液相色谱流动相基础知识-扫盲篇
最全的液相色谱知识（包括原理,维护,基础操作,处理方法）
最全的液相色谱知识（包括原理,维护,基础操作,处理方法）
最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）
L、基线漂移
原因和解决方法
1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）
解决方法：控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图
2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）
解决方法：使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体
解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）
4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）
解决方法：取出阻塞物或换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化
解决方法：更改配比或流速。为避免问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时
解决方法：用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
解决方法：检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC 级的溶剂
8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
解决方法：重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
经典液相色谱知识点总结
经典液相色谱知识点总结
液相色谱（Liquid Chromatography, LC）是一种以液相为驱动相，将待测样品在静态相中进行分离的色谱分析方法。液相色谱在分离生化样品、药物、天然产物等化合物时得到了广泛的应用。本文将系统总结液相色谱的知识点，包括原理、分类、仪器设备、色谱柱、检测方法等方面的内容。
一、原理
液相色谱的原理基于化合物在静态相（色谱柱填料）和流动相（溶剂）之间的分配与分离过程。待分析的化合物在流动相与静态相之间的分配系数不同，因此当待测样品溶液通过色谱柱时，根据不同化合物在静态相中的分配行为，可以实现化合物的分离。
在液相色谱中，流动相主要由溶剂和缓冲液组成，可以根据需要进行调整。而静态相则是色谱柱填料，填料的选择对色谱分离效果至关重要。填料的种类、粒径、表面性质等都会影响到分离效果。
二、分类
根据静态相的不同，液相色谱可以分为几种常见的类型：
1、反相色谱：静态相是疏水性填料，流动相是亲水性溶剂，被分离物质的极性与填料相反。反相色谱对极性化合物具有较好的分离效果，因此在分析生化样品、药物等方面得到了广泛的应用。
2、离子交换色谱：静态相是带电离子交换树脂填料，可进行阴离子或阳离子的分离。离子交换色谱适用于分析离子化合物，如蛋白质、核酸等。
3、尺寸排除色谱：静态相是孔径大小均一的凝胶填料，根据分子大小进行排除分离。尺寸排除色谱适用于分析大分子化合物，如蛋白质、多糖等。
4、亲和色谱：通过生物亲和分离剂与化合物间的特异性结合实现分离，主要应用于生化分析领域。
5、扩展液相色谱：液相色谱的一种改良方法，通过使用超高性能色谱柱和压力增加装置来提高分辨率。
液相基本知识
一、基本概念和术语
1.色谱图和峰参数
⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）.
⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。
⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symm etry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T <0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。
⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。
⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。
⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。
⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ。
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理
高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理
（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分
离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
液相色谱的固定相与流动相
液相色谱（Liquid Chromatography）是一种高效、分辨率较高、适用于大多 数分子的分离技术。本文将介绍液相色谱的固定相和流动相。
固定相的介绍
作用
固定相是固定在色谱柱中的一种材料。它的 主要作用是提供一个分离的平台。
种类
常见的固定相有C18、C8、芳香族、离子交 换、手性等，不同的固定相分离作用不一样。
作用
流动相可以作为分离物在色谱 柱中移动的载体，通过改变流 动相的性质，对分离物产生分 离作用。
液相色谱的原理
1
分配
2
在有机相和水相两个不同溶剂的混合
物中，间接地用饱和浓度的分配系数
表征析出溶质所体现的物化性质之一。
3
吸附
分离物在固定相表面与流动相进行相 互作用的过程。
离子交换
根据它们与离子交换树脂的相互作用 所体现出的不同亲和性质，在离子交 换柱中实现分离。
Methanol-water
常用于脂溶性物质的分离。
Acetonitrile
常用于极性化合物的分离。
Buffer solutionຫໍສະໝຸດ Baidu
应用于生物大分子分离。
液相色谱的应用领域
1 医学领域
2 食品领域
适用于药物分析、生化药品质量控制、血 清中蛋白质的分离等。
适用于食品添加剂分析、食品营养成分测 定、食品中的致癌物质的检测等。
hplc（液相色谱）常识及疑难详解（附实际操作图解lc-20a）
1 液相色谱基础知识
1.1 液相色谱名词术语
Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各
自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，
retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间
Peak:峰
Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴
Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离
Peak Width at Half Height：半峰高宽
Peak Area：峰面积
Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰
Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰
Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰
Baseline Drift:基线漂移
Baseline Noise:基线噪音
Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相
1.2.1 流动相类型
正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
液相色谱基础知识
液相色谱基础知识
1.色谱图和峰参数⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）.⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。⊕漂移（d rift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak）.前者少见。⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（s ymmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0. 95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W =4σ。⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝
液相色谱 流动相
液相色谱流动相
液相色谱流动相的选择与配制是液相色谱分析的关键步骤。
液相色谱流动相的主要作用是帮助色谱柱中的组分分离，以实现有效的分离和分析。流动相的选择和配制需要遵循一些基本原则。
首先，流动相应该具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。常用的流动相包括水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液。
在流动相的配制过程中，需要注意以下几点：
1.流动相溶解度应达到要求，以保证进样对流动相的影响不会导致基线不稳；
2.流动相与样品不产生化学反应，以减少对色谱峰的影响；
3.流动相的黏度要尽量小，以获得好的分离效果并降低柱压降，延长泵的使
用寿命；
4.流动相的物化性质要与使用的检测器相适应，如使用UV检测器，最好使用
对紫外吸收较低的溶剂配制；
5.流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行；
6.在流动相配制好后，一定要进行脱气处理。
同时，针对不同的分离要求和样品特点，液相色谱流动相的选择和配制方法会有所不同。例如，对于一些难以分离的复杂样品，可能需要采用特殊的流动相或添加助剂来提高分离效果。
总之，液相色谱流动相的选择和配制需要根据具体的实验条件和要求进行优化和调整。
液相色谱基本知识
液相色谱基本知识
一、液相色谱原理
液相色谱是一种基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡原理的分离技术。当流动相流经固定相时，不同物质在固定相中的保留时间不同，从而实现分离。通过选择合适的固定相和流动相，以及调整流动相的速度，可以实现对不同物质的分离和纯化。
二、液相色谱种类
根据固定相的不同，液相色谱可以分为硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱、活性炭柱色谱等多种类型。根据流动相的不同，液相色谱可以分为正相色谱和反相色谱。正相色谱中，固定相的极性大于流动相的极性；反相色谱中，固定相的极性小于流动相的极性。
三、液相色谱操作步骤
1. 样品准备：将待分离的样品进行适当处理，以便于后续的分离和纯化。
2. 装柱：将固定相装入色谱柱中，确保固定相填充均匀。
3. 平衡：在流动相中平衡色谱柱，使固定相和流动相充分接触。
4. 进样：将待分离的样品加入色谱柱，开始分离过程。
5. 洗脱：使用流动相洗脱样品中的各组分，并收集洗脱液。
6. 检测：对收集到的洗脱液进行检测，确定各组分的含量和纯度。
四、液相色谱应用领域
液相色谱在多个领域有着广泛的应用，如医药、生物、环保、食品等。在医药领域，液相色谱可用于药物的分离和纯化；在生物领域，液相色谱可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化；在环保领域，液相色谱可用于污染物的分离和检测；在食品领域，液相色谱可用于食品添加剂、农药残留等的检测。
五、液相色谱优缺点
1. 优点：液相色谱具有分离效果好、分离速度快、适用范围广等优点。同时，液相色谱还可以与质谱等检测手段联用，提高检测灵敏度和准确性。
液相色谱流动相基础知识-扫盲篇
液相色谱流动相基础知识-扫盲篇
一、液相色谱流动相的性质要求
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在SPME填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。因此，k值是流动相组成的函数。塔板数N一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：
①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料会计考试有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧
化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差
折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相溶剂瓶，以提高灵敏度。
④粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂溶剂瓶会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使
分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
二、液相色谱流动相的pH值
采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸会计考试的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸经济师样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L
色谱流动相分类 -回复
色谱流动相分类-回复
色谱流动相分类是指常用于色谱分析的液相和气相流体介质，根据其化学成分和物理性质的不同，将其分为不同的类型和分类。在色谱分析中，流动相起着至关重要的作用，它能够在固定相中有效分离目标组分。本文将一步一步回答关于色谱流动相分类的问题。
1. 什么是色谱流动相？
色谱流动相是指色谱分析中运行于色谱柱中的流体介质。它的功能是在固定相中传递样品中的目标物质，并在柱上进行有效的分离。根据其存在的物理状态，色谱流动相可以分为液相和气相两大类。
2. 液相流动相的分类有哪些？
液相流动相一般是指以液体为工作介质的色谱流动相。根据其分子间的相互作用力和极性差异，液相流动相可以分为非极性流动相、极性流动相和离子交换液相三类。
- 非极性流动相：非极性流动相以非极性有机溶剂为主要成分，如石油醚、石油醇等。非极性流动相适用于具有相似极性的化合物分离，例如脂肪类物质、芳香烃类等。
- 极性流动相：极性流动相是以极性溶剂为主要成分，如醇、酮、酸等。极性流动相常用于分离具有较强极性的化合物，如醇、酸、酮、酯等。
- 离子交换液相：离子交换液相通常是指带有离子交换基团的溶液，例如强碱性、强酸性溶液。离子交换液相广泛应用于离子对的分离和测定。
3. 气相流动相的分类有哪些？
气相流动相一般是指以气体为工作介质的色谱流动相。气相流动相根据其成分和物性的不同，可以分为惰性气体、活性气体和流动相添加剂三类。
- 惰性气体：惰性气体一般是指具有低反应性的气体，如氮气、氦气等。惰性气体主要用于气相色谱分析，作为载气和流动相的介质，用来分离不易发生化学反应的化合物。
全面的液相色谱知识介绍
适的分离模式在色谱分析中十分重要。 选择分离模式的依据：分析物的尺寸、电荷、溶解性及生物活性等。
图6 一般分离模式的选择依据 （1） 液一液分配色谱法（LLPC） 在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分 离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型 的化合物。 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同， 都是根据物质在两种互不相 溶的液体中溶解度的不同， 具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是 在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高 了分离效率，从而能分离各种复杂组分。 液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类： ①全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成，直径约100 m的全多孔型 颗粒。 这类固定相由于颗粒很细， 孔仍然较浅， 传质速率快， 易实现高效、 高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 ②表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为30 ~ 40m的实心玻璃球 和厚度约为1 ~ 2 m的多孔性外层所组成。目前，这种载体粒度为5 ~ 10 m。这 类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较 大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于 多孔层厚度薄，最大允许量受限制。 ③化学键合固定相： 它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面 的一种方法。 它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展 起着重大作用， 可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用 最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上 进行的。 液液色谱的流动相： 根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正 相分配色谱和反相分配色谱。正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 反相分配色谱： 流动相的极性大于固定相的极性， 它适用于非极性化合物的分离， 其流出顺序与正相色谱恰好相反。 （2） 液一固分配色谱法（LSAC） 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗 粒物质， 在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸 附作用不同来进行分离的。 分离原理：当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要 吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定 相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在 固定相表面发生竞争吸附： X + nSad = Xad + nS 达平衡时,有
液相色谱流动相的注意事项
液相色谱流动相的注意事项
色谱分析中不可缺少的，它可以是气体、液体、也可以超临界流体等。常见的流动相主要有：乙睛-水溶液、乙膈-醋酸水溶液、甲醇-水溶液、乙膈-磷酸水溶液等。
流动相溶剂的选择
1.所选用的流动相溶剂要有一定的化学稳定性，不与固定相和样品组分起反应，其纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求。
2.溶剂应当不干扰检测器的工作，溶剂应与检测器匹配，选择不影响检测器正常工作应选择在测定波长范围内无吸收的流动相。
3.在制备分离中，溶剂应当易于除去，不干扰对分离组分的回收。
4.溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。
5.从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。
秘诀1由强到弱：
一般先用9096的乙睛（或甲醇）/水（或缓冲溶液）进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂（乙膈或甲醇）的比例。
秘诀2三倍规则：
每减少10%的有机溶剂（甲醇或乙胞）的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
秘诀3粗调转微调：
当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%,并据此规则
逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
I流动相的配制要点要记得
1.配制不含水的有机溶剂类流动相所用量筒应区分开，必须是干燥的，不得有水。
2.流动相的抽滤。含水流动相和不含水流动相的抽滤装置应区分开。抽滤不含水的有机溶剂类流动相所用装置必须是干燥的，不得有水。
3.超声波震荡，除气泡。
4.使用0.04%的叠氮钠溶液以防止流动相长菌。
液相色谱基础知识
第一部分原理和分类
一、色谱理论发展简况
色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLC)。也称现代液相色谱。
二、色谱法分类
按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
高效液相色谱流动相
高效液相色谱的流动相（Mobile Phase）
液相色谱流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液。与气相色谱相比较，液相色谱流动相不仅可选择范围比较大，而且它是影响分离的一个非常重要的可调节因素。在实际工作中，流动相的选择和优化是确定色谱分析的主要工作。一、流动相溶剂的选择高效液相色谱中所选用的流动相溶剂必须能保证该色谱系统的分离过程可重复进行：溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求；溶剂应当不干扰检测器的工作；在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。对液相色谱溶剂的要求：1）溶剂要有一定的化学稳定性, 不与固定相和样品组分起反应。2）溶剂应与检测器匹配，不影响检测器正常工作。3）溶剂对样品要有足够的溶解能力，以提高检测灵敏度。4）溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。5）溶剂的沸点低，有利于制备色谱的样品回收。
液相色谱流动相溶剂的选择步骤
选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等
选择合适洗脱强度的溶剂：简单样品，2 ≤ k'≤ 5；复杂样品，0.5 ≤ k'≤ 20
改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的α值
二、表征溶剂特性的重要参数1)溶剂沸点、分子量、相对密度、介电常数、偶极距、折射指数、紫外吸收截止波长、与液相色谱分离密切相关的最重要的溶剂特性参数是溶剂强度参数?? ，溶解度参数?? ，极性参数P'和粘度η。 2) 溶剂洗脱强度溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力。在吸附色谱中, "溶剂洗脱强度"与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
液相色谱流动相基础知识-扫盲篇
一、液相色谱流动相的性质要求
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在SPME填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。因此，k值是流动相组成的函数。塔板数N一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：
①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料会计考试有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧
化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差
折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相溶剂瓶，以提高灵敏度。
④粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂溶剂瓶会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使
分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
二、液相色谱流动相的pH值
采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸会计考试的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸经济师样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L
三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的相互网上培训作用，减轻或消除峰拖尾现象。
所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。
三、液相色谱流动相的选择
在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；BR>正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。
反相色谱的流动相通常以水作网上辅导基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统，但价格较贵。
在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好，也需采用梯度洗脱技
术。
四、液相色谱流动相的滤过
所有溶剂使用前都必须经0.45μm（或0.22μm）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标
签上标明"已滤过"）。
用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于网上听课过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后
滤过，首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。
五、液相色谱流动相的脱气
所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解培训辅导气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。
溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、溶剂瓶、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。
除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测东奥会计应用中的灵敏度。超声培训辅导脱气比较好，10-20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了，此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不
要高出水面太多。
六、液相色谱流动相的贮存
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、
乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受经济师。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相溶剂瓶。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在短期内使用
完毕。