第二章基因工程制药分析
合集下载
《基因工程制药》PPT课件
医学PPT
21
一、反转录法
反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的 克隆表达。
cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内 含子。
cDNA:真核基因经过转录后,经过剪切、拼 接、修饰形成的成熟的mRNA，mRNA反转录的 结果为cDNA。
医学PPT
22
第一个合成蛋白质的国家。
医学PPT
10
基因工程药物种类
基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集
落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子; (3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳; (4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤
50%!
医学PPT
8
20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
医学PPT
9
结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有 生物活力的最大的天然有机化合物，使中国成为
维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
医学PPT
11
基因工程药物：采用基因工程技术研制的， 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
医学PPT
12
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目的 基因插入载体，拼接后转入新的宿主细 胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗 传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。
除菌过滤
基因工程制药
以上每题8分 11.名词解释（每词2分）：融合蛋白/启动子/SD序列/pGB-
2/穿梭载体/克隆载体/分泌型表达载体/精确表达载体/基因 工程/PCR/
1. 原核细胞：3种 2. 真核细胞：3种 以上各宿主的特点是什么？
二、大肠杆菌中的外源基因表达
1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的6个必备性质 2. 2个表达载体——pBV220 & pET system 3. 影响目的基因表达的5大因素 4. 真核基因在大肠杆菌的3种表达形式
三、外源基因在酿酒酵母中的表达
粒转化大肠杆菌细胞； d．培养大肠杆菌，让重组质粒
及外源目的基因形成大量拷 贝； e．筛选含重组质粒的大肠杆菌 细胞，进行检查或鉴定。
一般克隆基因的检查和鉴定方法
酶切和电泳方法
琼脂糖凝胶电泳 分离鉴定大小不 等的酶解片段：
磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻
力 ——不同迁移率 分子量标准参照物
限制性酶切位点的序列，即多克隆位点
d．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒
pUC118 质粒的 多克隆位 点整合在lacZ基因中，该位点 如果没有插入外源目的基因， lacZ基因便可表达出半乳糖 苷酶，如果平板培养基中含有 IPTG 和 X-gal ， X-gal 便 会 被 半乳糖苷酶水解成兰色，大肠 杆菌形成蓝色克隆。
质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一 个质粒可以大量增加其拷贝数。
细菌质粒pUC18
a．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 b．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复
制形成大约500个拷贝。 c．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种
2/穿梭载体/克隆载体/分泌型表达载体/精确表达载体/基因 工程/PCR/
1. 原核细胞：3种 2. 真核细胞：3种 以上各宿主的特点是什么？
二、大肠杆菌中的外源基因表达
1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的6个必备性质 2. 2个表达载体——pBV220 & pET system 3. 影响目的基因表达的5大因素 4. 真核基因在大肠杆菌的3种表达形式
三、外源基因在酿酒酵母中的表达
粒转化大肠杆菌细胞； d．培养大肠杆菌，让重组质粒
及外源目的基因形成大量拷 贝； e．筛选含重组质粒的大肠杆菌 细胞，进行检查或鉴定。
一般克隆基因的检查和鉴定方法
酶切和电泳方法
琼脂糖凝胶电泳 分离鉴定大小不 等的酶解片段：
磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻
力 ——不同迁移率 分子量标准参照物
限制性酶切位点的序列，即多克隆位点
d．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒
pUC118 质粒的 多克隆位 点整合在lacZ基因中，该位点 如果没有插入外源目的基因， lacZ基因便可表达出半乳糖 苷酶，如果平板培养基中含有 IPTG 和 X-gal ， X-gal 便 会 被 半乳糖苷酶水解成兰色，大肠 杆菌形成蓝色克隆。
质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一 个质粒可以大量增加其拷贝数。
细菌质粒pUC18
a．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 b．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复
制形成大约500个拷贝。 c．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种
2-基因工程制药技术(1)
一 质粒载体
细菌质粒 (plasmid) 载体是基因工程 中 最常用的载体, 它必须包括三种组成部分： 复制必须区，选择标记基因和限制性核酸 内切酶的酶切位点(多克隆位点，MCS).
• 多克隆位点（multiple cloning site, MCS），是 包含多个（一般大于20个） 限制性酶切位点 （restriction site）的一段 很短的DNA序列。也称为 多位点接头（polylinker）， 是基因工程中常用到的载 体质粒的标准配置序列。 MCS中，每个限制性酶切 位点通常是唯一的，即它
其中最为重要的酶是能在特异性的碱基序列部位
切割DNA分子的限制性核酸内切酶以及能将两条
DNA分子或片段连接起来的DNA连接酶。
一 限制性内切酶
限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列, 并在识
别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 限制酶是一类专一性很强的核酸内切酶。 （一）限制酶的类型 分为三种类型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型酶 Ⅱ型限制酶对于基因工程中DNA操作是极为重要的
4 白细胞介素 药理作用：免疫调节 IL-2具有增强和调节人体免疫功能和抗病毒作用。 价格：每支100元以上 5 集落刺激因子 药理作用：刺激白细胞的上升 肿瘤放化疗或者白血病化疗后针对白细胞减少的症状,减少放化疗后因 身体抵抗力下降而产生感染危险。 价格：每支300元以上
6 红细胞生成素 适应症：用于慢性肾衰性贫血，也用于多发性骨髓瘤相关的贫血和骨 髓增生异常及骨癌引起的贫血。对结缔组织病（类风湿关节炎和红斑 狼疮）所致的贫血，也有效。
第二章 基因工程制药技术
• 基因工程（genetic engineering) 是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是 将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使 这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达 的操作。
第二章 基因工程制药.ppt
2019-10-13
谢谢你的关注
五、重组蛋白质的分离纯化
1. 离子交换层析：
是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。
6. 降低成本，提高产品质量。
2019-10-13
谢谢你的关注
二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
2019-10-13
谢谢你的关注
2019-10-13
谢谢你的关注
1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3．费用较高
2019-10-13
谢谢你的关注
V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。
2019-10-13
谢谢你的关注
Vitamin A
2019-10-13
谢谢你的关注
第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
2019-10-13
谢谢你的关注
一、反转录法
1．mRNA的纯化
（1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
（2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子
第二章基因工程制药
n 其基因组小，世代时间短，有单倍体 双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
n 能外分泌，产物可糖基化。 n 已有不少真核基因成功表达。
第二章基因工程制药
丝状真菌
n 有很强的蛋白质分泌能力。 n 能正确进行翻译后加工。 n 糖基化方式与高等真核生物
相似。
第二章基因工程制药
哺乳动物细胞
n 优点：表达产物可由重组转化 细胞分泌到培养液中，纯化容 易。产物是糖基化的接近天然 物。
n 或转化感受态大肠杆菌使质粒进 入细胞内。
第二章基因工程制药cDNA的鉴定n 根据重组体的表型进行筛选，主要 有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑 颜色改变法。
n 然后采用凝胶电泳、分子杂交、 DNA序列分析测定等方法进行进 一步筛选和鉴定。
第二章基因工程制药
目的c核酸探针杂交法：用层析和高分辨电泳等技术纯
酸二酯键，故能分解 RNA/DNA杂交体系 中的RNA链。该酶 不能消化单链或双链
DNA。
第二章基因工程制药
cDNA第二链的合成
n 此反应是在DNA聚合酶I催化下完 成的。核酸酶S1专一性切除单链 DNA，因此用它可以切除发夹结 构。
n 发夹结构结构切除后，双链cDNA 分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电 泳进行测定。
n 基因工程中基因高效表达研究是指外 源基因在某种细胞中的表达活动，即 剪切下外源基因片段，拼接到另一个 基因表达体系中，使其能获得原生物 活性又可高产的表达产物。
第二章基因工程制药
什么是最佳的基因表达体系 n 目的基因的表达产量高 n 表达产物稳定 n 生物活性高 n 表达产物容易分离纯化
第二章基因工程制药
第二章基因工程制药
克隆真核基因的方法 逆转录法 化学合成法
n 能外分泌，产物可糖基化。 n 已有不少真核基因成功表达。
第二章基因工程制药
丝状真菌
n 有很强的蛋白质分泌能力。 n 能正确进行翻译后加工。 n 糖基化方式与高等真核生物
相似。
第二章基因工程制药
哺乳动物细胞
n 优点：表达产物可由重组转化 细胞分泌到培养液中，纯化容 易。产物是糖基化的接近天然 物。
n 或转化感受态大肠杆菌使质粒进 入细胞内。
第二章基因工程制药cDNA的鉴定n 根据重组体的表型进行筛选，主要 有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑 颜色改变法。
n 然后采用凝胶电泳、分子杂交、 DNA序列分析测定等方法进行进 一步筛选和鉴定。
第二章基因工程制药
目的c核酸探针杂交法：用层析和高分辨电泳等技术纯
酸二酯键，故能分解 RNA/DNA杂交体系 中的RNA链。该酶 不能消化单链或双链
DNA。
第二章基因工程制药
cDNA第二链的合成
n 此反应是在DNA聚合酶I催化下完 成的。核酸酶S1专一性切除单链 DNA，因此用它可以切除发夹结 构。
n 发夹结构结构切除后，双链cDNA 分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电 泳进行测定。
n 基因工程中基因高效表达研究是指外 源基因在某种细胞中的表达活动，即 剪切下外源基因片段，拼接到另一个 基因表达体系中，使其能获得原生物 活性又可高产的表达产物。
第二章基因工程制药
什么是最佳的基因表达体系 n 目的基因的表达产量高 n 表达产物稳定 n 生物活性高 n 表达产物容易分离纯化
第二章基因工程制药
第二章基因工程制药
克隆真核基因的方法 逆转录法 化学合成法
生物制药技术-第二章-基因工程制药(10,11小节)
2.化学破碎法
化学破碎细胞的方法主要有渗透冲击、增溶法和脂溶 法等，是-类利用化学试剂改变细胞壁 或细胞膜的结 构或完全破除细胞壁形成原牛质体后，在渗透压作用 下使细胞膜破裂而释放胞内 物质的方法。它们的作用 机制因所用化学试剂不同而异。化学渗透法比机械破 碎的选择性高， 胞内产物的总释放率低.特别是可有 效地抑制核酸的释放，料液数度小，有利于后处理过 程。但是，化学渗透法比机械破碎法速度低，效率差， 并且化学试剂的添加形成新的污染，给进一步的分 离 纯化增添麻烦。
(2)增溶法
增溶法是利用表面活性剂等化学试剂的增i在作用，增加细胞壁和 膜的通透性使细胞破碎的 方法。表面活性剂有阴离子型、阳离子 型和非离子型三种，均为两性分子，含有亲水基团和疏水 基团， 因此既能与水作用又能与脂作用.溶解细胞壁和膜上的脂蛋白，使 细胞的通透性增加，释放 出胞内物质。常用的表面活性剂有阴离 子型的SDS(十二烧基硫酸钠)、非离子型的Triton X→100等。有 些有机溶剂如乙醇、异丙醇、尿素和盐酸服等也能作用于膜蛋白， 削弱其疏水相互作用，而改变细胞壁和膜的通透性。如异丙醇广 泛应用于从胶木分离蛋白酶的细胞破碎工艺中。 EDTA作为金属 螯合剂，可用来处理革兰氏阴性菌(如大肠杆菌).对其细胞的外层 膜有破坏作 用。革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠2价阳离子 Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或 Mg2+螯合，大量脂多糖分子将脱落，使外层膜出现洞穴。这些区 域由内 层膜的磷脂来填补导致该区域通透性增强。
4.产品质量要求
产品质量要求主要包括产品质量
指标.产品用途，对纯度、生物活 性、比活的要求。允许的杂 质种 类和最大允许含量.特殊杂质的种 类和最大允许茧，以及对使用的 影响。产品剂型、贮存稳定性。
第二章 基因工程制药
溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。
基因工程技术的应用特点
基因工程技术的最大好处：能从极端复杂的机体
细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切
拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，
从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白
质。
基因工程制药的优点
1. 大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽 2. 提供足够数量的生理活性物质
4.cDNA克隆
用于cDNA克隆的载体
质粒DNA：如pUC、pBR322 噬菌体DNA：如gt10、 gt11
表达型载体
载体的选择依据之一 载体的选择依据之二： cDNA插入片段小于10kb---质粒载体 大于10kb---噬菌体载体 非表达型载体
cDNA片段与载体的连接
加同聚尾连接:用DNA末端转移酶，在载体和cDNA的3’
大肠杆菌表达外源基因的优势 大肠杆菌表达外源基因的劣势
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放阅读框 基因克隆表达系统成熟完善
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
② 真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细 胞等。 1.原核细胞 （1）大肠杆菌 表达产物的形式：细胞内不溶性表达(包含体)、胞内 可溶性表达、细胞周质表达，极少数情况下也可分泌 到细胞外。不同的表达形式具有不同的表达水平及完 全不同的杂质。
大肠杆菌中表达的特点： A、大肠杆菌中的产品多为胞内产物，提取时需破 碎细胞，导致细胞质内其他蛋白质也释放出来，
第二章 基因工程制药
• 探寻具治疗作用的新基因备用基因工程药 物
• 我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。 α 1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有 国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计 划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。 目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研 究开发中的也有10余种。
同裂酶（Isoschizomers)
• 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 Ⅰ. 完全同裂酶：
– 识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ和Hsu I
Ⅱ. 不完全同裂酶：
– 识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和Sma
同尾酶（Isocaudamers)
8、限制性内切酶对DNA的消化
• 内切酶与识别序列的结合模式
（4）短时间培养转化 细胞，以扩增 DNA重 组分子或使其整合到 受体细胞 的基因组中 （简称“增”）；
（5）筛选和鉴定转 化细胞，获得使外 源基因高效表达的 基因工程菌或细胞 （简称“检”）；
基因工程关键要素
• • • • 工具酶与载体系统 目的基因的获得 基因的重组与转移 克隆基因导入宿主细胞表达
连接反应的机理
连接反应的温度
• 连接酶反应的最佳温度37 ℃。但在37℃ 下 粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用 14 ～16 ℃。
影响连接反应的因素
1. 插入片段与载体的浓度比例： 10~20倍。
– 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自 我连接的现象。
2. 反应温度：一般14~16℃
（三）DNA聚合酶
第二节
基因工程的工具酶与载体
一、工具酶
• 常用的工具酶：
基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
第二章-基因工程制药_PPT幻灯片
传统生物药物由于来源及制备上的困难、价 格等因素的影响，此外在制备过程可能受到 的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、 疗效可靠的新方法来制备生物药物。基因工 程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的 优势。
应用基因工程技术可十分方便且有效地解决 上述提到的问题，从量、质上都可以得到改 进，且可以创造的基因：所谓目的基因就是我们想要的基因片段，它在生物体 内能表达产生所要蛋白产物。
生物界的基因有上亿个，多数存在于染色体上，少数存在于 细胞质中。取得目的基因的办法是用“分子剪刀”剪切供体DNA 分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所 需目的基因的DNA片段。到目前为止，人们用这种方法已分离出 40种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。另一种获得目的 基因的方法是人工合成，即基因模版合成。
基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因
组建重组质粒
构建基因工程 菌或细胞
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
培养工程菌
成品检定 包装
基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成；
下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的 大规模培养一直到产品的分离纯化、质量 控制等。
2、cDNA第一链的合成
一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为 引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP；在 凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小， 探索最佳反应条件。
3、cDNA第二链的合成
先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交 链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二 链。由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形 结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。此 反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性 切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结 构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖 凝胶电泳进行测定。
第二章 基因工程制药
2019-5-18
谢谢观赏
一、宿主菌的选择
2．真核细胞
（1）酵母：无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之 成为理想的宿主。
（2）丝状真菌：肽剪切、糖基化。 （3）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低。
2019-5-18
谢谢观赏
二、大肠杆菌中的基因表达
1．载体
表达载体必须具备下列条件：
①载体能独立复制 ②具有多克隆（MCS）位点和标记基因 ③具有很强的启动子 ④具有调节基因 ⑤具有很强的终止子 ⑥具有产生带有SD序列和AUG的mRNA的能力
2019-5-18
谢谢观赏
二、大肠杆菌中的基因表达
3．表达形式 （1）融合蛋白，增强稳定性。 （2）非融合表达。
2019-5-18
谢谢观赏
三、酵母中的基因表达
1．载体 ①YEP类（酵母附加体质粒） 由大肠杆菌质粒，2μm质粒和Trp或URA3组成， ARS来自2μm质粒。 ②YRP（酵母复制型质粒） ARS来自染色体DNA、TrP1、URA3双标及大肠杆菌质粒。 ③YCP（酵母着丝粒型质粒） 除具有YRP元件外，还具有着粒成份。
表皮生长因子、凝血因子； 3. 激素，如胰岛素、生长激素、心钠素； 4. 酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激
活剂、超氧化物歧化酶等。
2019-5-18
谢谢观赏
Vitamin A
2019-5-18
谢谢观赏
第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
2019-5-18
谢谢观赏
酶切、 测序
阅读
计算机辅助分析
2019-5-18
谢谢观赏
二、化学合成法
优点：准确性高、人工接头、改进、利用 局限性：
第二章基因工程制药part1
5 将重组体导入宿主细胞 体外包装的重组体感染受态宿主细胞。
2020/6/28
17
二、目的基因的获得6 cDNA的鉴定 cDNA是指细胞中全部mRNA反转录成
cDNA并被克隆的总各。根据重组体的表型进行 筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜 色改变法。然后采取凝胶电泳、分子杂交、DNA 序列分析法等方法进行进一步筛选和鉴定。
2020/6/28
18
二、目的基因的获得
7 下列两种方法：1 核酸探针杂交法；2 免疫反应鉴定 法。
2020/6/28
19
二、目的基因的获得
目的克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学 合成法：
Ⅱ反转录-聚合酶链反应法
1985年聚合酶链反应（PCR）创立后，人们将它与反
一、宿主细胞的选择
原核细胞
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌
酵母
真核细胞 丝状真菌
2020/6/28
哺乳动物细胞 26
外源基因在大肠杆菌中的表达
2020/6/28
27
外源基因在大肠杆菌中的表达
表达载体必须具备的条件
1. 载体能够独立的复制 2. 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克
隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基 因得以表达 1. 3. 具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合 2. 酶所识别 3. 4. 具有很强的阻遏子，使启动子受到控制，只有 4. 当诱导时才能进行转录
A 不能合成太长的基因。最长50-60bp。只适用于克隆小
分子肽的基因。
B 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来
困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能
与天然基因不完全一致，易造成中性突变。
2020/6/28
17
二、目的基因的获得6 cDNA的鉴定 cDNA是指细胞中全部mRNA反转录成
cDNA并被克隆的总各。根据重组体的表型进行 筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜 色改变法。然后采取凝胶电泳、分子杂交、DNA 序列分析法等方法进行进一步筛选和鉴定。
2020/6/28
18
二、目的基因的获得
7 下列两种方法：1 核酸探针杂交法；2 免疫反应鉴定 法。
2020/6/28
19
二、目的基因的获得
目的克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学 合成法：
Ⅱ反转录-聚合酶链反应法
1985年聚合酶链反应（PCR）创立后，人们将它与反
一、宿主细胞的选择
原核细胞
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌
酵母
真核细胞 丝状真菌
2020/6/28
哺乳动物细胞 26
外源基因在大肠杆菌中的表达
2020/6/28
27
外源基因在大肠杆菌中的表达
表达载体必须具备的条件
1. 载体能够独立的复制 2. 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克
隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基 因得以表达 1. 3. 具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合 2. 酶所识别 3. 4. 具有很强的阻遏子，使启动子受到控制，只有 4. 当诱导时才能进行转录
A 不能合成太长的基因。最长50-60bp。只适用于克隆小
分子肽的基因。
B 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来
困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能
与天然基因不完全一致，易造成中性突变。
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
节蛋白、酶类等人体活性多肽）以及某些疫苗，由
于材料来源困难或者制造技术问题而无法研制出产
品而付诸应用。
2. 从动物脏器中提取出来（比如动物脑垂体中的一
些肽类激素，包括肾上腺皮质激素、催产素起引产
或催产作用，胃肠道类激素缓激肽等），也因造价
2021/4/1 太高，或来源困难第二而章基供因不工程应制药求分。析
基因工程药物下游阶段？
从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质
量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，
主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生
物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离
纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感
器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优
2021/4化/1 控制等。
15
二、目的基因的获得
4 cDNA克隆
用于cDNA的克隆载体有
两类：质粒DNA（如pUC、
pBR322等）和噬菌体DNA
（如λgt10、λgt10）等。根据
重组后插入的cDNA是否能够
表达、能否经转录和翻译合成
蛋白，又将载体分为表达型载
体和非表达型载体。在DNA克
隆操作中应根据不同的需要选
20择21/4适/1 当的载体。
9
一、概 述
基因工程技术的特点
1. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床 使用提供有效的保障；
2. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结 构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；
3. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物 质；
4. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可 以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；
液和蒸馏水的情况下，mRNA
被洗脱下来，经过两次寡聚
（dt）纤维素柱后，可得到较
20高21/4纯/1 度的mRNA。 第二章基因工程制药分析
13
二、目的基因的获得
2 cDNA第一链的合成
一般mRNA都带有3‘poly A，所以可用寡聚dT 作为引物，在逆转录酶的 催化下，开始cDNA链的 合成。一次好的逆转录可 使寡聚dT选出的mRNA有 5%~30%被拷贝。
第二章基因工程制药分析
5
一、概 述
制备基因工程药物的一般程序
获得目的基因 组建重组质粒
构建基因工程菌（或细菌）
培养工程菌
除菌过滤
半成品检定
2021/4/1
包装 第二章制药存在的问题
1. 许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内
源性活性物质（如激素、细胞因子、神经多肽、调
52.021利/4/1用基因工程技术可第以二章获基得因工新程制型药化分析合物，扩大药物筛选来10源
二、目的基因的获得
来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因， 是不能进行直接分离的，原因有二：
1. 从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。 2. 原核细胞不能直接克隆真核基因。
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
11
二、目的基因的获得
目的克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学 合成法：
Ⅰ 逆转录法
DNA序列不含内含子
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
12
二、目的基因的获得
1 mRNA的纯化
利用mRNA的3’末端含有
polyA的特点，在RNA流经寡 聚（dt）纤维素柱时，在高盐 缓冲液的作用下，mRNA被特 异地结合在柱上，当逐渐降低 盐的浓度洗脱时，或在低盐溶
第二章基因工程制药分析
16
二、目的基因的获得
5 将重组体导入宿主细胞 体外包装的重组体感染受态宿主细胞。
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
17
二、目的基因的获得6 cDNA的鉴定 cDNA是指细胞中全部mRNA反转录成
cDNA并被克隆的总各。根据重组体的表型进行 筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜 色改变法。然后采取凝胶电泳、分子杂交、DNA 序列分析法等方法进行进一步筛选和鉴定。
3
一、概 述---几个概念
基因工程药物上游阶段？
主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）目的 基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基 因表达主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次 是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在 实验室内完成。
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
4
一、概 述---几个概念
7
一、概 述
传统制药存在的问题
3. 由于免抗原等缘故（由于酶的相对分子量较大，对 人体可能具有抗原性，因此动物酶如作为注射用药 要经过大量的药理实验），使他们在使用上受到限 制。
4. 在提取过程中难免有病毒感染，因此还可能会对病 人造成严重后果。
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
8
一、概 述
基因工程药物？
系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋
白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因分离、纯
化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最
后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，
并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白
质，通过这种方法生产的新型药物。
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
基因工程技术的特点
就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量 获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存 在的全新物质。它能从极端复杂的机体细胞内取出所 需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合， 然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多 数百、数千倍的相应的蛋白质。
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
第二章 基因工程技术制药
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
1
一、概 述---几个概念
基因工程技术？
是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入 新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新 组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技 术。
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
2
一、概 述---几个概念
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
14
二、目的基因的获得
3 cDNA第二链的合成
先用碱解或RHase酶解的 方法除去cDNA-mRNA杂交链 中的mRNA链，然后以cDNA 第一链为模板合成第二链。双 链cDNA分子的大小常用变性 琼脂糖凝胶电泳进行测定。
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
2021/4/1
第二章基因工程制药分析
18
二、目的基因的获得