）发现calpain3基因突变可以导致2A型肌营养不良症（LGMD2A）的产生，从基因水平证实了起初科学家对于calpain3功能的猜想。

自动降解性是Calpain3最主要的性质[45][46],在低或无钙离子存在的情况下Calpain3的半寿期（half live）小于10min。

迅速的自动降解性，使得人们几乎无法在离体条件下研究calpain3的用，进而人们把研究方向转向对calpain3表达调控的研究。

有的学者利用反义RNA技术对calpain3的mRNA干扰，导致细胞中缺乏含有弥漫α-actitin 的成熟Z盘[4]（Poussard et al， 1996）。

此外，研究表明大多数情况下缺乏calpain3的活性会导致肌肉的病理反应[5]（Kihbara 1998）。

Calpain3作为钙激活中性蛋白酶超家族一员，结构中也含有EF手型这种钙调控结构，表明钙离子也可能是这种蛋白酶的一个重要的调控因子。

且在钙离子对calpain3降解的影响上还存在较大争议。

本研究利用L6为研究对象，探讨钙离子处理对活体肌细胞中calpain3表达的影响。

1材料与方法1.1 成肌细胞培养、分化和Ca2+处理大鼠L6成肌细胞系（购于中国科学院上海细胞库，源自ATCC）按照1.5×105的密度基金项目：教育部博士点基金（20020307006），国家自然科学基金资助项目（30371016）作者简介：朱燕（1974-），博士研究生，讲师，主要研究方向：肉品质量控制。

*通讯作者Corresponding author：周光宏(1960-)，Email:ghzhou@接种于含有10％胎牛血清、100IU/ml 青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养液的60mm 一次性细胞培养板中。

细胞每2天传代一次，三代后将培养液中的10％FBS更换为2％马血清，诱导成肌细胞分化为肌纤维。

分化培养液每3天更换一次，分化12天后约70％以上的成肌细胞分化为肌管。

分化12天后的肌管，倒掉培养液，用PBS冲洗两遍，然后用含50、100、150、200和500µMCa2+的分化培养液处理肌管12小时，收获细胞，进行遍在性µ-calpan基因 RT-PCR、SDS-PAGE凝胶电泳和酪蛋白酶原分析1.2 calpain3的RT-PCR分析细胞总RNA提取：钙离子处理的分化12天的肌管（6孔板一个孔）细胞约108，倒掉培养液，直接加入Trizol 1ml，用移液枪反复吹打，直至Trizol溶液不再粘稠，然后移入经0.1%DEPC处理过的灭菌1.5ml离心管中；12000×g，4℃离心10min，将上清转入一个新的离心管中；室温放置5min后加入0.2ml氯仿并盖紧口用力摇动15s；放置2－3min后，于12000×g，4℃离心15min，分相；将上层水相转移到一新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min 后12000×g，4℃离心10min，沉淀RNA；弃上清，用1ml 75％乙醇洗片状RNA沉淀，混匀后7500×g，4℃离心5min，空气干燥后溶于适量DEPC水中。

用Beckman分光光度计在260nm处测定RNA浓度，A260/280nm测定其纯度。

取5µl进行1.5%琼脂糖电泳检测RNA 的完整性。

cDNA第一链的合成：2µl oligo(dt)18，和2µl 提取的总RNA加入5µlDEPC水后混匀，70℃温浴10min转入冰浴5min，经短暂离心后加入4µl 15×buffer，2µl 0.1M DTT及4µl 2.5mM dNTPs，轻混，42℃预热2min；加入MMLV反转录酶（200U/µl）并混匀，然后于42℃下50min反转录，反转录完成后，75℃ 5min灭酶。

PCR扩增:根据大鼠µ-、m-calpain和calpain3基因编码区，利用Primer primer5.0设计引物，选取推荐引物中含有最少二级结构和Tm值接近60℃引物的序列合成，进行PCR扩增。

Calpain3 引物P1：5’ ACC GTC TCA CAG CTT CTC A3’P2：5’ ATG TCA GTC CTG TTG GCT C3’PCR反应条件：50µl体系中混合5µl 10×buffer，4µl 2.5mM dNTPs，forward and reverse primer（均为20µM）各2µl，Ex-TaqDNA聚合酶（5U/µl TAKARA）,cDNA第一链2µl，加ddH2O至50µl。

反应程序：95℃，3min变性，然后95℃，15s变性；58℃，50s退火；72℃，50s延伸，共32个循环，最后72℃，5min延伸。

产物4℃保存。

取5µl进行1.5%琼脂糖电泳检测PCR 产物。

1.3 western blot钙离子处理后的分化12天的肌管，用冰冷的PBS冲洗3次，加入1ml经预冷的抽提液（20mM Tris-HCl pH7.4, 5mM EDTA, 5mM EGTA, 1mM DTT, 0.5Mm PMSF）用细胞刮将细胞刮下，移入离心管中超声波破碎，同时利用冰浴冷却，制成全细胞蛋白液。

全细胞蛋白液与5倍样品缓冲液（60mM Tris-HCl, 25%甘油，2%SDS，14.4mM2-巯基乙醇，0.1%溴酚蓝，pH6.8）以4：1混匀，在沸水中煮5min，取50µg蛋白进行SDS-APGE电泳，分离胶浓度为12%，浓缩胶为5%，80V恒压5h。

电泳结束后，利用半干法将胶上的蛋白转印到PVDF 膜上，电转印条件为200mA, 1.5h。

转移后的PVDF膜在含有5％脱脂奶粉的TTBS中4℃封阻过夜，然后与兔源的抗calpain3的单克隆抗体（SIGMA）反应4h，TTBS中洗膜3次，每次10min，然后与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗反应4h，TTBS中洗膜3次后在辣根过氧化物酶显色液中显色，显色完全后利用凝胶成像系统拍照。

2结果与分析2.1 Ca2+处理对L6细胞形态的影响没有分化的大鼠L6成肌细胞呈短梭形（图1A），当血清饥饿诱导分化后，细胞变长，形成肌管(图1B)。

约分化10天后，70%的成肌细胞分化为肌管，每个肌管内含有多个核。

分化12天肌管经50、100、150、200和500µM Ca2+处理12h后与对照组相比，形态也发生了变化（图2），Ca2+处理可以诱导L6分化，肌管长度增加。

当Ca2+浓度高于200µM后，细胞产生融合且死亡率增加，从相差显微镜下观察到浮在培养液上层的死亡细胞增多（如图2.5、2.6）。

A B图1：L6形态图（A 未分化L6成肌细胞；B分化的细胞）1 2435 6图2：钙离子处理对L6成肌细胞形态的影响1）对照组，分化12天L6；2）分化12天L6 50μM Ca2+处理12h；3）分化12天L6 100μM Ca2+处理12h；4）分化12天L6 150μM Ca2+处理12h；5）分化12天L6 200μM Ca2+处理12h；6）分化12天L6 500μM Ca2+处理12h；2.2 Ca2+处理对L6细胞calpain3 mRNA表达的影响对经Ca2+处理过的分化的L6肌细胞进行RT-PCR扩增分别扩增出分子量为230bp的目的片段，与预测的片段长度相符，经测序分析证实为calpain3的扩增区。

从电泳图谱上我们认为Ca2+处理肌细胞对calpain3的mRNA表达的影响不大。

DL2000 1 32456图3：calpain3的RT-PCR扩增图1）对照组，分化12天L6；2）分化12天L6 50μM Ca2+处理12h；3）分化12天L6 100μM Ca2+处理12h；4）分化12天L6 150μM Ca2+处理12h；5）分化12天L6 200μM Ca2+处理12h；6）分化12天L6 500μM Ca2+处理12h；2.3 Ca2+处理对L6细胞中calpain3蛋白的影响由于calpain3的降解迅速，且到目前为止还没有办法研究calpain3的活性和calpain3明确的作用。

将细胞收获立即进行粗提后就已经发生降解（图4），Western blot 图除了含有94kDa 的形式外，还出现了80和55kDa 左右的降解片段。

从图5可以看出，当用钙离子处理L6成肌细胞后，calpain3除了具有少量94kDa 的片段外，都以55kDa 的最终降解物形式存在。

钙离子处理组与对照组相比，94kDa 处的条带颜色稍有降低，55kDa 处的条带颜色加深，说明有更多的小片段生成。