两种3_5_环核苷酸磷酸二酯酶的制备及活性测定

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核酸分解及核苷酸代谢A

作用：植物和微生物，只水解核糖核苷
2.嘌呤的分解
嘌呤分解产物尿素植物大量存在代谢中产物如尿囊素和尿囊酸等
人类、灵长类、爬行类、鸟类
NH 2 N
N
N H
N
氨
尿酸
微生物
鱼类、两栖类、人类（少）
鱼类、两栖动物、海洋无脊椎动物
氨、二氧化碳、有机酸（甲酸、乙酸、乳酸等）
尿酸生成
人体嘌呤代谢
部位主要肝脏、小肠、肾脏
名称：N-羟-N-甲酰甘氨酸，hadacidin 结构：类似天冬酰胺作用：抑制腺苷酸琥珀酸合成酶的活性，
阻止腺苷酸琥珀酸的生成，阻止核酸合成，抗癌！结果：未用于临床，对肝、肾的毒副作用大
⑶鸟嘌呤核苷酸的合成黄嘌呤核苷酸经氨基化成鸟嘌呤核苷酸。
NAD
NADH2
谷氨酰胺
谷氨酸
IMP
①
H2O
XMP
是否斜体？
Ⅱ.核苷酸的降解 1.核苷酸的水解
核苷酸+H2O→核苷+磷酸
酶
名称：总称磷酸单酯酶， 2'，3'，5'-Pi 存在：广泛存在
核苷酸酶：水解3'，5'-Pi 的磷酸单酯酶！
核苷+磷酸←→碱基+戊糖-1-磷酸核苷磷酸化酶存在广泛，反应可逆。
核苷+H2O→碱基+戊
酶
名称：核苷酶或核苷糖水解酶
大多数产生粘末端。
适应
可能是细菌的免疫防御，抵抗外来分子侵袭，相当于免疫细胞。
限制性内切酶是分子生物学研究的重要工具酶
属名＋种名＋株名+类别
命名
Eco RⅠ
E：大肠杆菌（Escherichia coli）的属名

wzc核酸习题

核酸化学习题一、名词解释1.核苷（nucleoside）:是由嘌呤或嘧啶碱基通过共价键与戊糖连接组成的化合物。

核糖与碱基一般都是由糖的异头碳与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9之间形成的β-N-糖苷键连接的。

2.核苷酸（nucleotide）：核苷的戊糖成分中的羟基磷酸化形成的化合物。

3.cAMP（cyclic AMP）:3ˊ,5ˊ-环腺苷酸，细胞内的第二信使，由于某些激素或其它分子信号刺激激活腺苷酸环化酶催化ATP环化形成的。

4.磷酸二酯键（phosphodiester linkage）：一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇（羟基）酯化形成的两个酯键。

该酯键成了两个醇之间的桥梁。

例如一个核苷的3ˊ羟基与另一个核苷的5ˊ羟基与同一分子磷酸酯化，就形成了一个磷酸二酯键。

5.脱氧核糖核酸（DNA , deoxyribonucleic acid）:含有特殊脱氧核糖核苷酸序列的聚脱氧核苷酸，脱氧核苷酸之间是通过3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键连接的。

DNA是遗传信息的载体。

6.核糖核酸（RNA , ribonucleic acid）:通过3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键连接形成的特殊核糖核苷酸序列的聚核糖核苷酸。

7.查格夫法则（Chargaff's rules）：所有DNA中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含量相等，（A＝T），鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔含量相等（G＝C），即嘌呤的总含量与嘧啶的总含量相等（A＋G＝T＋C）。

DNA的碱基组成具有种的特异性，但没有组织和器官的特异性。

另外生长发育阶段、营养状态和环境的改变都不影响DNA的碱基组成。

8.DNA双螺旋(DNA double helix)：一种核酸的构象，在该构象中，两条反向平行的多核苷酸链围绕彼此缠绕形成一个右手的双螺旋结构。

碱基位于双螺旋内侧,磷酸与糖基在外侧，通过磷酸二酯键相连,形成核酸的骨架。

碱基平面与假想的中心轴垂直,糖环平面则与轴平行。

两条链皆为右手螺旋。

双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm，两核苷酸之间的夹角是36°，每对螺旋由10对碱基组成，碱基按A-T, G-C配对互补，彼此以氢键相连系。

植物五种酶活性检测方法

植物五种酶活性检测方法Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。

1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。

取200ml初酶液，加入L柠檬酸-磷酸盐缓冲液200uL,混合反应液（L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素终止反应，460nm波长测吸光度。

对照为不加邻苯二酚的反应混合液。

酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加为一个活性单位。

2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定称取新鲜样品于预冷研钵中，加入6ml L（）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。

混匀后在4℃冰箱中浸提4h。

4℃10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液。

取酶提取液，加入由硼酸钠缓冲液配制的L L-苯丙氨酸，蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。

PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化为一个活力单位。

3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定取新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。

3,5核苷酸磷酸二酯酶

3,5核苷酸磷酸二酯酶英文回答：3,5-nucleotide phosphodiesterase is an enzyme that plays a crucial role in the metabolism of nucleotides. It is responsible for breaking down the phosphodiester bonds in nucleic acids, specifically in DNA and RNA molecules. This enzymatic activity is essential for various cellular processes, including DNA replication, RNA transcription, and nucleotide recycling.The 3,5-nucleotide phosphodiesterase enzyme acts by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bond between the 3' carbon and the 5' carbon of adjacent nucleotides. This results in the release of a phosphate group and the formation of a free 3'-OH group and a 5'-phosphate group. This enzymatic reaction is crucial for the degradation of nucleic acids and the recycling of nucleotides for further cellular processes.The activity of 3,5-nucleotide phosphodiesterase is tightly regulated in cells to maintain proper nucleotide balance and prevent excessive nucleotide degradation. Dysregulation of this enzyme can lead to various pathological conditions, including cancer, neurodegenerative diseases, and immune disorders.In addition to its role in nucleotide metabolism, 3,5-nucleotide phosphodiesterase also plays a role in signal transduction pathways. It can modulate the levels of intracellular cyclic nucleotides, such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP), which are important second messengers involved in numerous cellular signaling processes.Overall, 3,5-nucleotide phosphodiesterase is a critical enzyme involved in nucleotide metabolism and cellular signaling. Its activity is essential for maintaining nucleotide homeostasis and proper cellular function.中文回答：3,5-核苷酸磷酸二酯酶是一种在核苷酸代谢中起关键作用的酶。

环化核苷酸的功能研究进展

综述生命科学仪器 2023年第21卷/第5期8作者简介:李钊(1998),男,E -m a i l :3120201405@b i t .e d u .c n㊂通讯作者:高昂(1983),女,博士,北京理工大学,教授,E -m a i l :a n g .g a o @b i t .e d u .c n ㊂基金项目:国家自然科学基金项目(32171219)环化核苷酸的功能研究进展李钊高昂*(北京理工大学生命学院,分子医学与生物诊疗工业和信息化部重点实验室,北京100081)摘要环化核苷酸是由一个或多个核苷单磷酸通过磷酸二酯键形成的环状二酯小分子,其作为信号转导分子在调节细胞代谢㊁转录调控㊁细胞生长等生理功能中发挥着重要作用㊂最新研究发现多种类型的环化核苷酸分子能够激活后生动物的固有免疫反应和细菌的抗噬菌体防御系统㊂本文总结了目前发现的环化核苷酸种类,对其功能机制的研究进展做了简要综述,并提出了目前所存在的问题以及潜在开发方向㊂关键词环化核苷酸;信号通路调控;固有免疫;适应性进化R e s e a r c h P r o g r e s s o n t h e F u n c t i o n o f C yc l i c N u c l e o t ide s L I Z h a o ,G A O A n g*(S c h o o l o f L i f e S c i e n c e ,B e i j i n g I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y ,K e y L a b o r a t o r y o f Mo l e c u l a r M e d i c i n e a n d B i o d i a g n o s i s ,M i n i s t r y o f I n d u s t r y a n d I n f o r m a t i o n T e c h n o l o g y ,B e i j i n g ,100081)ʌA b s t r a c t ɔC y c l i c n u c l e o t i d e s a r e c y c l i c d i e s t e r s m a l l m o l e c u l e s f o r m e d b y o n e o r m o r e n u c l e o t i d e m o n o p h o s ph a t e s t h r o u g h p h o s p h o d i e s t e r b o n d s .A s s i g n a l t r a n s d u c t i o n m o l e c u l e ,t h e y p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n m a n y p h y s i o l o gi c a l f u n c t i o n s i n c l u d i n g c e l l m e t a b o l i s m ,t r a n s c r i p t i o n r e g u l a t i o n a n d c e l l gr o w t h .T h e l a t e s t r e s e a r c h h a s f o u n d t h a t v a -r i o u s t y p e s o f c y c l i c n u c l e o t i d e m o l e c u l e s c a n a c t i v a t e t h e i n n a t e i mm u n e r e s p o n s e o f m e t a z o a n s a n d t h e a n t i -p h a ge d ef e n s e s y s t e m o f b a c t e r i a .T h i s a r t i c l e s u mm a r i z e s t h e t y p e s o f c y c l i c n u c l e o t i d e s d i s c o v e r e d s o f a r ,b r i e f l yr e v i e w s t h e r e s e a r c h p r o g r e s s o f t h e i r f u n c t i o n a l m e c h a n i s m s ,a n d p u t s f o r w a r d t h e c u r r e n t p r o b l e m s a n d p o t e n t i a l d e v e l o p-m e n t d i r e c t i o n s .ʌK e y wo r d s ɔc y c l i c n u c l e o t i d e s ;r e g u l a t i o n o f s i g n a l p a t h w a y ;i n n a t e i mm u n i t y ;a d a p t i v e e v o l u t i o n 中图分类号:Q 93 文献标识码:A D O I :10.11967/2023211002引言近些年发现,环化核苷酸作为第二信使分子参与调控多项生理活动㊂环化核苷酸主要以环状单磷酸核苷酸和环状寡核苷酸两种形式存在于生物体内㊂目前已知的环状单磷酸核苷酸c AM P ㊁c GM P 在生物体内的代谢㊁转录调控㊁视觉信号等生理过程中起着重要的信号转导作用;3'3'-c -d i -AM P ㊁3'3'-c -d i -GM P ㊁2'3'-c G AM P 等环状寡核苷酸参与调控包括核糖开关㊁基因转录㊁细菌运动性㊁生物膜的形成和固有免疫等生理活动㊂环化核苷酸及其下游信号通路的研究,极大地推动了疫苗等相关临床药物的研发,拓展了免疫疗法的应用㊂例如固有免疫反应中2'3'-c G AM P 的发现,引发了对固有免疫反应激动剂的研究,一系列环化核苷酸类激动剂和纳米药物被研发用于治疗病原体感染和肿瘤等疾病㊂因此,对于环化核苷酸的研究具有重要的理论价值和应用前景㊂本文基于目前对于环化核苷酸的研究,系统总结了其多样性以及在生物体内的调控机制㊂1 环状单磷酸核苷酸环状单磷酸核苷酸通常由核苷酸分子的磷酸部分与核糖部分第三位碳原子的羟基脱水缩合形成一个环状的核苷酸(图1)㊂目前在生物体内发现了四种环状单磷酸核苷酸:c AM P ㊁c GM P ㊁c C -M P ㊁c UM P ㊂其中,c AM P 与c GM P 参与调控体内代谢㊁基因转录等多项生理活动;c C M P 与c UM P 能够激活细菌抗噬菌体系统㊂图1 环状单磷酸核苷酸合成图生命科学仪器 2023年第21卷/第5期综述9F i g .1S y n t h e s i s o f c y c l i c n u c l e o t i d e m o n o p h o s ph a t e s 1.1 环状单磷酸腺苷环状单磷酸腺苷(C yc l i c ade n o s i n e m o n o p h o s ph a t e ,c AM P )作为第一个被发现的第二信使,E a r l W.S u t h e r l a n d 在它的基础上提出第二信使学说,更新了对细胞内信号传导系统的理解[12]㊂c AM P 在动植物和微生物中含量很少,主要参与c AM P -P K A 信号转导通路[1]:当细胞中的激素或神经递质作为配体与细胞膜上的G 蛋白偶联受体(G p r o t e i n-c o u p l e d r e c e pt o r s ,G P C R s )结合后,G P C R s 会释放G 蛋白的亚基与腺苷酸环化酶(A d e n y l y l c yc l a s e ,A C )结合㊂A C 被激活后会催化A T P 脱去一个焦磷酸生成c AM P ,c AM P 进一步激活c AM P 依赖蛋白激酶A (P K A )㊂P K A 在未被激活的状态下是由两个催化亚基和两个调节亚基组成的四聚体,c AM P 与调节亚基结合后会改变P K A 的构象,使调节亚基和催化亚基发生解离,催化亚基进而磷酸化不同功能的靶蛋白,进而调控生长发育㊁调节转录调控㊁细胞血糖水平等生理活动(图2),最终c AM P 被磷酸二酯酶(P D E )水解为AM P 而终止c AM P 所传导的生理信号㊂除了c AM P-P K A 途径外,c AM P 直接调控E p a c (E x c h a n g e p r o t e i n d i r e c t l y a c t i v a t e d b y c AM P ),参与调控细胞增殖㊁分化与凋亡[17];c AM P 还可以激活环核苷酸门控离子通道(C yc l i c n u c l e o t ide -g a t e d c h a n n e l ,C N G ),在激活状态时可以允许阳离子非选择性通过,进而调节神经元活动[18]㊂1.2 环状单磷酸鸟苷环状单磷酸鸟苷(C yc l i c g u a n o s i n e m o n o p h o s ph a t e ,c GM P ),在c AM P 被鉴定的几年后在哺乳动物组织和体液中被证实存在㊂鸟苷酸环化酶分为可溶性鸟苷酸环化酶(S o l -u b l e g u a n y l y l c yc l a s e s ,s G C )和膜结合鸟苷酸环化酶(P a r t i c u l a t e g u a n y l y l c y c l a s e s ,pG C )两种,二者被激活后催化G T P 脱去一个焦磷酸生成c GM P ,不同类型的鸟苷酸环化酶产生的c GM P 决定其调节不同信号通路,c GM P 分子最终被P D E 水解而终止信号㊂细胞内的P D E 有多种亚型,c GM P 可通过激活或抑制P D E 2/3以调节细胞内c AM P 的浓度及c AM P /P K A 信号通路[2],因此c GM P 对c AM P 具有拮抗作用㊂细胞内N O 和利钠肽(N P s )分别激活s G C 和p G C 生成c GM P ,c GM P进一步激活c GM P 依赖蛋白激酶G (P K G ),P K G通过磷酸化下游靶蛋白进而调节血管舒张㊁神经传导等生理功能[20](图2);c GM P 在视觉信号转导中有着重要作用,直接调控C N G ㊂在黑暗中,视网膜的视杆细胞内c GM P 浓度升高,激活C N G ,从而允许大量的胞外N a +与C a 2+通过;当光信号传入时,会激活视杆细胞的视紫红质G P C R ,并通过一系列级联反应激活P D E ㊁水解c GM P ,进而关闭C N G ,导致N a +和C a 2+浓度降低使膜超极化,最终引起大脑对光的视觉反应㊂最新研究发现c GM P 在骨生长㊁心衰竭等方面也发挥着重要作用㊂图2 c AM P 与c GM P 的信号通路F i g .2S i g n a l i n g p a t h w a ys o f c AM P a n d c GM P 注:G P C R s :G 蛋白偶联受体;A C :腺苷酸环化酶;pG C :膜结合型鸟苷酸环化酶;s G C :可溶性鸟苷酸环化酶;P K A :c AM P 依赖蛋白激酶(R :调节亚基;C :催化亚基);P K G :c GM P 依赖蛋白激酶;C N G :环核苷酸门控离子通道;A N P :心房利钠肽;B N P :脑钠肽;U R O :尿钠素㊂1.3 环状单磷酸嘧啶(c C M P ㊁c UM P ) 当c AM P 与c GM P 被鉴定后,环状单磷酸嘧啶的存在及其功能引起了大量关注,但由于技术原因环状单磷酸嘧啶的研究一直停滞不前㊂直至2014年,研究人员在人源H E K 293细胞和鼠源B 103细胞中发现了高浓度的c C M P 和c UM P ,同时发现s A C 与s G C 均可产生c C M P 与c UM P ,且二者的下游靶标为P K A ㊁P K G 等㊂2021年,研究人员在细菌中发现了合成c C M P 和c UM P 的嘧啶环化酶P yc C (图1),并发现在细菌中c C M P 和c UM P 可以作为第二信使激活细菌抗噬菌体系统 P yc s c a r 系统㊂该研究的发现再次引起了人们对这两种环状单磷酸嘧啶的关注[25]㊂2 环状寡核苷酸目前在生物体内发现了多种不同长度㊁不同碱基组成的环状寡核苷酸,并发现其在激活生物体固有免疫方面有着重要作用㊂同时,关于环状寡核苷酸研究还提示细菌和后生动物之间可能存在免疫系统进化关系[26]㊂2.1 环二鸟苷酸 1987年,研究人员在A c e t o -b a c t e r x yl i n u m 中发现了纤维素合成酶的激活剂综述生命科学仪器 2023年第21卷/第5期10环二鸟苷酸(c -d i -GM P ),并确定了两个GM P 分子之间是以3'-5'磷酯键连接[27]㊂c-d i -GM P 是在所有生物体内发现的第一个环二核苷酸㊂此后在多种细菌中均发现了c -d i -GM P 的存在,证明c -d i -GM P 是一种在细菌中通用的第二信使分子[28]㊂c -d i -GM P 是由二鸟苷酸环化酶(d i g u a n y l a t e c yc l a s e ,D G C )催化两分子G T P 脱去两分子焦磷酸环化生成㊂c -d i -GM P 主要作用于两种效应因子,一种是效应蛋白,例如,含P i l Z 结构域的蛋白:大肠杆菌中的Y c g R 可与c -d i -GM P 结合调控细菌的运动能力;依赖c -d i -GM P 调控的D N A 结合蛋白或转录因子:霍乱弧菌中的c -d i -GM P 可抑制应激反应调节因子R o pS 的表达等[30]㊂另一种是核糖开关,c -d i -GM P 能专一性结合核糖开关G E MM (G e n e s r e -l a t e d t o t h e E n v i r o n m e n t ,M e m b r a n e s a n d M o t i l i -t y),调控蛋白质的翻译㊂目前,c -d i -GM P 被鉴定参与调控细菌运动性㊁生物膜形成㊁多糖形成等多个生理生化过程,同时有研究表明其能够激活后生动物的固有免疫反应[7]㊂c -d i -GM P 的出现,为其他环状寡核苷酸的发现奠定了基础㊂2.2 环二腺苷酸环二腺苷酸(c -d i -AM P )是生物体内发现的第二个环二核苷酸,它是在解析一种D N A 完整性扫描蛋白(D N A i n t e g r i t y sc a n -n i n g pr o t e i n A ,D i s A )结构时发现存在于D i s A 的晶体结构中,其功能为在细菌D N A 损伤时延迟产孢㊂D i s A 蛋白的N 端结构域能够催化两分子A T P 合成c -d i -AM P ,因此该结构域被命名为D A C 结构域(D i -A d e n y l y l C yc l a s e )㊂c-d i -AM P 在细菌中的受体有两类,一类是蛋白质类受体,例如T e t R 家族的转录因子D a r R 和钾离子转运蛋白家族K t r A 蛋白㊂D a r R 蛋白与c-d i -AM P 结合后会增强自身D N A 结合能力,导致多种基因的表达被抑制,进而影响细菌内脂肪酸的合成等生理活动;K t r A 蛋白由R C K _N 和R C K _C两个结构域组成,其R C K _C 结构域与c -d i -AM P 特异性结合后会引起膜转运蛋白K t r B 的构象或聚集状态改变,进而影响细菌的钾离子转运;另一类是核糖开关类受体,核糖开关y d a O 形成一个方形赝对称结构并结合两个c -d i -AM P 分子,yd a O 核糖开关参与调控细菌细胞壁代谢㊁芽孢形成等生理活动[5]㊂目前,c -d i -AM P 已经被鉴定参与细菌多种生理功能,包括监测D N A 损伤㊁控制细胞脂肪酸合成㊁芽孢形成等,同时其在后生动物体内还可诱导宿主细胞产生免疫反应[39]㊂2.3 环状鸟苷酸-腺苷酸2.3.1 3'3'-环状鸟苷酸-腺苷酸 2012年,研究人员在霍乱弧菌V.c h o l e r a e 中发现了一种新型环二核苷酸3'3'-环状鸟苷酸-腺苷酸(3'3'-c G AM P ),它由寡核苷酸环化酶D n c V 催化一分子A T P 和一分子G T P ,通过两个3'-5'磷酯键环化生成(图3)㊂3'3'-c G AM P 起初被发现参与调节霍乱弧菌的毒力㊁趋化性等生理功能,但其结合的效应因子一直未被发现㊂2018年,在霍乱弧菌中发现一种马铃薯糖蛋白样磷脂酶C a p V 可以被3'3'-c G AM P 激活,从而降解细胞膜中的磷脂,并释放游离的脂肪酸㊂后续研究发现D n c V-c G AM P -C a pV 的通路具有抗噬菌体防御功能,并由D n c V ㊁C a pV ㊁泛素化相关结构域E 1㊁E 2以及J A B /J AMM 家族的异肽酶四种基因构成操纵子[43]㊂噬菌体侵染细菌会激活D n c V 生成3'3'-c G AM P 然后激活C a p V 降解细胞膜,导致膜完整性的丧失,因此细菌会在噬菌体完成复制前死亡㊂该通路通过介导顿挫感染从而起到抗噬菌体防御的作用㊂图33'3'-c G AM P 合成图F i g .3S yn t h e s i s o f 3'3'-c G AM P 2.3.2 2'3'-环状鸟苷酸-腺苷酸 2'3'-环状鸟苷酸-腺苷酸(2'3'-c G AM P )是第一个在后生动物中发现的环状寡核苷酸分子,在后生动物中参与了重要的固有免疫反应㊂2013年研究发现后生动物细胞中存在一种寡核苷酸环化酶c G A S (C y c l i c GM P-AM P S yn t h a s e ),当宿主细胞被病原体感染后,c G A S 可以直接识别病原体D N A ,该过程中c G A S 会与d s D N A 结合形成一个2:2的复合物,催化一分子G T P 和一分子A T P 脱去两分子焦磷酸并环化生成第二信使c G AM P ㊂c G AM P 可直接结合并激活接头蛋白S T I N G ,进而招募激酶I K K (I B k i n a s e )和T B K 1(T A N K-b i n d i n g ki n a s e 1),分别激活转录因子N F-κB (N u c l e a r f a c t o r )和I R F 3(I n t e r f e r o n r e g u l a t o r y f a c t o r),最终诱导I 型干扰素和其他促炎细胞因子的表达㊂同年6月,研究人员通过结构和功能实验发现c G A S 产生的c G AM P 与细菌的3'3'-生命科学仪器 2023年第21卷/第5期综述11c G AM P 并不相同,而是一种包含2'-5'和3'-5'混合磷酯键的新型环二核苷酸:2'3'-c G AM P (图4)㊂c G A S -c G AM P-S T I N G 信号通路的发现加深了人们对后生动物天然免疫信号通路的认识,同时也引发了人们对后生动物中是否存在其他环状寡核苷酸的关注㊂图4 2'3'-c G AM P 合成图F i g .4S yn t h e s i s o f 2'3'-c G AM P 2.3.3 3'2'-环状鸟苷酸-腺苷酸 c G A S在被发现后,研究人员在动物基因组中检测到了多个与c G A S 具有同源性的蛋白质,但这些蛋白质的功能尚不清楚㊂2019年,研究鉴定了一类先天免疫传感器的c G L R s 蛋白(c G A S -l i k e r e c e p-t o r s),能够识别不同的分子模式并催化合成不同的环状寡核苷酸信号分子㊂其中果蝇的c G L R 1能够识别双链R N A 并被激活合成新的环二核苷酸3'2'-c G AM P ,进而与d S T I N G (D r o s o ph i l a S T I N G )结合,发挥其抗病毒免疫作用㊂同年,在不黏柄菌属(A s t i c c a c a u l i s s p.)中发现C d n G 能够在体外合成3'2'-c G AM P ,后者能够结合A s -C a p5使其二聚化并激活其HN H 核酸酶结构域降解D N A ,进而达到抵抗噬菌体的功能[51]㊂这些研究证实了细菌和后生动物在环化核苷酸信号上存在一定的进化关系㊂2.4 其他环状寡核苷酸的发现继2008年发现第一个环二核苷酸c -d i -GM P ,10年间陆续发现的环状寡核苷酸均由嘌呤核苷酸环化而成㊂2019年,P h i l i p J .K r a n z u s c h 课题组在大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i )中发现了一个D n c V 的同源蛋白C d n E ,C d n E 能够催化一分子U T P 和一分子A T P 环化生成嘌呤-嘧啶环二核苷酸3'3'-c UM P -AM P ,其下游效应蛋白为马铃薯糖蛋白样磷脂酶C a p E ,被c -UM P-AM P 激活后可通过顿挫感染的方式抵抗噬菌体的侵染㊂同时,研究人员将c G A S ㊁D n c V ㊁C d n E ㊁O A S 1等能够生成环状寡核苷酸的蛋白质称为c G A S /D n c V 样核苷酸转移酶(c G A S /D n c V -l i k e n u c l e o t i d yl t r a n s -f e r a s e s ,C D-N T a s e s ),并通过对所有C D-N T a -s e s 进行生信分析和大规模的正向生化筛选,鉴定出了七种嘌呤㊁嘧啶㊁嘌呤-嘧啶环二核苷酸:c -d i -GM P ㊁c -d i -AM P ㊁c -d i -UM P ㊁c G AM P ㊁c UM P -AM P ㊁c UM P-GM P ㊁c C M P-UM P ,揭示了C D-N T a s e s 选择核苷酸的分子机制㊂此外,阴沟肠杆菌E n t e r o b a c t e r c l o a c a e 的寡核苷酸环化酶C d n D 能够生成环三核苷酸3'3'3'-c AM P-AM P-GM P (c A A G ),c A A G 激活下游效应蛋白C a p4核酸内切酶活性进而切割D N A ㊂大肠杆菌中的核酸内切酶N u c C 可以被3'3'3'-c AM P -AM P -AM P (c A A A )激活组装为六聚体切割细菌染色质导致细菌死亡,进而抵抗噬菌体的侵染㊂在Ⅲ型C R I S P R-C a s 系统中发现了一种环状寡聚腺苷酸(c O A ),A T P 能够被C a s 10亚基的P a l m结构域催化生成c O A ,c O A 通过二聚化下游C s m 6/C s x 1核糖核酸酶的C A R F 结构域,从而激活其切割R N A 活性,抵抗噬菌体的感染[57]㊂多种不同碱基㊁长度以及磷酯键成键方式的环状寡核苷酸的发现,体现了其在生物体内的多样性,同时环状寡核苷酸参与调节后生动物的固有免疫反应以及细菌中的抗噬菌体感染等重要生理过程,体现了其在生物体免疫系统中的重要性㊂3 环状寡核苷酸在细菌抗噬菌体信号系统中的作用2019年,研究发现3'3'-c G AM P 在细菌体内具有抗噬菌体功能,并发现了一种基于环状寡核苷酸的抗噬菌体信号系统 C B A S S 系统(C y -c l i c o l i g o n u c l e o t i d e -b a s e d a n t i -p h a g e s i g n a l i n gs ys t e m )[43],该系统通过产生环状寡核苷酸信号激活下游效应蛋白以顿挫感染的方式抵抗噬菌体感染㊂C B A S S 系统根据其操纵子的组成分为四类[60],效应蛋白通过多种方式造成细胞死亡来抵御噬菌体的侵染㊂Ⅰ型C B A S S 系统,是最基础的C B A S S 系统,仅由C D-N T a s e 和效应基因两个核心部分组成,例如耶尔森氏鼠疫杆菌Y e r s i n i a a l e k s i c i a e 的2TM (T r a n s m e m b r a n e )蛋白C a p 15可被上游C D-N T a s e 产生的3'3'-c G AM P 激活并在细胞膜上打孔进而杀死细胞㊂Ⅱ型C B A S S系统除核心组分外,还包括编码泛素化相关结构域的辅助基因C a p 2和C a p 3㊂D n c V-C a p V 通路则属于该类系统,3'3'-c G AM P 激活C a pV 降解细胞膜中的磷脂进而造成细胞死亡㊂Ⅲ型C B A S S 系统除核心组分外,包含编码T R I P 13和HO R MA 蛋白的辅助基因C a p 6和C a p 7㊁C a p8㊂大肠杆菌的C d n C 必须结合HO R MA 蛋白才能催化生成环三腺苷酸(c A A A ),N u c C 结合c A A A 后综述生命科学仪器 2023年第21卷/第5期12发生构象变化由三聚体组装形成六聚体,进而切割细菌染色质导致细菌死亡㊂Ⅳ型C B A S S 系统是一种比较稀有的操纵子组合,主要存在于古细菌中,目前该类型中环化核苷酸的调控通路尚不清楚㊂C B A S S 系统是一个复杂多样的抗噬菌体信号系统,多种环状寡核苷酸在其中起着承上启下的信号传导作用㊂4 以环状寡核苷酸为信号的免疫反应通路之间的进化关系细菌的C B A S S 系统与后生动物的c G A S-S T I N G 通路均通过环状寡核苷酸作为信号分子来激活免疫防御反应,提示了环状寡核苷酸引发的免疫反应可能起源于细菌,并在后生动物中适应性进化㊂最新研究解析了黄杆菌科F l a v o b a c t e -r i a c e a e s p.的S T I N G (F s S T I N G )结合3'3'-c G AM P 的复合物结构,其与人源S I T N G (h S T -I N G )结合2'3'-c G AM P 的复合物结构具有相似的 V 型同型二聚体和疏水α螺旋构型㊂同时,该研究还根据多个种属的S T I N G 蛋白结构分析构建了细菌与后生动物S T I N G 蛋白的系统发育树,确认了固有免疫中环状寡核苷酸分子的进化模型,并表明S T I N G 蛋白在进化过程中存在适应性㊂自此,c G A S-S T I N G 通路中的每个核心部分都在细菌中找到了对应的存在,也基本证实了后生动物的固有免疫反应(c G A S-S T I N G 通路)与细菌的抗噬菌体防御机制之间存在进化关系㊂目前后生动物仅能够自身合成2'3'-c G AM P 和3'2'-c G AM P ,而细菌虽然能够自身合成多种环状寡核苷酸,但并未在细菌中发现2'3'-c G AM P 的存在(表1)㊂同时,在c G A S-S T I N G 通路中2'3'-c G AM P 激活S T I N G 蛋白的能力比细菌的环状寡核苷酸更强,且2'3'-c G AM P 仅能被E N P P 1特异性水解,而细菌中的3'3'-c G AM P 等环化核苷酸却不能被E N P P 1水解,这也体现了2'3'-c G AM P 在免疫反应进化过程中的适应性和独特性㊂目前所有环状寡核苷酸中只有3'2'-c G AM P 同时存在于后生动物和细菌中且均参与自身固有免疫反应,后生动物能否自身合成其他类型环状寡核苷酸成为了目前的一个研究热点㊂表1 目前发现的环状寡核苷酸分子及其种属T a b .1T h e d i s c o v e r e d c y c l i c o l i g o n u c l e o t i d e s a n d t h e i r s pe c i e s 环状寡核苷酸细菌后生动物3'3'-c -d i -GM P A c e t o b a c t e r x yl i n u m -3'3'-c -d i -AM P B a c i l l u s s u b t i l i s-2'3'-c G AM P -H u m a n M o u s e3'3'-c G AM PV.c h o l e r a e-3'2'-c G AM PA s t i c c a c a u l i s s p.D r o s o ph i l a 3'3'3'-c AM P -AM P -AM P E s c h e r i c h i a c o l i -3'3'3'-c AM P -AM P -GM PE n t e r o b a c t e r c l o a c a e-3'3'-c UM P -AM P E s c h e r i c h i a c o l i-3'3'-c -d i -UM P L e g i o n e l l a p n e u m o ph i l a -3'3'-c UM P -GM PB r a d yr h i z o b i u m d i a z o e f f i c i e n s -5 展望自1958年发现了第一个环单磷酸核苷酸c AM P 至今[12],多种环化核苷酸被发现并验证了其在生物体内的功能:从调节生物体内的生理活动到激活后生动物的固有免疫反应以及细菌抗噬菌体防御系统,在生物体内扮演了重要角色㊂针对环化核苷酸的研究,目前仍有一些问题亟待解决㊂例如,后生动物中是否存在其他类型的环化核苷酸及其参与调控的信号通路细菌的寡核苷酸环化酶是否与c G A S 具有完全相同的激活方式,即需要d s D N A 激活才能生成环化核苷酸?环化核苷酸作为S T I N G 蛋白的激活剂,目前在免疫以及炎症领域备受关注,其相关药物的开发具有重要的临床意义㊂此外,细菌中环化核苷酸相关的抗噬菌体免疫的信号通路,参与调控细菌多种重要生命活动,具有被开发为分子生物学工具的生命科学仪器 2023年第21卷/第5期综述13巨大潜力㊂参考文献[1]S a s s o n e-C o r s i ,P .,T h e c y c l i c AM P p a t h w a y [J ].C o l d S p r i n g H a r b P e r s p e c t B i o l ,2012,4(12).[2]H 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d b y DN A r e c o m b i n a t i o n i n t e r m e d i a t e s [J ].M o l C e l l ,2008,30(2):167-78.综述生命科学仪器 2023年第21卷/第5期14[36]R o m l i n g,U.,G r e a t t i m e s f o r s m a l l m o l e c u l e s :c-d i -AM P ,a s e c o n d m e s s e n ge r c a n d i d a t e i n B a c t e r i a a n d A r c h a e a [J ].S c i S i g n a l ,2008,1(33):pe 39.[37]Z h a n g,L .,W.L i ,a n d Z .G.H e ,D a r R ,a T e t R-l i k e t r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r ,i s a c y c l i c d i -AM P-r e s po n s i v e r e -p r e s s o r i n M y c o b a c t e r i u m s m e gm a t i s [J ].J B i o l C h e m ,2013,288(5):3085-96.[38]C o r r i g a n ,R.M.,e t a l .,S ys t e m a t i c i d e n t i f i c a t i o n o f c o n -s e r v e d b a c t e r i a l c-d i -AM P r e c e p t o r p r o t e i n s [J ].P r o c N a t l A c a d S c i U S A ,2013,110(22):9084-9.[39]C o r r i g a n ,R.M.a n d A.G r u n d l i n g ,C yc l i cd i -AM P :a n o t h -e r s e c o n d m e s s e n g e r e n t e r s t h ef r a y [J ].N a t R e 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植物生理学习题6

(一)填空1．根据运输距离的长短，可将高等植物体内的运输可分为距离运输和距离运输。

（短，长）2．一般认为，胞间连丝有三种状态：(1) 态，(2) 态，(3) 态。

一般地说，细胞间的胞间连丝多、孔径大，存在的浓度梯度大，则于共质体的运输。

（正常，开放，封闭，有利）3．物质进出质膜的方式有三种：(1)顺浓度梯度的转运，(2)逆浓度梯度的转运，(3)依赖于膜运动的转运。

(被动，主动，膜动) 4．以小囊泡方式进出质膜的膜动转运包括，和三种形式。

(内吞，外排，出胞)5．一个典型的维管束可由四部分组成：(1)以导管为中心，富有纤维组织的，(2)以筛管为中心，周围有薄壁组织伴联的，(3)穿插木质部和韧皮部间及四周的多种，(4)包围木质部和韧皮部。

(木质部，韧皮部，细胞，维管束鞘)6．目前测定韧皮部运输速度的常用的方法有两种。

一种是利用作为示踪物，用显微注射技术将这种分子直接注入筛管分子内，追踪这种分子在筛管中的运输状况，根据单位时间中此分子的移动距离来计算运输速度。

另一种是同位素示踪技术，常用的同位素是。

将它的化合物饲喂叶片，然后追踪化合物在筛管中的运输状况、运输速度，用这种技术还可研究同化物的分配动态。

(染料分子，放射性，14C）8．筛管中糖的主要运输形式是糖和糖。

(寡聚糖（棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等），蔗糖)9．光合同化物在韧皮部的装载要经过三个区域：即（1）光合同化物区，指能进行光合作用的叶肉细胞；（2）同化物区，指小叶脉末端的韧皮部的薄壁细胞；（3）同化物区，指叶脉中的SE-CC。

（生产，累积，输出，）10．质外体装载是指细胞输出的蔗糖先进入质外体，然后通过位于SE-CC复合体质膜上的蔗糖载体蔗糖浓度梯度进入伴胞，最后进入筛管的过程。

共质体装载途径是指细胞输出的蔗糖通过胞间连丝浓度梯度进入伴胞或中间细胞，最后进入筛管的过程。

（光合，逆浓度，光合，顺蔗糖浓度）11．韧皮部卸出的途径有两条：一条是途径，另一条是途径。

植物生理学习题6

(一)填空1．根据运输距离的长短，可将高等植物体内的运输可分为距离运输和距离运输。

（短，长）2．一般认为，胞间连丝有三种状态：(1) 态，(2) 态，(3) 态。

一般地说，细胞间的胞间连丝多、孔径大，存在的浓度梯度大，则于共质体的运输。

（正常，开放，封闭，有利）3．物质进出质膜的方式有三种：(1)顺浓度梯度的转运，(2)逆浓度梯度的转运，(3)依赖于膜运动的转运。

(被动，主动，膜动) 4．以小囊泡方式进出质膜的膜动转运包括，和三种形式。

(木质部，韧皮部，细胞，维管束鞘)6．目前测定韧皮部运输速度的常用的方法有两种。

另一种是同位素示踪技术，常用的同位素是。

将它的化合物饲喂叶片，然后追踪化合物在筛管中的运输状况、运输速度，用这种技术还可研究同化物的分配动态。

(染料分子，放射性，14C）8．筛管中糖的主要运输形式是糖和糖。

共质体装载途径是指细胞输出的蔗糖通过胞间连丝浓度梯度进入伴胞或中间细胞，最后进入筛管的过程。

（光合，逆浓度，光合，顺蔗糖浓度）11．韧皮部卸出的途径有两条：一条是途径，另一条是途径。

4生物化学习题(答案)

4生物化学习题（答案）1核酸的结构与功能一、名词解释1、生物化学：就是运用化学原理和方法，研究生命有机体化学共同组成和化学变化的科学，即为研究生命活动化学本质的学科。

（运用，研究，科学，学科）2、dna一级结构：由数量极其庞大的四种脱氧的单核苷酸按照一定的顺序，以3′,5′－磷酸二酯键彼此连接而形成的线形或环形多核苷酸链。

3、增色效应：含dna和rna的溶液经变性或水解后对紫外线稀释的减少。

就是由于碱基之间电子的相互作用的发生改变所致，通常在260nm测量。

4、减色效应：一种含有dna或rna的溶液与含变性核酸或降解核酸的相同溶液相比较，其紫外线吸收为低。

是由于dna双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，因而减少了对紫外线的吸收。

5、dna的变性：指核酸双螺旋的氢键脱落，变为单链，并不牵涉共价键的脱落。

6、dna的复性：变性dna在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，全过程为复性。

热变性后的复性又称为退火。

7、核酸分子杂交：应用领域核酸分子的变性和复性的性质，并使来源相同的dna（或rna）片断按碱基优势互补关系构成杂交双链分子，这一过程称作核酸的分子杂交。

8、熔解温度：dna变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。

通常把热变性过程中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为该dna的熔点或熔解温度（meltingtemperature），用tm表示。

9、chargaff定律：所有dna中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含量成正比，（a＝t），鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔含量成正比（g＝c），即为嘌呤的总含量与嘧啶的总含量成正比（a＋g＝t＋c）。

dna的碱基组成具备种的特异性，但没非政府和器官的特异性。

另外生长发育阶段、营养状态和环境的发生改变都不影响dna的碱基组成。

二、填空题1、核酸完全的水解产物是（碱基）、（戊糖）和（磷酸）。

其中（碱基）又可分为（嘌呤）碱和（嘧啶）碱。

3'-5'-环腺苷酸磷酸二脂酶(PDE)的提取与CaM活性的测定

3'-5'-环腺苷酸磷酸二脂酶（PDE）的提取与CaM活性的测定3'-5'-环腺苷酸磷酸二脂酶（以下简称PDE）是环核苷酸代谢中的重要酶。

PDE有多种形式、其中主要的有两种：一种为依赖Ca2+的PDE，可被CaM激活，是经典的CaM靶酶之一；另一种为不依赖Ca2+的PDE，不被CaM激活。

这里介绍的为前一种。

由于PDE活性与CaM含量成剂量关系，所以成为最常用的检测CaM活性和定量活性CaM的方法。

PDE提取过程中用盐析法沉淀蛋白质后，通过DEAE-纤维素柱梯度洗脱法分离PDE。

其原理是，在0～0.4mol/L NaCI浓度范围内，CaM不能被洗脱，而PDE则可以，从而获得无CaM 且具有一定基础活性的PDE。

PDE法测定CaM活性及定量测定CaM的酶反应分两步进行：第一步为依赖CaM激活的PDE将CAMP转化为5'-AMP；第二步是所加蛇毒中的5'-核苷酸酶将5'-AMP分解生成腺嘌呤并释放无机磷，故通过测定无机磷的含量即可得知CaM对PDE的激活活性，再与标准曲线比较即可确定CaM的数量。

1.仪器设备活动冷室、高速冷冻离心机、高速组织捣碎机、输液泵、部分收集器、恒温水浴锅、紫外分光光度计。

2.操作方法1）PDEase的提取（1）取新鲜牛脑400～500g，去结缔组织等，剪碎，预冷后加约2.5倍体积预冷的缓冲液A （含20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L巯基乙醇，1mmol/L EGTA pH7.5），用高速组织捣碎机捣碎。

匀浆用4层纱布过滤后，滤液在1℃下（10000×g）离心30min。

（2）取上清液用（NH4）2SO4盐析，慢慢加入（NH4）2SO4，至饱和度55%，搅拌30～60min 后以10000×g，于4℃下离心30min。

取沉淀溶于缓冲液B（含20mmol/LTris-HCl，1mmol/L MgCl2，1mmol/L EGTA，1mmol/L巯基乙醇，1mmol/L咪唑，pH7.5）中，搅拌20min。

wzc 核酸习题

核酸化学习题一、名词解释1.核苷（nucleoside）:是由嘌呤或嘧啶碱基通过共价键与戊糖连接组成的化合物。

核糖与碱基一般都是由糖的异头碳与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9之间形成的β-N-糖苷键连接的。

2.核苷酸（nucleotide）：核苷的戊糖成分中的羟基磷酸化形成的化合物。

3.cAMP（cyclic AMP）:3ˊ,5ˊ-环腺苷酸，细胞内的第二信使，由于某些激素或其它分子信号刺激激活腺苷酸环化酶催化ATP环化形成的。

4.磷酸二酯键（phosphodiester linkage）：一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇（羟基）酯化形成的两个酯键。

该酯键成了两个醇之间的桥梁。

例如一个核苷的3ˊ羟基与另一个核苷的5ˊ羟基与同一分子磷酸酯化，就形成了一个磷酸二酯键。

5.脱氧核糖核酸（DNA , deoxyribonucleic acid）:含有特殊脱氧核糖核苷酸序列的聚脱氧核苷酸，脱氧核苷酸之间是通过3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键连接的。

DNA是遗传信息的载体。

6.核糖核酸（RNA , ribonucleic acid）:通过3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键连接形成的特殊核糖核苷酸序列的聚核糖核苷酸。

DNA的碱基组成具有种的特异性，但没有组织和器官的特异性。

另外生长发育阶段、营养状态和环境的改变都不影响DNA的碱基组成。

8.DNA双螺旋(DNA double helix)：一种核酸的构象，在该构象中，两条反向平行的多核苷酸链围绕彼此缠绕形成一个右手的双螺旋结构。

碱基位于双螺旋内侧,磷酸与糖基在外侧，通过磷酸二酯键相连,形成核酸的骨架。

碱基平面与假想的中心轴垂直,糖环平面则与轴平行。

两条链皆为右手螺旋。

双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm，两核苷酸之间的夹角是36°，每对螺旋由10对碱基组成，碱基按A-T, G-C配对互补，彼此以氢键相连系。

第一章核酸的结构与功能答案

参考答案：第一章核酸的结构与功能一、填空题：1、Watson 和Crick 提出DNA的双螺旋模型，从而为分子生物学的发展奠定了基础。

2、胸苷就是尿苷的 5 位碳原子甲基化。

3、核酸按其所含糖不同而分为RNA 和DNA 两种，在真核生物中，前者主要分布在细胞质中，后者主要分布在细胞核中。

4、某双链DNA中含A为30％(按摩尔计)，则C为20 ％，T为30 ％。

5、DNA双螺旋B结构中，双螺旋的平均直径为2 nm，螺距为 3.4 nm，沿中心轴每旋转一周包含10 个碱基对，相邻碱基距离为0.34 nm，之间旋转角度为36°。

6、在DNA分子中，若(G+C)％含量越高，则Tm 越高，分子越稳定。

7、tRNA的二级结构呈三叶草形，三级结构像个倒写的L 字母。

8、嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使得核酸在260 nm附近有最大吸收峰，可用紫外分光光度计测定。

9、DNA变性后，紫外吸收能力增强，粘度下降，浮力、密度升高，生物活性丧失。

10、嘌呤环上的第9 位氮原子与戊糖的第 1 位碳原子相连形成糖苷键，通过这种键相连而成的化合物叫嘌呤核苷。

11、体内两种主要的环核苷酸是_cAMP _和_ cGMP _。

12、写出下列核苷酸符号的中文名称：ATP 三磷酸腺苷（或腺苷三磷酸）dCDP 脱氧二磷酸胞苷（或脱氧胞苷二磷酸）。

13、RNA的二级结构大多数是以单股多核苷酸链的形式存在，但也可局部盘曲形成双螺旋结构，典型的tRNA结构是三叶草结构。

14、tRNA的三叶草型结构中，其中氨基酸臂的功能是与氨基酸结合，反密码环的功能是辨认密码子。

15、构成核酸的单体单位称为核苷酸，它与蛋白质的单体单位氨基酸相当。

16、在核酸分子中由戊糖和含氮碱组成核苷，由核苷和磷酸组成核苷酸。

核苷酸是组成核酸的基本单位。

无论是DNA或RNA都是由许许多多的核苷酸通过3´,5´-磷酸二酯键连接而成。

17、核苷中，嘌呤碱与核糖是通过9 位N 原子和 1 位 C 原子相连；嘧啶碱与核糖是通过l_ 位N 原子和 1 位 C 原子相连。

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核苷二磷酸磷酸水解酶鉴别方法
核苷二磷酸磷酸水解酶
Novikoff和goldficher法原理：采用金属法显示酶活性所在部位，其反应式如下
孵育液的配制：
Novikoff和gold次fiche黄r法嘌呤核苷二磷酸钠盐
025M 氯化锰
5ml
蒸馏水（溶解以上钠盐）棕黑色沉淀为酶活性部位
入1%硫化胺溶液2min
入1%硫化胺溶液2min
1N%ov硝ik酸off铅和goldfich4er.法蒸馏水洗2次，3ml3~4分钟
棕黑色沉淀为酶活性部位
2）
1ml
入次1黄%嘌硫呤化核胺苷溶二液磷25酸m.i钠n入盐 1%硫化胺2溶5mg液2min
入1%硫化胺溶液2min
结果与评价
棕黑色沉淀为酶活性部位
对照
用抑制剂，如0.01M硝酸铀、10mM半胱氨酸、谷胱甘肽，则为阴性反应
原理：采用金属法显示酶活性所在部位，其反应式如下
0.2M 025M 氯化锰
Novikoff和goldficher法
Tris苹果酸5m缓l 冲液（PH=7.2）
1%硝酸铅
3ml
1%硝酸铅棕黑色沉淀为酶活性部位
Novikoff和goldficher法
2）
1ml
0.025M 氯化锰 002
2M Tris苹果酸缓冲液（最终PH=6.5~7.0，新鲜配制，过滤
25mg 7ml 1ml 3ml 5ml
方法与步骤 1.新鲜组织，冰冻切片 2.10%缓冲福尔马林固定30min
2入M1%Tr硫is苹化果胺酸溶缓液冲23m液.in入（PH孵=7.育液，37℃，孵育15min
入孵育液，37℃，孵育15min

环腺苷—3',5'—磷酸(camp)合成方法的改进及反应机理初探

环腺苷—3',5'—磷酸(camp)合成方法的改进及反应机理初探环腺苷-3',5'-磷酸（cAMP）是一种重要的次级信使，在细胞信号转导中发挥着关键作用。

其合成方法有多种途径，其中最广泛应用的是酶促反应法和化学合成法。

下面是一种改进的酶促反应法：
首先，从大肠杆菌中获得腺苷酸环化酶，经过重组蛋白技术纯化得到具有高催化活性的酶，用0.01 M Tris-HCl buffer（pH 8.0）作为反应介质，加入MgCl2 和ATP，pH 调整到8.0 左右。

然后将底物半胱氨酸、AMP 和金属硫蛋白酶混合，加入上述反应液中进行反应，反应时间约为36小时。

这种改进的反应方法旨在通过添加金属硫蛋白酶来增加反应产物的产量和纯度。

研究发现，金属硫蛋白酶可以在酶促反应中引发共振和转移电子，从而提高底物的亲核性，促进反应的进行。

同时，金属硫蛋白酶还可以作为氧化还原酶，清除反应中的氧气，从而防止cAMP 产物的氧化。

反应机理方面，半胱氨酸首先与ATP 发生乙酰化反应，生成乙酰半胱氨酸，随后通过腺苷酸环化反应，生成环腺苷。

最后，环腺苷在酶的作用下发生磷酸化反应，形成cAMP 产物。

金属硫蛋白酶的作用可能在降低反应的能垒和促进转移反应中发挥关键作用。

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