酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究

pH值得影响
温度的影响
仪器与试剂
仪器：分光光度计 植物组织捣碎机 离心 机 恒温水浴 试剂：pH6.8磷酸盐缓冲溶液 多巴溶液 （200mg/L） 铜试剂（10-3mol/L） 土豆

实验步骤


1.络氨酸酶的提取：取75g的去皮土豆，洗净，切碎，置于 植物组织捣碎机中，加入冷却的磷酸盐缓冲溶液150ml，在 高速转速下捣碎3分钟，然后用纱布过滤，滤液收集于干净 烧杯中静置数分钟，将上层清液于离心试管中在3000r/min 转速下离心分离5分钟。 2.km和vmax的测定：在比色皿中按表1加入缓冲溶液、多巴溶 液，摇匀、30℃恒温10min，再在00、0、1号比色管各加入 络氨酸酶提取液各0.20mL，摇匀后立即倒入比色皿中，以00 号为参比溶液，测量各溶液的吸光度随时间的变化值，前 5min每隔30s测量一次溶液的吸光度，后5min每隔60s测量一 次溶液的吸光度，并记录溶液的吸光度和对应反应时间。以 同样方法测量2-5号溶液的吸光度并记录数据。
影响酶作用的因素：酶的浓度、底物浓度、 溶液的pH值、和酶抑制剂等。

km 1 1 Vi Vmax[S ] Vmax
米氏方程

[S]、[E]分别为底物浓度和酶的浓度，km为米 氏常数，其物理意义是当酶促反应速度到达 最大速度一半时的底物浓度，单位mol/L

对米氏方程进行双倒数得到：

以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，由图得 到截距和斜率，即可计算vmax和km。
一、底物浓度对酶促反应的影响
随反应物浓度S的增大，酶促反应速度V 增大。当底物的浓度较低时，V随〔S〕 增大而急剧增大，二者成正比关系；随 着〔S〕的继续增大，V继续增大，而增 幅逐渐减小，若再继续增大〔S〕，则V 将不再变化， 达到一个极 限值Vmax。

酪氨酸酶对多巴的催化氧化原理

实验注意事项
1.络氨酸酶的提去要现提现用； 2.提取时的温度不能太高； 3.反应温度的设置应低于45℃； 4.反应温度应保持恒定。

项目 0 1 2 3 4 5
温度 缓冲 溶液 多巴 溶液 酶提 取物
2.6
20℃
28℃
36℃
44℃
1.6
1.6
1.6
1.6
0
1.0
1.0
1.0
1.0
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
数据记录表3（抑制剂的影响） 项目
缓冲溶液 多巴溶液
0 2.6 0
1 1.6 1.0
2 1.5 1.0
3 1.4 1.0
酪氨酸酶的提取及 其酶促反应动力学 研究
一、实验目的
1.认识生物体中酶的存在，了解生物体系中酶促反应 的特点； 2.了解底物浓度对酶促反应速度的影响； 3.了解抑制剂对酶促反应速度的影响； 4.掌握用双倒数作图法求米氏常数； 5.实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并就其酶促 反应的动力学研究其活性； 6.温度、酸度对酶促反应的影响。
温度对酶促反应的影响

在反应条件相同的情况下，改变反应温度， 通过ABS随时间的改变率，确定反应的最佳 反应温度（表2）。
抑制剂对酶促反应的影响

3.抑制剂的影响：按表2的所列的数据进行溶 液的配制，以0号溶液为参比溶液，按步骤2 的方法测量各个溶液的吸光度随时间的变化。
数据记录表1（底物浓度的影响） 项目 00
4 1.3 1.0
5 1.2 1.0
铜试剂
酶提取物
0
0.4
0
0.4
0.1
0.4
0.2
0.4
0.3
0.4
0.4
0.4
数据记录及处理
0时间 吸光度
1 2 3 4 5
1时间 吸光度
2 3 4 5
数据处理



1.根据朗伯-比尔定律，将测得的吸光度计算转化为 浓度，以浓度为纵坐标，时间为横坐标作图，求得 直线的斜率即为反应的速度v； 2.根据双倒数米氏方程，以1/v为纵坐标，1/[S]为横 坐标作图，求得直线的截距和斜率即可计算反应的 最大速度vmax和米氏常数Km； 3.温度对酶促反应的影响：判断反应的实验最佳温 度，并根据阿仑尼乌斯公式计算反应的活化能。 4.抑制剂的影响：求出未加入和加入抑制剂的反应 速度，以反应速度为纵坐标，抑制剂浓度为横坐标 作图，判断抑制剂对反应的影响。
影响酶促反应速度的因素： 酶的浓度[E] 底物的浓度[S] 溶液的pH值 温度 酶的抑制剂 酶的激活剂

二、实验原理
酶催化剂的特点


1.具有表观活性和专一性所需要的结构空间，反应能在比较 温和的条件下进行； 2.酶促反应的活化能较低； 3.酶的催化效能极高； 4.酶具有高度的专一性。
缓冲溶 液 多巴溶 液 酶提取 物
0
1.50 0.2 0.0
1
1.50 0.2 0.2
2
1.50 0.4 0.2
3
1.50 0.6 0.2
4
1.50 0.8 0.2
பைடு நூலகம்
5
1.50 1.0 0.2
1.50 0.0 0.2
水
1.30
1.30
1.10
0.90
0.70
0.50
0.30
温度的影响表2

温度对催化反应的影响