中性蛋白酶
米曲霉F_81菌株产中性蛋白酶的分离纯化
・研究报告・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2010年第4期米曲霉F 281菌株产中性蛋白酶的分离纯化汤鸣强 曾小芳(福建师范大学生物与化学工程系,福清350300) 摘 要: 对米曲霉菌种F 281所产中性蛋白酶进行分离纯化。
经过硫酸铵分级沉淀,DE AE 2Sephar ose Fast Fl ow 阴离子交换层析和Sephacryl 2S200凝胶过滤层析后,得到一种电泳纯的中性蛋白酶,纯化倍数为2613倍,活性回收率为617%。
经S DS 2P AGE 电泳测定其相对分子质量约为7314k D 。
关键词: 米曲霉 中性蛋白酶 分离纯化Studi es on Separati on and Pur i fi cati on ofNeutral Protease fro m Aspergillus oryae F 281Tang M ingqiang Zeng Xiaofang(D epart m ent of B iology and Che m istry Engineering,Fuqing B ranch of Fujian N or m al U niversity,Fuqing 350300) Abs trac t: The separati on and purificati on of a neutral p r otease fr om A spergillus oryae F 281was studied .A single neutral p r oteasewas purified t o homogeneity using a mmoniu m sulfate p reci p itati on,DE AE 2Sephar ose Fast Fl ow ani on exchange chr omat ography and sephacryl 2S200gel filtrati on .This purificati on p r ot ocol resulted in a 2613fold purificati on of neutral p r otease with 617%final yield ,and the relative molecular weight of the enzy me was deter m ined t o be app r oxi m ately 7314k D using S DS 2P AGE .Key wo rd s: A spergillus oryae Neutral p r otease Separati on and purificati on收稿日期:2009212213作者简介:汤鸣强,男,理学硕士,副教授,研究方向:生化与微生物;E 2mail:mqt -1022@中性蛋白酶作用条件温和,是最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂[1],可应用于食品、制药、化妆品以及丝纺等行业[2]。
中性蛋白酶
中性蛋白酶
中性蛋白酶这种物质，属于是一种包含了枯草芽孢杆菌，且经过了多次发酵之后，而获取的一种物质，这种中性蛋白酶属于是一种内切酶，可以在各种蛋白质水解之内处理。
但是，你是否在使用中性蛋白酶的时候，对此有所认识呢。
中性蛋白酶的作用比较多，一般是能够广泛使用在动植物蛋白的水解，在制取或者是生产高级调味品，以及食品营养强化剂的时候，其中的HAP和HVP就是利用中性蛋白酶制作的，此外中性蛋白酶还是能够使用在皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工。
利用中性蛋白酶的酶促反应，可把动植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白质的有效吸收和利用，其水解液AN%高，水解度高，风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂，各种动物来源性抽提物生产功能性骨、肉提取物(骨素)、水产提取物、蛋白胨、肽等及研究开发一些高附加值的功能食品。
中性蛋白酶可将面团的蛋白质水解成胨、肽类甚至氨基酸，从而减弱面团筋力，使它具有良好的可塑性和延伸性，保持清晰美观的印花图案。
改善成品的光泽、使饼干断面层次分明，结构均匀一致，口感松爽酥脆。
中性蛋白酶之内因为含有了大量的中性蛋白酶类型的药物，对于人们在平时使用的时候，也是能够因此而起到可很好的消炎，且比较不错的利胆、止痛，还能够帮助人们身体上起到了促进消化的效果，我们对此千万不能不知道。
蛋白酶的种类
蛋白酶的论述摘要：蛋白酶（英语：Protease）是生物体内的一类酵素（酶），它们能够分解蛋白质。
分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。
抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称蛋白酶抑制剂。
许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。
1．木瓜蛋白酶1.1木瓜蛋白酶简介木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。
是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。
1.2木瓜蛋白酶的特点木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。
是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。
它是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
木瓜蛋白酶由212个氨基酸残基组成，当用氨基肽酶从N末端水解掉分子中的2/3肽链后，剩下的1/3肽链仍保持99%的活性，说明木瓜蛋白酶的生物活性集中表现在C末端的少数氨基酸残基及其所构成的空间结构区域。
木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。
此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。
存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。
EC3．4．22．2。
作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。
此酶主要是以内肽酶的形态起作用。
中性蛋白酶的作用,没想到功能这么强大
中性蛋白酶的作用，没想到功能这么强大中性蛋白酶具有强大的功效，在医药、纺织、皮革、饲料等行业都被充分利用，除此之外，中性蛋白酶还对人体健康有很多好处，比如能够抗炎症，缓解肿胀等一系列功效。
★1、抗炎症、肿胀作用：①以热灼伤大鼠作炎症模型，口服给药后可见血管通透性亢进受到抑制；②口服能抑制抗大鼠血清所致大鼠皮肤的炎性水肿，也能抑制角叉菜胶、葡聚糖、5-羟色胺、缓激肽等各种致炎物质所致的大鼠炎性水肿；③体外对致炎症多肽缓激肽有很强的分解能力；④对纤维蛋白、纤维蛋白原有很强的溶解能力，但对清蛋白、α-及β-球蛋白等机体蛋白质则几乎无作用。
★2、促进痰液、浓液溶解与排泄的作用：①对慢性副鼻窦炎病人有使鼻涕中干物质重量减少、粘度下降；②对暴露于二氧化硫气体而罹患亚急性支气管炎的兔，可使痰液粘度显著下降。
★3、促进抗生素向病灶部位移行的作用：①对慢性副鼻窦炎病人能促进氨苄青霉素向上頜窦移行；②对实验性膀胱炎的患兔，能促进美西林（氮艹卓脒青霉素）向膀胱壁移行。
★4、焙烤行业的应用：中性蛋白酶可将面团的蛋白质水解成胨、肽类甚至氨基酸，从而减弱面团筋力，使它具有良好的可塑性和延伸性，保持清晰美观的印花图案。
改善成品的光泽、使饼干断面层次分明，结构均匀一致，口感松爽酥脆。
★5、大豆分离蛋白的应用：能水解大豆分离蛋白成小分子肽，大大提高了大豆分离蛋白的生物效价，使其易为人体消化吸收，同时还提高了溶解，降低了粘度，改善了大豆分离蛋白的功能特性。
★6、啤酒工业：添加中性蛋白酶分解蛋白质为多肽和游离氨基氮，特别对大麦，大豆等植物性蛋白作用效果明显，用于啤酒生产，可排除蛋白质产生的"冷混浊"现象。
中性蛋白酶市场分析报告
中性蛋白酶市场分析报告1.引言1.1 概述中性蛋白酶是一种在中性条件下（pH值约为6-8）具有较高催化活性的蛋白水解酶，能够有效水解中性pH环境下的蛋白质，具有广泛的应用前景。
本报告旨在对中性蛋白酶市场进行全面分析，包括市场现状、发展趋势、潜力与挑战，以及针对相关行业的建议与展望。
通过本报告的编写与研究，旨在为相关产业提供可靠的市场参考，帮助业内人士更好地把握市场动态，制定切实可行的发展战略。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括对整篇文章的结构和内容安排进行介绍，以便读者对文章的整体框架有一个清晰的认识。
可以包括各个章节的简要概述以及预计的内容涵盖范围，让读者在阅读之前就对文章的整体内容有一个初步的了解。
"1.3 目的":本报告旨在对中性蛋白酶市场进行深入分析，从中性蛋白酶的定义与特点、市场现状分析及市场发展趋势预测等方面对该市场进行综合评估。
通过对中性蛋白酶市场的潜力与挑战进行分析，为相关行业的决策者提供市场发展的参考和建议，促进中性蛋白酶市场的健康发展。
1.4 总结总结部分：通过对中性蛋白酶市场的定义、特点、现状分析和发展趋势预测，我们可以看出中性蛋白酶市场具有巨大的潜力和发展前景。
然而，市场也面临着诸多挑战，如激烈的竞争、技术创新等方面的压力。
在未来发展中，我们需要加强研发投入、提高产品质量、拓展市场渠道等方面的工作，以应对各种挑战，实现市场的持续健康发展。
希望本报告能够为相关经营者和投资者提供参考，帮助他们更好地把握中性蛋白酶市场的机遇和风险，制定合理的发展策略。
2.正文2.1 中性蛋白酶的定义与特点中性蛋白酶是一类酶类蛋白，其最适作用pH值为6.0-8.0，属于中性条件下活性最高的酶。
它主要用于在中性条件下水解蛋白质，是一种重要的生物催化剂。
中性蛋白酶具有多种特点，首先，它具有较高的活性和稳定性，在中性条件下能够持续发挥作用；其次，中性蛋白酶对蛋白质的特异性较强，能够选择性地水解特定的蛋白质，对于一些特定的酶解反应具有明显的优势；此外，中性蛋白酶对环境的适应能力较强，在温度、离子强度等方面具有一定的抗性，能够在复杂的生物体系中发挥作用；最后，中性蛋白酶在工业生产中具有广泛的用途，可以用于制备食品添加剂、生物医药制剂、日化用品等产品，具有较大的市场需求。
中性蛋白酶的测定方法
中性蛋白酶的测定方法中华人民共和国行业标准（QB1805.3-93）1 主题内容与适用范围本标准规定了工业用蛋白酶制剂的技术要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存要求。
本标准适用于采用表1中的菌种，以发酵法生产经提纯制取的蛋白酶制剂。
表1类别代号生产菌酸性蛋白酶 537 宇佐美曲霉(asperigillus usamii No.537)3350 黑曲霉（asperigillus niger No.3350）中性蛋白酶 1.398 1.398为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis N0.1.398)3942 39423为栖土曲霉(aspergillus terricola No.3942)166 166放线菌(actinomyces No.166)碱性蛋白酶 2709 为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis N0.2709)CW301 为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis N0.CW301)209 为短小芽孢杆菌(bacillus pumilus N0.209)SMJ 为嗜碱短小芽孢杆菌(alkaliphilic bacillus No.SMJ)CW302 为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis N0.CW302)2 引用标准QB/T1803 工业酶制剂通用试验方法QB/T1803 工业酶制剂通用检验规测和标志包装、运输、贮存3 产品分类3.1 产品按形态分为固体酶和液体酶两种剂型3．2 产品按作用的pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶三种，其代号与生产菌分别见附表14 技术要求4.1 外观要求固体剂型：黄褐色粉末，无结块，无潮解现象。
液体剂型：棕褐色液体，允许有少量凝聚物中性蛋白酶活力测定方法（国家标准）1 定义1 g固体酶粉（或１ｍl液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min 水解酪素产生1 ug 酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
中性蛋白酶
5.4医药工业中的应用
在医药工业中蛋白酶被用于制备药剂,如伤口清创的 药膏、烧伤疤痕软化、消炎消肿、祛痰等。中性蛋 白酶具有广泛的多样性和底物特异性,使其在研发高 效治疗药剂方面优势明显。来自米曲霉的中性蛋白 酶可被用作消化助剂,纠正某种裂解酶缺陷病症。梭 菌胶原酶或枯草杆菌蛋白酶联合广谱抗生素用于治 疗烧伤和创伤。由枯草芽孢杆菌产生的中性金属蛋 白酶能特异性的水解纤维蛋白和胶原蛋白,所以广泛 应用于皮肤病学上。
3、中性蛋白酶的分类：
中性蛋白酶根据催化机制和活性中心蛋白酶功能基 团不同可以分为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、 半胱氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶四大类。 3.1 丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶催化底物蛋白质水解时通常有两个步骤。在 水解过程中,随着氨基酸的丢失和肽链的断裂还形成共价酶-肽复合物的中间二聚体。然后脱去酰基,通过水对中间体的亲 核攻击,从而使底物肽键水解。大部分的丝氨酸蛋白酶都形成 一个典型的Ser—His—Asp的三联体结构,也有少量以丝氨酸 作为催化基础。
中性蛋白酶
中性蛋白酶
1、中性蛋白酶的定义：
指能够在中性或弱酸、弱碱性环境中作用的一类蛋 白酶，其最适作用pH介于6.0～7.5,能催化蛋白质肽 键水解，具有催化反应速度快,无工业污染,反应条件 适应性宽等优点。
2、工作机理：
中性蛋白酶能在中性条件下水解食品中蛋白质 的肽键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、 果汁、啤酒和黄油生产中，添加中性蛋白酶可澄清 发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过 悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发 酵并提高产量。
5.2 皮革工业中的应用
皮革加工包括浸透、去毛和软化等过程，传统的工艺主要采 用化学方法处理，在加工过程中不可避免地会使用到强腐蚀 性物质，既不利于生产，也容易导致环境污染。酶替代化学 药品在提高皮革质量与减少环境污染证明是颇有成效的。蛋 白酶主要被用于选择性的水解皮肤中的非胶质组分与去除非 纤维蛋白,如清蛋白与球蛋白等。将蛋白酶应用于皮革工业 中,可以减少浸泡时间。 中性蛋白酶酶制剂的选择依赖于矩阵蛋白（如弹性蛋白和角 蛋白）的特异性,酶用量取决于被处理皮革的软硬。酶制剂 在皮革制品加工中的应用不仅有利于减少环境的污染而且还 能节约能源。
蛋白酶的作用及种类都有哪些
蛋⽩酶的作⽤及种类都有哪些 蛋⽩酶存在于动物的肝脏，植物的茎叶和果实等等，蛋⽩酶的作⽤是很多的，下⾯是店铺为⼤家带来的蛋⽩酶的作⽤及种类，欢迎阅读。
蛋⽩酶的作⽤ 蛋⽩酶是⽔解蛋⽩质肽链的⼀类酶的总称。
按其降解多肽的⽅式分成内肽酶和端肽酶两类。
前者可把⼤分⼦量的多肽链从中间切断，形成分⼦量较⼩的朊和胨;后者⼜可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐⼀将肽链⽔解⽣成氨基酸 蛋⽩酶的种类 ⽊⽠蛋⽩酶 ⽊⽠蛋⽩酶，是⼀种蛋⽩⽔解酶，可将抗体分⼦⽔解为3个⽚段。
是番⽊⽠中含有的⼀种低特异性蛋⽩⽔解酶，活性中⼼含半胱氨酸，属巯基蛋⽩酶，应⽤于啤酒及⾷品⼯业。
⽊⽠蛋⽩酶是⼀种巯基蛋⽩酶，具有⼴泛的底物特异性蛋⽩质精氨酸的作⽤，L-赖氨酸精氨酸、⽢氨酸、L-⽠氨酸残基的羧基参与形成的肽键。
这种酶属内肽酶，能把整个鸡蛋的蛋⽩多肽分⼦肽-NH-分⼦量较⼩的代。
⽊⽠蛋⽩酶是⼀种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋⽩质的蛋⽩酶。
它的外观为⽩⾊⾄浅黄⾊的粉末，微有吸湿性。
⽊⽠蛋⽩酶(Papain)简称⽊⽠酶，⼜称为⽊⽠酵素。
是利⽤未成熟的番⽊⽠(Carica papaya)果实中的乳汁，采⽤现代⽣物⼯程技术提炼⽽成的纯天然⽣物酶制品。
它是⼀种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋⽩酶和酯酶的活性，有较⼴泛的特异性，对动植物蛋⽩、多肽、酯、酰胺等有较强的⽔解能⼒，同时，还具有合成功能，能把蛋⽩⽔解物合成为类蛋⽩质。
溶于⽔和⽢油，⽔溶液⽆⾊或淡黄⾊，有时呈乳⽩⾊;⼏乎不溶于⼄醇、氯仿和⼄醚等有机溶剂。
最适合PH值6～7(⼀般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作⽤，等电点(pI)为8.75;最适合温度55～65℃(⼀般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活;受氧化剂抑制，还原性物质激活。
胃蛋⽩酶 胃蛋⽩酶是⼀种消化酶，在细胞的主要功能是胃粘膜的胃分泌的⾷物中的蛋⽩质分解为⼩肽⽚段。
中性蛋白酶高产菌株的诱变选育
摘要 ： 对产中性蛋 白酶的枯草芽孢杆菌（ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ） Ｓ Ｈ Ｂ ２ ０ １ ０ — １ 进行物理和化学诱变以筛选 高 产菌 株。 考察 了６ 种 筛选培养
基在分辨中性蛋 白酶 高产 菌株上的效率 ， 菌株在脱脂牛奶培养基上生长状态最佳， 水解圈易于观察。 以紫外线、 硫酸二 乙酯为诱 变剂， 研 究了两者的致 死率曲线 ， 选择致死率为 ９ ０ ￣ ９ ５ ％的剂量进行两轮复合诱 变，诱变菌的发酵液酶活依次较 出发 茵提高 １ ． ４ ９ ％、１ ０ ． ９ ９ ％、
ｒ ａ ｔ ｅ ａ ｔ ９ ０ － ９ ５ ％ Ｗａ ｓ ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄｔ ｏｔ ａ ｋ ｅｔ ｗｏ － ｒ ｏ ｕ ｎ ｄｕ ｌ ｔ ｒ ａ ｖ ｉ ｏ ｌ ｅ ｔ － ｄ ｉ ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ｓ ｌｆ ｕ ａ ｔ ｅｍｕ ￣ｔ ｉ ｏ ｎ ． ｈｅ Ｔ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｉ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ ｍｕ ｔ ａ ｎ ｔ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓｆ ｒ ｏ ｍ ｅ ａ ｃ ｈ ｓ ｔ ｅ ｐｗｅ ｒ ｅ
Ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ Ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎｇ ｏ ｆ Ｎｅ ｕｔ ｒ ａ ｌ Ｐｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ Ｈｉ ｇ ｈ・ ｅ ｌ ｄ Ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ
中性蛋白酶
中性蛋白酶介绍
中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经深层发酵提炼而成的固体酶制剂，在中性条件下能将大分子的蛋白质水解成氨基酸等产物，可直接用于啤酒、食品、饲料、化妆品、营养保健品及相关行业的蛋白质分解。
中性蛋白酶特性
外观：黄褐色粉末
温度：适应范围 37-59℃，最适温度 40-45℃
气味：无异味
pH值适应范围 6.8-8.0
执行标准 QB1805.3-93
中性蛋白酶规格
中性蛋白酶为固体酶活力为50000 U/g、100000U/g.
酶活力单位定义：反应温度40℃，pH4.6条件下，在1h内水解1mg淀粉所需要的酶量。
中性蛋白酶的应用
1.动物蛋白分解：使用该酶可以降低鱼类、肉类等动物体的粘度，促使蛋白质分解为肽类和氨基酸。
2.植物蛋白分解：可用于豆奶，速溶豆粉生产。
3.动物血液处理：使用该酶处理血液中的红细胞，可以得到脱色的、可溶性的血水解物，用作代血浆或加到食品中去。
4.饲料上的应用：可将酶制剂加入饲料后，使物料在酶的作用下得到一定的降解。
中性蛋白酶包装及存储
本产品为1kg/铝箔袋、25kg/袋，也可根据客户需要更换包装。
中性蛋白酶应存放于阴凉干燥处，避免阳光直射。
本产品含有活性物质，在低温下（25℃以下，但不能冷冻）贮存时，其活性可保持相当长时间。
中性蛋白酶供应地
中性蛋白酶联系方式。
中性蛋白酶(Neutral protease, NP)活性测定试剂盒说明书
货号：QS2301 规格：50管/24样中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性测定试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：NP在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。
由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。
测定原理：中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加10 mL蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入10 mL试剂一，沸水溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加50 mL蒸馏水溶解。
试剂五：液体×1瓶，4℃保存。
标准品：液体×1支，0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液，4℃避光保存。
粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
2.血清或培养液：直接测定。
3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：1.分光光度计预热30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。
3. 对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A对照管。
水产用耐高温中性蛋白酶菌种诱变及提高发酵水平的研究
胨１ ％，Ｎ Ｃ ． ａ １０ ％，酵母膏０ ％，葡萄糖０５ ２ ． ２ ． ％。（ 发酵 ４ ）
摇瓶 培养 基 ：玉 米粉 ３ ％，豆粕 粉２ ％，麸皮 ４ ％， Ｋ ，Ｏ ＨＰ
００ ％，Ｎ ， Ｏ ０３ ．３ ａＨＰ Ｉ％，ｐ 值 ７０ Ｈ ．。
直接得到１ ％～０ ２ ８ ％的营养缺陷型菌株 ，故有超诱变剂之 称。亚硝基胍在缓冲液 中较难溶解 ，而在 甲酰胺中溶解
硝基 胍 。
将对数生长期 的菌液经离心洗涤后 ，加入Ｎ Ｇ Ｔ 的甲酰 胺溶解液 ，使Ｎ Ｇ Ｔ 最终浓度 为３ ０ｇ／ Ｌ ５Ｃ ０ ｇ ，３ ＂暗处振荡 ｍ ４ ｉ ，离心后倒去上清液并用无菌生理盐水洗涤 ，重 ０ｍ ｎ 新将菌体制成菌悬液 ，适当稀 释后 ，涂布分离平皿 ，３ ５
皿 ，３ ℃倒 置 培养 １ ～ ，根 据 菌落 与 其水 解 圈直 径 比 ５ ． ２ｄ ５
１ 材 料 斤法
１１ 实验 材料 ．
１１１ 菌 种 枯 草 牙 孢 杆 菌 （ ａ ｉ ｌ Ｓ ｕ ｔ ｌ ｓ ．． Ｂ ｃ ｌ Ｕ Ｓ ｂ ｉ ｉ ）
Ａ １ ９ ，由广州市博仕奥生化技术研究有限公司中心实 Ｓ． ８ ３
荡器 （ 常州 国华 ）；Ｔ Ｌ ５ Ａ台式离心机 （ Ｄ 一一 上海安亭科
学仪 器 厂 ）。
１ 实验 方 法 ． ２
养基平板上点种（ 每板点３ 个菌株） ５ ，３ ℃倒置培养 ，将其
中生 长 快 及透 明 圈与 菌 落直 径 比大 的 菌 株 挑 出 ，进 行 复
． 化技术研究有限公司用诱导的方法 ，培养 出能分泌耐受 用 。 饲料制粒高温蛋 白酶的菌种 （ Ｓ ． ８ Ａ １ ９ ）。为提高菌种的 １ ． 菌种生长 曲线的测定方法 将菌种接入种子摇瓶３ ３ ．２ ２ ０
中性蛋白酶
回收片段后电泳(点样1uL)
M:250bp marker 1:Bs168-1 2:Bs168-2 3:BtDHI 4:Bt15 其中1-2片段大小为1566bp,34片段大小为1701bp. 同时进行测浓度，取浓度较 大的Bs168-1及Bt15做后期的 实验。
5、做连接，转化感受态细胞
连接转化做过一次，但是阴性对照（即 感受态细胞）也有长菌，正在找原因及重新 准备材料进行感受态细胞制备及转化大肠杆 菌JM109中。
2、提基因组DNA
1:Bs168-1 2:Bs168-2 3:BtDHI 4:Bt11 5:Bt15
同时也有测定浓 度。
3 、PCR（模版：基因组DNA）
M：250bp marker 1:阴性对照 2:Bs168-1 3:Bs168-2 4:阳性对照S3--5 5:BtDHI 6:BtDHI 稀释30倍 7:Bt11 8:Bt15 9:Bt15 稀释30倍 10:阳性对照S3-5
中性蛋白酶
1、中性蛋白酶基因确定
通过文献及NCBI查找，确定从枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis）和苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis）中分别扩增中性蛋白 酶基因(neutral protease)。
利用Primer Premier 5及文献设计出相应 的引物序列，并插入酶切位点及保护碱基。
其中2-3片段大小为1566bp,5-9 片段大小为1701bp,4及10片段 大小为1540bp.均为图中最亮 的条带。
4、回收片段
M:250bp marker 1:Bs168-1 10uL 2:Bs168-2 10uL 3:BtDHI 20uL 4:Bt15 20uL 其中1-2片段大小 为1566bp,
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1.1中性蛋白酶的来源
蛋白酶是一类催化蛋白质肽键，生成蛋白胨、蛋白肽及氨基酸等产物的水解酶，其广泛分布于自然界的植物、动物和微生物中。
例如木瓜蛋白酶主要来自于植物木瓜，胰蛋白酶来自动物的胰腺，来自微生物的蛋白酶没有特定名称，例如有来自AS1.398枯草芽孢杆菌的蛋白酶，有来自宇佐美曲霉的蛋白酶等等，其中微生物来源的蛋白酶数量与种类最多，也最具研究、开发与生产价值。
随着水解条件之一的pH值的升高，蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，这也同时划分了它们应用的领域有所不同。
1.2中性蛋白酶的研究现状
对于中性蛋白酶的研究主要集中于以下几个方面：
一是继续研究发现新的蛋白酶品种，为蛋白酶家族添加新成员，尽管此项工作的难度越来越大，但其意义不容否认。
二是对现有蛋白酶进行修饰、改性，延长和强化其功能，期望在降低应用成本的同时，减少酶本身的一些缺陷对其应用的限制。
三是通过生物技术手段提高酶产量，降低酶生产成本。
现代生物技术不仅发达而且发展很快，技术应用的可选择范围也很广，例如物理或化学诱变技术、细胞质融合技术、转基因技术以及克隆技术等等。
可以肯定和确认的是：上述技术的应用都取得了不同程度的效果；同时这些技术各有优势，所以并存至今。
四是提取和纯化技术方面，朱建星利用萃取技术使酶液浓度提高到发酵酶液的3.6倍多。
刘东旺等应用盐析、层析和凝胶过滤等技术，纯化后的酶活力超过纯化前的19倍之多等等。
此外，在纯化倍数提高的同时往往伴随着提取率的提高。
1.3中性蛋白酶的生产现状
中性蛋白酶的生产水平随着研究水平的提高而提高。
总体上发达国家高于国内，而国内厂家之间也参差不齐，以微生物发酵来源的中性蛋白酶为例，报道说的范围从数百至一万多（u/ml）都有。
导致这种差别的原因可能是不同类的菌种，不同来源的同类菌种，不同的菌株改良程度，不同的发酵工艺优化水平等等。
1.4中性蛋白酶的应用
蛋白酶在工业化应用酶中占的比例很大（超过50%），而中性蛋白酶在蛋白酶中占的比例也很大。
占比大的原因之一是应用范围大而广。
以中性蛋白酶为例，它可用于皮革业提高皮革的质量；可用于牙膏帮助清除牙渍；可用于饲料以提高消化吸收率；用于食品加工最为广泛，加入待焙烤的面团中可以调节面团筋力，加入肉类中可以使肉制品嫩化、改善口感，加入牛奶中可以加速凝乳，加入以蛋白质为主的废弃料中可以制取多种水解产品。
在蛋白酶应用中有些问题令人困惑不解值得重视，例如不同来源的蛋白酶水解蛋白质的主要位点有差别，所以即使使用同一种蛋白质原料，不同来源蛋白酶的水解产物和水解率也会有所区别；如果混合食用不同来源的蛋白酶，假如总酶量与单一蛋白酶相同，由于水解的主要位点增加，也有可能提高水解率和水解程度。
另外用于食品水解的蛋白酶还有一层要求就是风味和口味，目前主要问题是口味即苦味。
尽管“风味蛋白酶”的诞生在一定程度上降低了疏水基团的外露，很大程度上减少了水解产物的苦味，不过因其高昂的价格和苦味的残留依然不能得心应手地应用。
1.5本课题的研究目的与意义
从上述内容可知，虽然蛋白酶的研究、生产与应用已相对成熟，但是还有一些问题值得研究和解决，包括为提高产酶量而进行的菌种特性的改善、发酵工艺的优化、发酵酶液的浓缩与纯化等等。
其中最基础的就是菌种产酶能力的提高。
尽管前面提到各种改善菌种的现代生物技术，包括物理或化学诱变技术、细胞质融合技术、转基因技术以及克隆技术等等，有的已经相当先进。
但是从成本性、发酵副产物的安全性与稳定性、实用技术的可推广性等方面考虑，对菌种进行诱变不失为行之有效和有研究价值的研究。
虽然诱变
技术的研究已经不少，但鲜有以等离子对菌种特别是对AS1.398枯草芽孢杆菌的诱变。
所以本文即以等离子对AS1.398枯草芽孢杆菌进行诱变，筛选出高产菌株并进行工艺优化。