细菌学检验-13-流式细胞技术
细菌学检验-13-流式细胞技术
液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
流式细胞术课件
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
细菌学检验-13-流式细胞技术
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
（二）散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
第十三章 流式细胞术
流式荧光免疫技术：是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理 化特性进行多参数定量分析和纯化（对特定 群体加以分选）的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（flow cytometry，FCM）：集 激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克 隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
（一）基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
光收集系统：光电倍增管（PMT）
FACSCalibur 光路图
（3）电子数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
FACSCalibur
特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
配备1-2根激光
临床型（台式机）
细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
BD LSR
FACS Vantage DiVa
流式细胞检测步骤
流式细胞检测步骤
流式细胞检测是一种常用的细胞分析方法，其步骤主要包括样品制备、细胞染色、细胞分析和数据分析等。
下面是流式细胞检测的一般步骤：
1. 样品制备：对待检测的细胞进行处理，如细胞培养、组织切片、外周血单个核细胞的分离等，得到单细胞悬浮液或细胞悬浊液。
2. 细胞染色：选择相应的细胞染色方法，如细胞膜荧光染色、核酸染色、细胞器标记等，以准确检测感兴趣的细胞亚群或分子表达。
3. 流式细胞仪设置：根据具体实验需求，设置流式细胞仪的参数，如激光波长、光源强度、挡光镜、滤光片等。
4. 样品注射：将细胞悬浮液或细胞悬浊液注入流式细胞仪，以逐个细胞通过检测通道。
5. 细胞分析：流式细胞仪以高速流体力学原理将细胞单个通过探测器，并同时记录细胞的光学参数，如细胞大小、形状、颜色等，以及某些特定标记的荧光信号。
6. 数据分析：根据实验需求，利用流式细胞仪软件或数据分析软件对收集的数据进行处理和分析，如细胞计数、亚群比例、荧光强度等。
7. 结果解读：根据数据分析的结果，进行相应的统计分析、结果解读和图形展示，得出实验结论。
需要注意的是，不同的实验目的和细胞类型可能需要略有差异的具体实验步骤和参数设置。
流式细胞术在细菌快速检测中的应用研究
术对土壤样品中的微 生物进行 定量和定性 检测 。 应用溴化 乙锭 和 具有较大 的应用价值 。
跟１ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ具 有互 补作用 的荧光探针结合 光散射参数对菌体 的 流式 细胞术在 临床 医学 中的应用 ． 还可应用 于其 他病菌 的检
有学者曾应用结合分支杆 菌采用荧光素 Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ Ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ 和二氧 大小进行限定 ， 然后从土壤微生物 的粉尘碎片和群落 中区分 出絮 测。 化硅纳米颗粒两种燃料标记后 ， 结合流式细胞术进行检测 。其检 凝剂产生菌检测菌【 ｌ 】 。
术 和确证实验两种方法进行两种药物敏感性的检测。其检测结果 曾有学者应 用荧光原位杂交 技术结合流式 细胞检测 仪对猪 表明 ， 流 式细胞术和传统 的检测结果具有 一致性 的特征 。 但 更富 谷仓空气和实验室空气 中的微 生物进行测定 。 先用液化 收集器获 有客观 、 自动化和快速 的特性 ， 能够联合应用 于药敏性 的实验研 取样 品， 然后用荧光染 料染色后 ， 应用 流式细胞术辨别样 品粉尘 究 。流式细胞技术还可获取异质性和药敏性的相关信息 。 属于有
ｌ 器 著
中的应用 ， 最初始于对药敏性的检测 。
Ｉ
Ｉ Ｉ ＿
量
ｌ
鲁
嚣
Ｓ ｕ ｌ ｌ ｅ ｒ 曾应用流式细胞术检测氨苄青霉素 、万古霉素 和头孢 他啶 ， 分别对其金黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌 、 绿脓杆菌的药敏性反 应进行检测 。其结果表明 ， 应用流式细胞术能够灵敏 、 快速的对抗 生素的抗菌效应进行检测 ， 同时应用细胞氧化活性燃料 Ｃ Ｔ Ｃ， 可检 测 出多个不同的细胞亚 群 ， 由于不 同的细菌亚群对于抗生素敏感 性并不相同 ， 因此能够较为直观的反映细胞的异质性四 。 付 亮等学
流式细胞术实验方法及应用
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4
数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
FSC
SSC
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，
散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
异硫氰酸（FITC）
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI）
藻红蛋白偶联物（PECY5）
藻红蛋白偶联物（PECY7）
别藻青蛋白（APC）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
激发光波长（nm ）
488 488 488 488
488
633 633
细胞群周期与DNA倍
体时，将DNA含量直 方图分为三部分， 即G0/G1、S、G2/M
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
GG22//MM
(4(4CC) )
三个细胞峰。
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇 4ºC ，24h 离心去固定液 PBS洗2次 RNase
30min PBS洗1次
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
流式细胞技术原理和方法
影响荧光染色的各种因素
• • • • • • 温度的影响 PH的影响 荧光染料浓度的影响 杂质对细胞荧光染色的影响 细胞固定剂对细胞荧光染色的影响 其它因素：溶剂的性质以及溶剂的浓度 对荧光淬灭也有一定作用
流式细胞免疫荧光技术的应用
• • • • • • • • • 细胞表面标志及抗原决定簇性质的研究： 1、血液系统细胞表面标志的研究； 2、细胞群体及细胞表面标志变化的监测； 3、细胞表面抗原决定簇性质的研究； 4、细胞表面标志分子变化的定量研究。 细胞抗原表达的研究 细胞分选和鉴定中的应用 克隆细胞及杂交瘤的选择和鉴定 在细胞免疫功能测定中的应用： 1、细胞介导的细胞毒试验； 2、吞噬功能实验； 3、循环免疫复合物的测定； 4、其他免疫指标的检测。
理可得到多种信息参数。, FSC): 荧光
信号在激光光束垂直的900方向,距喷嘴0.25mm处
进行探测, 光散信号在前向小角0.50 ～ 2.00 的
测定值, 称为 “前向角光散射 (FSC) ”, 这种
光散信号基本上反映细胞体积的大小。
*侧散射（Side Scatter, SSC)：荧光信号在激
流式细胞术的技术特点
• 高速度 • 高灵敏度 • 高精度及高分辨率 • 分选程度高 • 多参数同时分析
影响流式细胞术定量分析的因素 • 激光光源的稳定性 • 细胞流速的稳定性 • 细胞悬液样品的影响 • 细胞荧光染色的影响
流式细胞术对荧光染料的要求
• 必须在理想的激光光源的某一波长有强烈吸收。 • 有较高的量子效应。 • 激发光(excitation)和发射光(emit)之间要有较大的波 长区别。 • 便于同抗体及其它蛋白偶联，又不影响其荧光及抗体 的特异性。
光光束垂直的900方向, 距喷嘴 0.25 mm处进行
流式细胞技术与图像处理
02
非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
03
实验标本的处理
细胞染色
染色要求： 特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群 非特异反应水平低 抗体效价高，用量适用于常规标本 使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度
首选直接标记抗体
荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
Annexin V Assay （建议用于悬浮细胞）
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。
在Ca2+存在时，Annexin V 与PS 有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
台式机 双激光四色，市场覆盖率最高
FACSAria Ⅲ
特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析
科研型分选流式细胞仪
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
鞘液
鞘液
细胞流
激光照射点
流体动力学聚焦示意图
液流驱动系统
进样速率控制
高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。
光学系统
激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。
医学免疫学实验：流式细胞术(Flow Cytometry)的原理及应用
光谱重叠（Spectral overlap）
补偿模型图
FL2
补偿调节前后对比
FL1
数据收集和分析
1 画图（直方图，散点图） 2 寻找目标细胞 3 调整仪器设置到合适的状态 4 我们可以得到怎样的结果？
它们意味着什么？
数据分析
• 设门 • 设定阴性与阳性群体的界限 • 确定阳性与阴性细胞群体 • 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，
流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
Part IV
流式细胞术实验操作 流程及数据分析
流式细胞术操作流程
流式细胞术
✓ 调整仪器设置 ✓ 收集数据 ✓ 分析结果
课堂目标
• 了解流式细胞仪的构造、原理及应用，掌 握“门”，“补偿”两个基本概念。
• 学会简单分析流式数据：小鼠脾脏分离的 单个核细胞中CD3+、CD4+ 、CD8+细胞 的比例。
Content
✓流式细胞仪的简介 ✓流式细胞仪的组成及原理 ✓流式细胞术的应用 ✓流式细胞术实验操作流程
不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。
可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或
贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。
样本类型
可检测颗粒大小
0.2μm
50μm
流式细胞仪能检测哪些信息?
➢ 相对大小: Forward Scatter (FSC)
• 2.染色：小心用枪去除上清，再加入50ul预混抗体的PBS（由助 教准备），将细胞吹打混匀，避光， 4℃或冰上，染色1520min
第13章流式细胞分析技术
三、基于免疫微球技术的应用
CBA 技术
荧光微球 捕获抗体 捕获荧光微球
+
不同荧光
+
强度微球
抗原（细胞因子） 荧光标记抗体
CBA流式检测结果和标准曲线
第四节 流式细胞分析的临床应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于基础研究、临床诊断和研 究应用各方面，特别是在免疫细胞的表型、功能分析和免疫 相关性疾病的诊断、治疗和预后判断中具有重要的意义。
散射光
单细胞液滴
选定细胞群体
荧光信号
加载电荷
偏转高压静电场
液滴偏转
进入分选收集管，完成细胞分选
数据储存，分析。
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求：
- 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 - 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 - 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的
（二）双参数图 二维散点图、密度图和等高图
（三）多维参数的显示 假三维图和三参数点图
三参数以上的显示 主要要依据设门技术进行分析
（四）设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群 分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参 数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。
流式细胞仪特点：
①速度快，每秒可测量数万个微粒；②精度高；③准确性好； ④多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、化学和生物特 性的多参数测量。
二、经典流式细胞仪
（一）基本结构
流式细胞术在细菌快速检测中的应用研究
流式细胞术在细菌快速检测中的应用研究作者：董成霞来源：《中国卫生产业》 2014年第11期董成霞山东省济南市济阳县人民医院，山东济南 251400[摘要] 流式细胞仪被广泛的应用于光学、生物学、流体学和免疫学等领域。
其中流式细胞术是其检测的关键性技术，具有灵敏、快速的特点，在细菌的快速检测中得到较为广阔的应用。
本文就流式细胞术在环境样品细菌检测、临床细菌检测和趋磁细菌研究中的应用前景进行分析，以促进流式细胞技术的发展和完善。
[关键词] 流式细胞术;细菌;快速检测;应用[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）04（b）-0194-02流式细胞术于90年代末期被创建，最初仅用于临床检验和科学研究，由于微生物的粒子或细胞较小，因此在微生物领域应用的较晚。
但在近几年来，随着荧光染料的改良和丰富、光学科技的不断完善，以及流式细胞检测仪自身的不断发展进步。
在如今，流式细胞术在微生物领域得到较为广泛的应用，尤其是对于细菌学问题的解决具有多参数测量精确，并且迅速的特点。
1流式细胞术在环境样品细菌检测中的应用以往对环境样品通常应用的方法为平板法，对微生物的多样性和总菌数的深入研究具有严重的制约性，常会给检测结果带来较大的误差，并且其他传统的检测方法，具有操作复杂繁琐的特点。
但流式细胞是在环境样品中的推广应用，具有测定精准、制备简单、可快速的对多参数数据进行采集，以及可对多元数据进行分析。
如今，流式细胞术已广泛的应用于土壤、水和空气等环境中的微生物研究的重要工具，图1为流式细胞术的样品制备技术。
曾有学者应用荧光原位杂交技术结合流式细胞检测仪对猪谷仓空气和实验室空气中的微生物进行测定。
先用液化收集器获取样品，然后用荧光染料染色后，应用流式细胞术辨别样品粉尘杂质中的菌体，并且可通过计数处理，获取细菌总数。
流式细胞术还可用以土壤样品的检测，Jean Christophe等学者应用流式细胞术对土壤样品中的微生物进行定量和定性检测。
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞技术
流式细胞术（FCM）简述流式细胞术(Flow Cytometry)是70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性（细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等）进行定量、快速、客观多参数相关检测分析的新技术。
它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。
为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器。
FCM的基本原理1、流式细胞仪系统流程：标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统→结果打印2、基本原理：待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后进入充满鞘液的流动室，鞘液压力与样品流压力是不同的，当二者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。
如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性的标上荧光染料，那麽这些染料将在细胞通过激光检测区时受激光发出特定波长的荧光,通过一定波长选择通透性的滤色片,我们可将不同波长的散射光、荧光信号区分开来，并送到不同的光电倍增管中，经过一系列的信号转换、放大，数字化处理，我们就可以在计算机直观的统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。
选择不同的单克隆">克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FC同时测定一个细胞上的多种不同特征；如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。
3、意义：FCM与单克隆">克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验与研究的重要指标。
流式免疫荧光技术不仅能将表达位点的细胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。
流式细胞技术(张华屏)
特
点
（1）测量速度快
（2）高灵敏度 （3）高精确度 （4）多参数 （5）高纯度分选技术
流动室和液流系统；激光源和光学系统； 光电管和检测系统；计算机和分析系统。
流式细胞仪的工作原理
待测细胞被制成单细胞悬液，经特异 性荧光染料染色后加入样品管中，在 气体压力推动下进入流动室，与水平 方向的激光光束垂直相交，细胞受到 强烈的激光照射后发出荧光，同时产 生散射光。细胞发出的荧光信号和散 射光信号，同时被荧光光电倍增管接 收，被积分放大反转换为电子信号输 入电子信息接收器、通过计算机快速 而精确地将所测数据计算出来，结合 多参数分析，从而实现了细胞的定量 分析。
散射信号
在流式细胞术测量中，常用的是两种散 射方向的散射光测量：①前向角（即 0℃角）散射（FSC）；②侧向散射（ SSC），又称90℃角散射。 这里所说的角度指的是激光束照射方向 与收集散射光信号的光电倍增管轴向方 向之间大致所成的角度。
散射光信号—前向散射光
FSC----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测 器
利用各种不同波长的光学滤片来收集(检 测)这些光学信号
抗体标记的方法
荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）： 深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm – 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm – 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激 光激发
荧光素的选择
FITC最便宜，适用于强表达抗原，适 用范围广 PE最强，适用于弱表达抗原
论临床医学检验中的流式细胞技术
论临床医学检验中的流式细胞技术本文详细的论述了临床医学检验中的流式细胞技术,并详尽的分析流式细胞技术的分析系统和分析方法。
标签：流式细胞技术临床医学检验1流式细胞技术概述流式细胞技术又可称为流式细胞分析(flow cytometry),主要是依靠流式细胞仪来测量悬浮细胞,并通过激光、计算机、电子、流体力学和多种生物科学技术来分析细胞的特性与功能。
在临床医学检验中流式细胞技术被应用于细胞生物检验、血液检验、肿瘤检验等医学检验。
2流式细胞技术的分析系统流式细胞技术的分析系统主要由3大部分组成,其中包括液流系统、电子系统和光学系统。
2.1光学系统光学系统(optical system)主要由激光和收集光学的元件组成,包括各种激光器和多组透镜。
各种不同功率的激光器可以提供单波长、高强度及稳定性高的不同波长激光,结合透镜的作用使激光束整形和聚焦,以此来检验细胞的特性。
2.2液流系统液流系统(fluidics system)主要是将被测的细胞通过液体流传递至流动室,经过液流聚焦形成单细胞流,并使其通过检测区,完成检验。
不同的仪器流动室也不尽相同,一般供单细胞流过的流动室都具有良好的光学特性,流速也较慢,细胞受照时间也较长,可收集的细胞信号光通量较大,配上收集透镜可获得很高的检测灵敏度和精密度。
2.3电子系统流式细胞电子系统的主要作用是将各种光信号成比例的转换为电信号,并进行数字化处理后传入电子计算机。
在光信号转换过程中光电倍增管具有较高的灵敏度,常用于收集细胞和微球与激光束相互作用产生的较微弱的侧向散射光或荧光信号。
3流式细胞技术的分析方法3.1流式细胞免疫表型分析方法采用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针,流式细胞仪检测细胞上的特异性抗原分子,这种方法被称为流式细胞免疫表型分析。
流式免疫表型分析可以简便、快速的分析出细胞的种类、亚类、功能等特性,通过间接免疫荧光染色、直接免疫荧光染色、多色免疫荧光染色等方法进行检验,流式细胞仪可同时鉴别单个细胞上的多种抗原,而且在极短的时间内能分析大量的细胞,使流式细胞技术成为了当前较为先进的细胞分析技术,在临床应用上也较为广泛,例如:血液淋巴细胞免疫表型、白血病细胞免疫表型、血小板免疫表型等。