欧前胡素和异欧前胡素舒张血管作用及其机制的比较

ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ．Ｓｔｕｄｙ ａｎｄ
ｍｅｍｂｒａＴｌｅ
ｖｍｓｏｄｉｌａｔｏｒ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ卸ｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｒ目Ⅱ№：Ｔｈｅ
ｅ肚ｃｔ
ａｎｄ
第二届中国西部药物分析学术研讨会
ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ
ｏｎ
２０１０年１０月・西安
ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ Ｉｓｏｉｍｐｅｍｔｏｒｉｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ ｗｅｒｅ
着竞争剂尼群地平浓度的增加而减小．并逐渐趋丁平衡，由此进一步的分子对接研究中两者与尼群
地平都是停靠在电压依赖性Ｌ犁钙通道活性部位ａ－Ｉｃ型砸基上：结论：两者可能作用在Ｌ一型钙离
子通道的二氢毗啶位点，活性部位可能是Ｌ．型钙离子通道的ａ－ＩＣ型亚幕上。
关键词欧前胡素：异欧前胡素：舒张血管作用；作用机制 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆｌｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ ａｎｄ Ｉｓｏｉｍｐｅｍｔｏｒｉｎ Ｖａｓｏｄｉｌａｆｉｏｎ
ｒａｔ
ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ａｒｔｅｒｙ
（９７．３＋１．１）％ａｎｄ ５．６３ｉ０．２２，（９５．７＋０．９）％ａｎｄ ５．５４ｉ－０．１７，（９８．３＋１．４）％ａｎｄ ８．４３＋０．１４．Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ
ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｐＥＣｓｏ ｏｆ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ
ｏｎ
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ｂａｓｉｌａｒ ａｒｔｅｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ Ｉｓｏｉｍｐｅｍｔｏｒｉｎ
ｅｆＴｅｃｔ ａｎｄ
Ｍｅｔｈａｎｉｓ田
ＺｈｏｕＮａｎ，ＨｅＪｉａｎｙｕ，ＺｈａａｇＪｉｅ，ＨｅＨｕａｉｚｈｅｎ，ＨｅＬａｎｇｃｂｏｅｇ
（ＤｅｐａｒｈｎｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉ’－ｎＪｉＩｏｔｏｎｇＵａｈｅｎｉｔｙ，Ｘｉ＇ａａ ７１００６１Ｃｈｍａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｓｏｉｍｐｅｍｔｏｒｉｎ
第一届中国Ｍ部药物分析学术研ｔ｛会
２０１０年１０月・西安
矿，，矿矿矿’ ＲＯ～…■■………………“
３．结论
岫至｜ｔｌＩＢｉｌＩＵＵｌＩＨＩ。
或誓矿矿，
欧前胡素和异欧前胡素舒张血管作用及其机制的比较
周楠，贺建宁，张杰，贺怀贞，贺浪冲 西安交通大学医学院陕西西安７１００６
３土１
本实验表明，用ＨＰＬＣ法测定不同时间注射用青霉素钠、注射用头孢唑林钠在分别与１０％、２０％
０撕ｅｃｔｉｖｅ：Ｓｔｕｄｙ∞ｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐａｒｅ
ｅｘｐｌｏｒｅ
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ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆwenku.baidu.com
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ｔｈｅ ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｔｈｅｍ ｌｈｒｏｕｇｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖａｓｃｕｌ盯 ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｍｐｅｒａｔｏｄｎ卸ｄ Ｉｓｏｉｍｐｅｍｔｏｒｉｎ ｍａｘｉｍｕｍ ｕｓｉｎｇ ｃｅＯ ｐＥＣ∞ｏｆ
２３９
第二届中国西部药物分析学术研讨会 方法４ ｏＣ状态下获得大鼠血管平滑肌细胞膜【３Ｊ。
２０１０年１０月・西安
１．５３膜固定相的制备真空状态下将细胞膜悬液加入装有大孔硅胶粉末的具支试管中，与高温 活化后的硅胶０．０５ ｇ混悬５ ｍｉｎ。用５ ｍＭ 下装填血管平滑肌细胞膜色谱柱（１０
ｍｍ ｐＨ ７．４
ａｎｄ
ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ
ｗｅｒｅ（５９．６４－３．９）％ａｎｄ ５．２６－Ｉ－０．１５。（６３．７士：１４．４）％ａｎｄ ４．９３ｉ－０．２６，（８５．０士３．６）％ａｎｄ
ｃａｐａｃｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
５
１０
ｃ／ｍｏｌＬ＂１（ｘｌｎ
第二届中国西部药物分析学术研讨会
图３ ３种化§物在ｍ菅平滑肌细胞膜也谱模型
２０１０年１０月－西安
中的保留
＾．欧前胡素，Ｂ．尼＃№平，Ｃ一异欧前胡素；自胞 膜色谱柱ｌ
０
０…２
凹４欧前胡索和异欧前削素的脚拟台曲线
细胞聪色谱柱１０ｌ｜ｌｒｎ×２
０
ｍｍ：％遵０．２
ｍ窑ｍＬ＂’
离体血管实验对欧前胡素和异欧前胡紊舒张血管作用进行初步比较并运用细胞膜色谱技术和分子对
接研究探索欧前胡素和异欧前胡素的舒张血管作用机制：结果：欧前胡素、异欧前胡素和尼群地平
对大鼠肠系膜最大舒张率和ｐＥｃ∞分别为（９７ １）ｏ／ｄｅ
５ ６３ｉＯ ２２：（９５
７ｉ０９）％和５
５４±－０１７：
（０８３士ｌ ４）％和８４３ Ｌ－０ １４；对脑基底动脉上最大舒张率和ｐＥＣ∞分别为（５９６士３ ９）％和５ ２（－ｈ０ １５： （６３ ７±１４ ４）％和４９３士０ ２６：（８５ ０士３ ６）％和７ ９９士００８。运用细胞膜色谱技术．丽者的容量因子随
７．９９ｊ＝０．０８．Ｂｏｔｈ
ａ
ｏｆ ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ ｗｈｉｃｈ ｉＳ
ａｎｄ
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ｇｒａｄｕａｌｌｙ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ
Ｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ．Ｉｓｏｉｍｐｅｍｔｏｒｉｎ
ａｎｄ
ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ ｗｅｒｅ ｂｕｉｌｔ
ａｎｄ
ｄｏｃｋｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｖｏｌｔａｇｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌ—ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｑ－１ Ｃ
和３０％脂肪乳配伍后的含嚣．其测定结果不受脂肪乳的影响．方法简便．同收翠高。实验结果表明， 注射青霉索钠、注射用头孢唑林钠在分别与１０％、２０％和３０％脂肪乳配伍后，在２４ ｈ内两种药物的外 观性状、ｐＨ值及含量均无明显改变．可以配伍使用。
参考文献（略）
攮蔓目的：对欧前胡素和异欧前胡素舒张血管作用进行比较井探讨其作用机制；方法：通过
砜（ＤＭＳＯ，ＳＩＧＭＡ．Ｉｎｃ）；其它试剂为分析纯；实验用水为超纯水。 １．３仪器Ｓｈｉｍａｄｚｕ ２０Ａ高效液相色谱仪（包括ＤＧＵ．２０Ａ３在线脱气机、ＣＴＯ．２０Ａ柱温箱、 ＳＩＬ．２０Ａ自动进样器、ＬＣ．２０ＡＤ二元高压梯度泵、ＳＰＤ．２０Ａ二极管阵列检测器）；ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ色谱 工作站（日本岛津公司）；ＨＣ．３０１８Ｒ型低温冷冻高速离心机（合肥科大创新股份有限公司）；ＲＰＬ．ＺＤＩＯ 型装柱机（大连日普利科技仪器有限公司）；ＤＭＴ血管张力测量系统（Ｄａｎｉｓｈ ＭｙｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡＩＳ
６．５
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图ｌ
欧前胡素（ＩⅧ）、异欧前胡素
图２欧前胡素（ＩＭＰ）、异欧前胡素 （ＩＳＯ）和尼群地平舒张大鼠脑基底动 脉的量效曲线
（ＩＳＯ）和尼群地平舒张大鼠肠系膜动 脉的量效曲线
２．２细胞膜色谱
＾
Ｏ
１．２药品与试剂尼群地平、欧前胡素和异欧前胡素对照药品购自中国药品生物制品检定所；
甲醇为色谱纯（美国Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ公司）；Ｋｒｅｂｓ液（组成（ｇ／Ｌ）：６．９５４ＮａＣＩ，０．３４３
３，０．１８７ Ｎａｉｌ２Ｐ０４＂２Ｈ２０，Ｏ．１６６ ＣａＣｌ２，０．２４４ ＫＣＩ，１．２６０ＮａＨＣＯ－
Ｍ：ｇＣｌ２・６Ｈ２０，１．０９０葡萄糖，ＰＨ＝７．２￣７．４）；二甲基亚
６１０Ｍ）：
Ｉｎｃ．
１．４欧前胡素和异欧前胡素对离体血管舒张作用的比较将大鼠断颈处死后，取出肠系膜动脉
及脑基底动脉，在预冷的Ｋｒｅｂｓ液中，制成长３ ｒｎｌｎ的血管环标本。血管环标本用细钢丝与ＤＭＴ血 管张力测量系统相连，并连接电脑以记录血管张力的变化。血管环标本平衡于用９５％氧气５％二氧 化碳混合气体饱和的Ｋｒｅｂｓ液中，保持温度在３７℃。调零至血管张力不再有较大变化。调零后，给 予３ ｍＮ预张力，３０ ｍｉｎ内调节预张力至稳定。之后，让血管环标本在３７℃、混合气体饱和的Ｋｒｅｂｓ 液中平衡９０～１２０ ｍｉｎ（其间每隔２０ ｍｉｎ换一次Ｋｒｅｂｓ液）。 平衡时间结束后，将浴槽中的Ｋｒｅｂｓ液定容到６ ｍＬ，用３×１０由ｍｏｌ／Ｌ的ＮＥ使血管收缩。待获 得稳定的收缩反应后，向浴槽中分别依次加入欧前胡素、异欧前胡素的浓度梯度溶液，使浴槽中浓 度依次达到ｌｘｌ０‘一，３ｘ１０４，ｌｘｌ０击，３ｘ１０击，ｌｘｌ０～，３ｘ１０一，ｌｘｌ０‘４ ｍｏｌ／Ｌ，记录血管张力变化。对 照组加入相应浓度梯度的Ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ。以血管的舒张率（％）对药物浓度的对数（１０９ ｃ）作图，即 可得到欧前胡素和异欧前胡素的血管效应曲线。
ｘ
ＰＢＳ溶液洗涤五次后，放置过夜。在２．０×ｌＯ Ｐａ的压力
ｎｌＭ ｐＨ ７．４磷
７
２．０ ｍｍ，Ｉ．Ｄ．）。
１．５．４细胞膜色谱条件流速０．２ ｍＬ・ｍｉｎ～，柱温３７ ｏＣ，进样量５此。流动相为５
胡素３１１
ａｍ。
酸盐缓冲液或三蒸水。３种化合物的紫外检测波长分别为尼群地平２３７ ａｍ，欧前胡素３０１ ａｍ，异欧前 １．５．５置换实验将一定量的钙离子通道拮抗剂尼群地平配置在流动相中，并按浓度由低到高通 过血管平滑肌细胞膜色谱柱，将欧前胡素和异欧前胡素分别进样，以两者保留因子∥对尼群地平浓 度ｃ（ｍｏｌＬ－１）作图，即可得到竞争和置换方面的信息。 １．６分子对接研究１４１利用ＳＹＢＹＬ ７．０软件模拟欧前胡素，异欧前胡素，尼群地平与电压依赖 Ｌ．型钙通道的ａ一１Ｃ亚单位（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｇ４３）的结合方式进行分子对接研究。用ＳＹＢＹ／素描模板对基 板进行构造，并用鲍威尔准则的分子力学方法，并按收敛法则设置在Ｏ．０５千卡／（Ａ摩尔）进行优化， 并用Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ－ＨＯｃｋｅｌ方法进行分配。用Ｓｙｂｙｌ／ＦｌｅｘＸ模板进行对接研究，在ａ．１Ｃ亚基距ＩＲＥＳＳＡ Ａ的残余物被认为是活性中心。在程序中隐含的其他参数保持默认的对接。 ２．结果 ２．１离体血管舒张作用 欧前胡素、异欧前胡素和尼群地平均能舒张大鼠肠系膜动脉和脑基底动脉。对肠系膜动脉，欧 前胡素的最大舒张率（Ｅｍａｘ）和ｐＥＣ５０为９７．３＋１．１％和５．６３士－０．２２；异欧前胡素的Ｅｍａｘ和ｐＥＣ５０为 ９５．７＋０．９％和５．５４士０．１７：尼群地平的Ｅｍａｘ和ｐＥＣ５０为９８．３＋１．４％和８．４３ｉ－０．１４（图１）；对脑基底动脉， 欧前胡素的Ｅｍａｘ和ｐＥＣ５０为５９．６＋３．９％和５．２６：Ｌ－０．１５；异欧前胡素的Ｅｍａｘ和ｐＥＣ５０为６３．７士１４．４％和 ４．９３＋０．２６；尼群地平的Ｅｍａｘ和ｐＥＣ５０８５．０士３．６％和７．９９ａ：０．０８，（图２）。
ｍＬｒａｉｎ‘柱Ⅻ：３７。Ｃ：进样ｍ度：０．０５ ＊涟。
；流速：ｎ２
ｍＬ ｍｍ’：
ｍ样量：５止ｍ自相：ｍ群地ｆ做＊竞争剂的木
柱温３７。ｃ：进样堆度：０ ０５ｍｇｍＬＪ：进样量：
ｏｎ
ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｂｏｔｈ ａｃｔ
ｔｈｅ ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｌ－ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ，ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｍａｙ
ｂｅ ｔｈｅ（ｔ－Ｉ Ｃ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ Ｌ—ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ；Ｉｓｏｉｍｐｅｍｔｏｒｉｎ；Ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ ｅｆｆｅｃｔ；Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
１．５细胞膜色谱研究
１．５．１样品制备精确称量一定量的对照药品，用甲醇溶解，分别配制浓度为２．０ ｍｇ・ｍＬ－１的储备
液，置于４０Ｃ保存；实验前用流动相分别稀释成５０嵋・ｍＬｌ的对照药品溶液，供测试。 １．５．２血管平滑肌细胞膜的制备健康ＳＤ大鼠购自西安交通大学医学院动物中心，重约２５０
ｇ。
断颈处死后，迅速取出胸主动脉，置于预冷的生理盐水中洗尽血污。在显微镜下，剥去附着在胸主 动脉上的脂肪及外膜，并用钝针头破坏内膜，保留白色中膜，即得到血管平滑肌组织【２１。按照文献
欧前胡素（ｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ）和异欧前胡素（ｉｓｏｉｍｐｅｍｔｏｒｉｎ）属于６，７．呋喃香豆素类。近年来，人 们对欧前胡素和异欧前胡素关注较多的是它的舒张血管作用，据报道，欧前胡素引起血管舒张的机 制是抑制了电压依赖性钙通道和受体调节的钙离子的流入和释放１１Ｊ。本实验基于上述研究，通过离 体血管实验对欧前胡素和异欧前胡素舒张血管作用进行初步比较，运用细胞膜色谱技术和分子对接 研究进一步探索欧前胡素和异欧前胡素的舒张血管作用机制。 １．材料和方法 １．１动物雄性ＳＤ大鼠（体重２００－３００９，交大医学院实验动物中心提供）