第二章基因工程

端凸出（ 切点） ② 3’端凸出（如Pst I切点） 端凸出 切点 5’3’5’3’CTGCA G G ACGTC CTGCA G G ACGTC -3’ -5’ -3’ -5’
（2）粘性末端的意义 ） 连接便利 不同的DNA双链： 双链： 不同的 双链 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 同一个DNA分子内连接： 分子内连接： 同一个 分子内连接 通过两个相同的粘性末端可以连接 环形分子。 成环形分子。
Haemophilus influenzae
d 嗜血流感菌d株 嗜血流感菌d
HindⅢ
同一菌株含多个不同的限制性核酸内切酶
四、影响限制性内切酶活性的因素 1. DNA的纯度 的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、乙醇、SDS、EDTA 中的杂质如蛋白质、 乙醇、 中的杂质如蛋白质 、 等都会影响酶的活性。 等都会影响酶的活性。
第二章 基因工程的酶学基础
Enzymes
工具酶种类: 工具酶种类: Restriction endonuclease DNA ligase DNA polymerase DNA prosessing enzyme
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） ） 一类能够识别双链 一类能够识别双链DNA分子中的某种 双链 分子中的某种 特定核苷酸序列（ ），并 特定核苷酸序列（4—8bp），并在相关 ）， 位置切割 双链的核酸内切酶。 位置切割DNA双链的核酸内切酶。 切割 双链的核酸内切酶
①纯化DNA 纯化 ②加大酶的用量 1ugDNA用10U酶 用 酶 ③延长保温时间 扩大反应体积（ ④ 扩大反应体积（ >20µl） µ）
2. DNA的甲基化程度 的甲基化程度 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： 两种甲基化酶修饰质粒 dam甲基化酶： 甲基化酶： 甲基化酶 GATC：AN6--CH3 ： 影响酶： I等 影响酶：BamH I等 dcm甲基化酶 甲基化酶 CCA/TGG：C5--CH3 ： 影响酶： 影响酶：EcoRII等 等
2. III类限制性内切酶 类限制性内切酶
识别位点严格专一（不是回文结构），但 识别位点严格专一（不是回文结构），但 严格专一 回文结构）， 切点不专一，往往不在识别位点内部。 不在识别位点内部 切点不专一，往往不在识别位点内部。反应 需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）,数 腺苷蛋氨酸） 需要 、 （ 腺苷蛋氨酸 数 较少。 量较少。 24-26bp EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。 在基因工程操作中用途不大。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 5’- GATCT 3’-CCTAGA-5’ 3’- CTAGA
Bgl Ⅱ
hybrid site Sau 3A
杂交位点（ 杂交位点（hybrid site）：同尾酶切割 ） 同尾酶切割DNA 产生的末端连接后所形成的新的位点。 产生的末端连接后所形成的新的位点。 焊死：同尾酶产生的粘性末端连接后， 焊死：同尾酶产生的粘性末端连接后，不 能用任何一种酶酶切。 能用任何一种酶酶切。
基因工程中必须使用甲基化酶失活 基因工程中必须使用甲基化酶失活 突变的菌株。 突变的菌株。
3. 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 ，少数要求25-30oC或50-65 oC 大多数是 oC，少数要求 或
酶 最适温 度 oC 酶 最适温 度oC 酶 最适温 度oC
（6）II型限制性内切酶酶解反应的条件 II型限制性内切酶酶解反应的 型限制性内切酶酶解反应的条件 大部分需要相似的反应条件 TrisTris-HCl 50mM pH7.5 MgCl2 10mM 0-50mM 低盐酶 NaCl 00-150mM 50-100mM 中盐酶 50DTT（ DTT（二硫苏糖醇 ）1mM 100-150mM高盐酶 100-150mM高盐酶 Volume 20-100ul 20T 37℃ 37℃ >1 hr
MgCl2、NaCl/KCl： 提供 2+和离子强度； ： 提供Mg +和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； ： 维持 ； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 二硫苏糖醇（ ）：保持酶稳定性； ）：保持酶稳定性 牛血清白蛋白BSA： 保持酶的活性； 牛血清白蛋白 ： 保持酶的活性；
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH， ， What will happen？ ？
二、限制性内切酶的类型 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 三种不同类型的限制性内切酶 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 类限制性内切酶
1. I型限制性内切酶 型限制性内切酶 M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆 和 在 年从大肠杆 菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 株 株分离的。 和 。 （1）识别位点序列 ） 未甲基化修饰的特异序列（不是回文结构） 未甲基化修饰的特异序列（不是回文结构）。 修饰的特异序列 EcoB： TGA(N)8TGCT ： EcoK：AAC(N)6GTGC ：
Apa I Bcl py I 30 BstE II 60
Mae III 55
Ban I 50 Mae I 45 Sma I 25
4. 缓冲液 缓冲液(Buffer)
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 （1）缓冲液的化学组成 ）
（4）同尾酶 ）同尾酶(Isocaudamer） ）
来源不同，识别序列不同，但是切割 来源不同，识别序列不同，但是切割DNA分子所得 分子所得 片段具有相同的粘性末端 的DNA片段具有相同的粘性末端。 片段具有相同的粘性末端。
5’-G GATCC-3’ 5’GATCC BamH I 3’-CCTAG G-5’ 3’5’-A GATCT-3’ 5’GATCT Bgl Ⅱ 3’-TCTAG A-5’ 3’Bcl I Xho Ⅱ 5’-T GATCA-3’ 5’GATCA 3’-ACTAG T-5’ 3’5’-U GATCY-3’ 5’GATCY 3’-YCTAG U-5’ 3’U代表嘌呤；Y代表嘧啶。 代表嘌呤； 代表嘧啶。
（2）（*）活性 ） ）
星号活力（ 条件下， 星号活力（ Star activity）:在非标准条件下， ） 在非标准条件下 切割一些与特异识别序列类似的序列， 特异识别序列类似的序列 切割一些与特异识别序列类似的序列，降低 酶切反应的特异性，这种现象称为酶的星号活性 酶切反应的特异性，这种现象称为酶的星号活性 记作: 记作 EcoRI*
（2）切割位点 ） 距离特异性识别位点约 距离特异性识别位点约400-7000bp，切割序 特异性识别位点 列没有专一性。 列没有专一性。
Recognize site （3）作用机理 ） 400-7000bp
cut
腺苷蛋氨酸）。 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 、 （ 腺苷蛋氨酸 在基因工程操作中不能用。 在基因工程操作中不能用。
Sau 3A
5’- GATC----3’ 5’- GATC----3’ 3’----CTAG -5’ 3’----CTAG
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位 互相结合后形成的 一般(不能 不能or 再被原来的酶识别。 点一般 不能 能？)再被原来的酶识别。 再被原来的酶识别 GATCT GATCT-3’ Bgl Ⅱ 5’-G 5’BamH I A-5’ 3’-CCTAG 3’-
（3）同裂酶（Isoschizomers) ）同裂酶（ 异源同工酶:来源不同，但具有相同的识 异源同工酶 来源不同，但具有相同的识 来源不同 别序列的限制性内切酶 的限制性内切酶。 别序列的限制性内切酶。 完全同裂酶： ① 完全同裂酶： 识别序列和切点完全相同。 识别序列和切点完全相同。 序列 完全相同 Hind Ⅲ Hsu I 5’-A AGCTT-3’ 5’AGCTT3’-TTCGA A-5’ 3’5’5’-A AGCTT-3’ AGCTT3’-TTCGA A-5’ 3’-
EcoR I和BamH I等都有 活性。 等都有*活性 和 等都有 活性。 EcoR I： GAATTC ： 在低盐、 在低盐、高pH（>8）时可识别和切割 （ ） GAATTA、AAATTC、GAGTTC 、 、
5.侧翼序列长短和核苷酸组成 5.侧翼序列长短和核苷酸组成 限制性内切酶具有识别序列的相邻序列 限制性内切酶具有识别序列的相邻序列 效应及位点偏爱。 效应及位点偏爱。 限制性酶作用时， 相邻序列效应 ：限制性酶作用时，要求 识别序列两侧有少数几个核苷酸存在。 少数几个核苷酸存在 识别序列两侧有少数几个核苷酸存在。 限制酶的位点偏爱（ 限制酶的位点偏爱（site preference）： ）： 对不同位置的同一个识别序列表现出不同 同一个识别序列表现出 对不同位置的同一个识别序列表现出不同 的切割效率的现象称作位点偏爱 的现象称作位点偏爱。 的切割效率的现象称作位点偏爱。
（5）识别位点在DNA分子中的频率 识别位点在DNA分子中的频率
假定核苷酸随机排列，四碱基酶大约256个核苷酸 假定核苷酸随机排列，四碱基酶大约 大约256个核苷酸 有一个识别序列， 六碱基的酶大约有 的酶大约有4096个核苷 有一个识别序列，而六碱基的酶大约有4096个核苷 酸有一个识别序列。 酸有一个识别序列。 λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有（ λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有（ 12 ）个 切割位点？ 切割位点？ 理论上有n 理论上有n个核苷酸的识别序列的酶出现概率为 （ 1/4n ）。