小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白抗体制备
抗体制备技术的发展和医学应用
抗体制备技术的发展及其医学应用抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。
它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。
国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。
抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。
多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。
因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1 抗体的发展抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。
1.1 免疫血清学研究阶段免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。
2021高三生物人教版一轮教师用书：选修3 第1讲 基因工程 Word版含解析
第1讲基因工程1.基因工程的诞生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)3.基因工程的应用(Ⅱ)4.蛋白质工程(Ⅰ)1.基因的结构与功能。
(生命观念)2.基因工程的操作流程图及蛋白质的流程图等。
(科学思维)3.基因工程的应用和蛋白质工程。
(科学探究)4.正确看待转基因生物与环境安全问题。
(社会责任)基因工程的基本工具及基本程序1．基因工程的概念(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)优点①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：识别——双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点⎩⎨⎧ 能自我复制有一个至多个限制酶的切割位点有特殊的标记基因③运载体的作用：携带外源DNA 片段进入受体细胞。
3．基因工程的基本程序(1)目的基因的获取①从基因文库中获取 ②人工合成⎩⎨⎧利用mRNA 反转录合成通过DNA 合成仪用化学方法人工合成③利用PCR 技术扩增(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成(3)将目的基因导入受体细胞①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法生物类型植物动物微生物受体细胞体细胞受精卵大肠杆菌或酵母菌等常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射法感受态细胞法方法检测或鉴定目的水平DNA分子杂交技术检测目的基因的有无个体水平分子杂交技术目的基因是否转录抗原—抗体杂交目的基因是否翻译抗虫或抗病接种实验是否具有抗虫抗病特性分子水平(1)原理：DNA双链复制。
小麦黄花叶病毒外壳蛋白基因RNAi表达载体的构建及遗传转化
Ｃｏ ｎｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ０ ｆ ＲＮＡ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎｃ ｅ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｏ ｆ Ｗｈ ｅ ａ ｔ ｙ ｅ ｌ ｌ ｏ ｗ ｍｏ ｓ ａｉ ｃ ｖ ｉ ｒ ｕｓ ｃ ｏ ａ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｇ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ｇ ｅ ｎｅ ｔ ｉ ｃ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ａｔ ｉ ｏ ｎ
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ Ｄ 『 ‘ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ １ ０ ０ １ ９ ３ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｗｈ ｅ ａ ｔ ｙ ｅ ｌ ｌ ｏ ｗ ｍｏ ｓ ａ ｉ ｃ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ，ｃ ａ ｕ ｓ ｅ ｄ ｂ ｙ ｔ ｈ ｅ Ｗｈ ｅ ａ ｔ ｙ ｅ ｌ ｌ ｏ ｗ ｍｏ ｓ ａ ｉ ｃ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ（ Ｗ ＹＭ Ｖ ） ，ｉ ｓ ａ ｎ ｉ ｍｐ ｏ ｒ ｔ ａ ｎ ｔ ｄ ｉ ｓ — ｅ ａ ｓ ｅ ｉ ｎ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｒ ｅ ｇ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｃｈ ｉ ｎ ａ ． ＲＮＡ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ（ ＲＮＡｉ ），ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｗａ ｓ ｔ ｒ ｉ ｇ ｇ ｅ ｒ ｅ ｄ ｂ ｙ ｄ ｏ ｕ ｂ ｌ ｅ — ｓ ｔ ｒ ａ ｎ ｄ ｅ ｄ ＲＮＡ
（ ｄ ｓ ＲＮＡ ） 。ｌ ｅ ａ ｄ ｓ ｔ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｌ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ｐ ｈ ｅ ｎ ｏ ｍｅ ｎ ｏ ｎ ．Ｉ ｎ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｓ 。ＲＮＡｉ ｈａ ｓ ｂ ｅ ｅ ｎ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｉ ｔ ｅ ｄ ｅ ｘ ｔ ｅ ｎ ｓ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｓ ｕ ｐ ｐｒ ｅ ｓ — ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ ＲＮＡ－ ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ — ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ．Ｉ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ，ｔ ｈ ｅ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｃ ｏ ｎ ｔ ａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ａ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ Ｗ ＹＭ Ｖ ｗａ ｓ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｅ ｄ ａ ｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ＲＮＡｉ ｐ ｒ ｉ ｎ ｃ ｉ ｐ ｌ ｅ ．Ｕｓ ｉ ｎ ｇ ｐ ａ ｒ ｔ ｉ — ｃ ｌ ｅ ｂ ｏ ｍｂ ａ ｒ ｄ ｍｅ ｎ ｔ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ，ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｐ Ｗ Ｍ Ｂ０ ０ ６ Ｄｓ ＣＰ ａ ｎ ｄ ｔ ｈｒ ｅ ｅ ｅ ｍｐ ｔ ｙ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ｐ ＷＭ Ｂ ０ ０ ６，
西葫芦病毒病的防治措施
西葫芦病毒病的防治措施西葫芦病毒病：又叫毒素病、花叶病等，群众称疯病，属全国性病害，露地西葫芦最易感病，是一种毁灭性病害。
（1）为害症状西葫芦病毒病因毒原种类不同，分为黄化皱缩型、花叶型和两者的混合型。
①黄化皱缩型幼苗、成株均可发病，植株上部叶片先表现沿叶脉失绿，并出现黄绿色斑点，以后整叶黄化，皱缩下卷，植株节间缩短，矮化。
病株大部分不能结瓜，或瓜小且畸形。
②花叶型幼苗4～5片真叶时即可发病，新叶出现褪绿斑点，以后表现为花叶，有深绿色凸起疱斑，严重时顶叶变为鸡爪状。
茎节缩短，植株矮化，不结瓜或果实畸形。
（2）发病规律本病病原为黄瓜花叶病毒，除了寄主之外，尚有种子带毒之说。
主要传播媒介为蚜虫，通过接触也可传播。
自然条件下，天气干旱，气温偏高，蚜虫严重时，病毒病发生早而重。
温室内有多种蔬菜或杂草等病毒的寄生植物，且有蚜虫发生时，发病机会多。
而缺水缺肥时，发病植株的症状表现尤为严重。
（3）农业防治措施①泥浆选种带有病毒的种子比正常种子为轻，可以通过泥浆选种剔除。
②药剂消毒浸种后用10％的磷酸三钠浸泡20～30分钟，用清水冲洗后再进行催芽。
消除田间或温室内的杂草，减少病毒寄生。
彻底治蚜，消除传毒介体。
加强肥水管理，培育健株，提高植株的抗病能力。
（4）药剂防治2个子叶展平时，用抗病威600～800倍液，或用病毒必克600～800倍液，或抗毒剂1号对300～400倍液喷雾，并结合灌根。
也可每7～10天喷1次5毫克／升的萘乙酸溶液，连喷2～3次。
发病时可用下列混合药液喷雾：五合剂：0.1％高锰酸钾+0.3％磷酸二氢钾+1％食用醋+0.5％尿素+0.5％红（白）糖，7～10天1遍，连喷3遍。
发病初期喷用，第一次用药时喷洒量要大些。
菌毒清合剂:0.25％菌毒清+0.3％磷酸二氢钾+0.2％硫酸锌，5～7天1遍，连喷3遍。
医用病毒灵10片+硫酸锌40克+高锰酸钾12.5克+农用链霉素2.5克，上述药剂碾碎后，先溶解在少量冷水中（热水易使容器爆裂），然后加足12.5千克冷水，再按0.5～1毫克／升的浓度加入三十烷醇，5～7天1遍，连喷3遍。
利用酵母双杂交系统研究植物与病毒蛋白相互作用的进展
植物遗传资源学报2006,7(4):477～483Journal of Plant Genetic Res ources利用酵母双杂交系统研究植物与病毒蛋白相互作用的进展黄大辉,张增艳,辛志勇(中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物遗传育种重点实验室,北京 100081) 摘要:在长期进化中,植物形成了抵御病毒等病原微生物侵染的精细防御系统。
在病毒侵染、复制和传播过程中,其编码的一些蛋白,如外壳蛋白、运动蛋白、复制酶类等能够与植物基因编码的蛋白发生相互作用。
酵母双杂交系统是体外研究蛋白质间相互作用的有利工具,不但可以用于研究已知蛋白质的互作,还可以发现新蛋白,揭示特定蛋白互作网络与作用机制,在植物蛋白与病毒蛋白互作研究中已得到广泛的利用。
本文主要综述利用酵母双杂交系统研究植物与病毒蛋白相互作用的国内外进展。
关键词:酵母双杂交;植物;病毒收稿日期:2006209228基金项目:国家“863”计划(2004AA222120)作者简介:黄大辉(19772),男,在读博士,研究方向为小麦抗病分子生物学通讯作者:张增艳,研究员,博导,主要从事小麦分子生物学研究;辛志勇,研究员,博导,主要从事小麦遗传育种研究Advances of the I nteracti on between Protei n s of Pl ant andVi rus Usi n g Yeast Two Hybr i d M ethodHUANG Da 2hui,Z HANG Zeng 2yan,X I N Zhi 2yong(Key L aboratory of C rop Genetics and B reeding of M inistry of A griculture /Institute ofC rop Science,Chinese A cade m y of A gricultural Sciences,B eijing,100081) Abstract:During l ong ti m e evoluti on,p lants devel oped elaborate defense pathway and comp licated mechanis m sagainst virus and other pathogens .V irus p r oteins,such as coat p r otein (CP ),move ment p r otein (MP )and poly 2merase p r otein,would interact with host p lant p r oteins during virus infecti on p r ocess .The yeast t w o hybrid syste m is a useful method t o analyze the interacti on bet w een p r oteins in vitr o and app lied widely in studying the interacti on bet w een p r oteins of p lant and virus .This article mainly p resented the advances of the p r otein interacti on of p lant and virus by using yeast t w o hybrid during the past decade .Key words:Yeast t w o hybrid;Plant;V irus 在长期进化过程中,植物发展起来一系列防御病原微生物的精细网络系统。
小西葫芦黄花叶病毒研究进展
小西葫芦黄花叶病毒研究进展作者：唐超陈远超朱春晖刘勇张德咏来源：《江苏农业科学》2016年第09期摘要：小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），同时也是一种侵染葫芦科植物的主要病毒，近年来该病毒的危害愈加严重，如何防控ZYMV已经成为种植户和社会高度关注的问题。
本研究就ZYMV的分类地位、传播途径、检测方法、防治方法等进行综述，并进行展望。
关键词：小西葫芦黄花叶病毒；分类；传播途径；检测方法；防治方法中图分类号： S432.4+1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）09-0018-03小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）最早是由Lisa等[1]在意大利和法国的小西葫芦上发现的一种严重危害生产的病毒。
ZYMV属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），同时也是一种侵染葫芦科植物的主要病毒。
整个病毒粒子大小约为750 nm×11 nm，无包膜，由4.5%～7%的核苷酸和93%～95%的蛋白质组成，基因组大小为9.6 kb，是单个ORF，编码10个功能蛋白[2]。
ZYMV能够侵染葫芦科、苋科、藜科、豆科在内的11个属的植物。
在自然环境下，葫芦科植物感染病毒后会产生严重的系统性叶缘坏死、花叶、斑驳、褪绿黄化等症状；造成瓜类作物产量降低，果实出现不同程度的畸形，果实口感僵硬，味道苦涩，商品价值降低[3]。
苗期感染将会对葫芦科作物造成95%～100%的损失，同时感病植株所收获种子的发芽率大大降低[4]。
随着葫芦科作物种植面积扩大，如何防控ZYMV已经成为种植户和社会高度关注的问题。
因此，本研究就ZYMV的分类地位、传播途径、检测方法、防治方法等进行综述，并就相关方面进行展望，以期为葫芦科作物生产中防控ZYMV提供相关的基础知识。
西葫芦病毒病
02
西葫芦病毒病病原学
病原种类及特点
黄瓜花叶病毒（CMV）
粒体球形，直径约28～30纳米，病汁液稀释终点1000～ 10000倍，病毒在20℃条件下，2～3小时就能使西葫芦叶片 出现花叶，在寄主植物体内存在时间很长，且病毒致病力很 强，种子带毒，田间主要通过蚜虫传播。
甜瓜花叶病毒（MMV）
病毒粒体球形，直径28～30纳米，10%磷酸三钠浸种20分钟 后，带毒率由15%降到1.3%，摩擦接种可侵染葫芦科等多种 植物，在田间自然条件下主要靠蚜虫传播。
侵染循环与传播途径
侵染循环
病毒在田间存在明显的越冬期，主要 在多年生宿根植物上越冬，如田间杂 草等。春季气温回升后，病毒开始活 跃，通过蚜虫等昆虫传播到西葫芦上 ，引起发病。
传播途径
主要通过蚜虫等昆虫进行非持久性传 播，也可通过汁液摩擦接种传病。此 外，种子也可带毒传播。
致病机制与影响因素
致病机制
加强农民培训
通过举办培训班、现场指导等方式，提高农 民对西葫芦病毒病的认识和防控能力。
开展科普宣传
利用广播、电视、网络等媒体，广泛宣传西 葫芦病毒病的危害、传播途径和防控方法， 增强农民的防范意识。
THANKS
感谢观看
种子消毒
采用干热消毒或药剂拌种等方法 对种子进行消毒处理，以降低病 毒病的传播风险。
田间管理与栽培措施
合理密植
根据地力、施肥水平等因素确定 合理的种植密度，避免过密或过 稀种植，以保证植株生长健壮，
提高抗病能力。
肥水管理
合理施肥，增施磷钾肥，避免偏施 氮肥；适时浇水，保持土壤湿润， 促进植株生长。
06
西葫芦病毒病综合防控技 术
监测预警与信息传递
小西葫芦黄花叶病毒研究进展
摘要小西葫芦黄花叶病毒病是瓜类作物的一种严重病害。
本文对小西葫芦黄花叶病毒的分类、结构特点、生物学特性及其病毒载体的研究现状进行综述,以期为其防治提供参考。
关键词小西葫芦黄花叶病毒;结构;生物学特性;病毒载体中图分类号S481+.1文献标识码A 文章编号1007-5739(2018)08-0139-02Research Progress of Zucchini Yellow Mosaic Virus HE Li-hua WU Juan CHEN You-qian ZHU Xi-wu *(College of Agriculture and Biotechnology ,Hunan University of Humanities ,Science and Technology ,Loudi Hunan 471000)Abstract Zucchini yellow mosaic virus disease is a serious disease of melon crops.This review summarized the research status of the classification ,structural characteristics ,biological characteristics and viral vectors of zucchini yellow mosaic virus ,in order to provide references for its prevention and control.Key words zucchini yellow mosaic virus ;structure ;biological characteristic ;viral vector小西葫芦黄花叶病毒研究进展何丽华吴娟陈友倩竺锡武*(湖南人文科技学院农业与生物技术学院,湖南娄底417000)小西葫芦黄花叶病毒病是一种严重的植物病害,主要侵染甜瓜、黄瓜、西葫芦、西瓜等葫芦科作物。
菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析
摘 要 以菜 豆黄花 叶病 毒分 离物 、 豆 、 豆 为试验 材料 ， 蚕 豌 进行 了菜豆 黄花 叶病毒 外 壳蛋 白（ Ｐ 序 列分 析 。 Ｃ） 结果 显 示 ． 目标 片段 中 包含 ８９ｂ １ ｐ的 外壳 蛋 白序 列 ， 码 ２ ３个 氨 基 酸 。 离物 的外 壳 蛋 白基 因核 苷 酸 和 推 导 编 码 蛋 白质 的 氨基 酸序 列 的 同 源 性 分 另 为 ９ ．％ 编 ７ 分 Ｉ ８７ ｊ ９． ９ ％和 ９ ， １００ 与 ６ ９ ８ ％一 ０ ． ９ ％。 ５个 菜豆 黄花 叶病 毒 外 壳蛋 白进 行序 列 同源 性和 系统进 化树 分析 的结 果表 明 ， 豆黄 花 叶病 毒 青 海蚕 豌豆 菜 分 离物 与云 南蚕 豆分 离物 同源性 最 高。 壳蛋 白的序 列 特征 揭示 ， 外 ＮＡＧ为 菜豆黄 花 叶病毒 中病 毒的 蚜传 相 关基序 关键 词 菜豆 黄花 叶病毒 ； 豆和 豌豆 分 离物 ： 蚕 外壳蛋 白 中图分类 号 Ｑ７ 文献 标识 码 Ａ ８ 文 章编 号 １０ — ７ ９ ２ ｌ ）Ｏ ０ ４ — ２ ０ ７ ５ ３ （ｏ １ ｌ 一 ０ ４ ０
Ｍ 】 ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ 】 ｌ Ｏ 】
１２１ 设计 引物 ［ 设计 外壳 蛋 白基 因 序列 引物 （ 向 、 向 ． ． Ｊ Ｊ 。 正 反 引物 ）其 中正 向引物 序 列为 Ｄ ９ ４ 一 Ｐ ５－ Ｃ ＡＣ ＡＣ 。 ８ ５ ５ Ｃ Ｕ： ＇ＧＧ Ａ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ 一 对 应 Ｄ８ ５ ５１０ — ７ ６ ， 向弓 物 序 Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｃ ３（ ９ ４ ７ ６ １２ ） 反 １
￣
菜豆 黄 花 叶病 毒 （ ｅｎｙ ｌ ｗ ｍ ｓｉ ｖｒｓ Ｂ Ｂ ａ ｅｌ ｏａｃ ｉ ，ＹＭＶ） 蚕 ｏ ｕ 是 豆 和 豌 豆 生 产 中 的 一 个 重要 病 原 ， １ 蚕 豆 和 豌 豆 花 叶 弓起 病 ， 病 害在 很 多 国家 均 严 重发 生 过 口］ ０ ４ ２ ０ 该 －。 ０ － ０ ６年 ， ６２ 笔 者对 中国蚕 豆 、 豆 生产 主 区 进行 调 查 ， 豌 发现 发 生 最 普 遍 、
小西葫芦黄花叶病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆
小西葫芦黄花叶病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆作者：刘莉铭彭斌康保珊吴会杰刘茜古勤生来源：《中国瓜菜》2023年第12期摘要：病毒侵染性克隆是病毒与寄主互作研究的有力工具，分析了小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）甜瓜分离物CH-87的基因组序列和分子变异，构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。
结果显示，CH-87分离物基因组全长为9592 nt，与其他分离物的全基因组核苷酸和多聚蛋白氨基酸的序列一致性平均值分别为91.42%、96.45%。
基于CP 蛋白和多聚蛋白氨基酸序列的系统进化分析显示，CH-87分离物与美国的BL-67南瓜分离物亲缘关系最近，与中国的CN∶Lc∶17丝瓜分离物亲缘关系次之，均聚于亚组Ⅴ中。
接种试验显示，CH-87分离物的克隆具有侵染性，能系统侵染甜瓜、黄瓜、西瓜和西葫芦，经接种产生的病毒后代也具有侵染性。
关键词：小西葫芦黄花叶病毒；甜瓜分离物；基因组；侵染性克隆中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）12-009-07The genome and infectious clone of zucchini yellow mosaic virus melon isolateLIU Liming1，2， PENG Bin1， KANG Baoshan1，2， WU Huijie1，2， LIU Xi1，2，GU Qinsheng1，2（1.Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology/Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453500， Henan，China）Abstract： Viral infectious clone is a powerful tool for studying the interaction between virus and host. In this study， the genome sequence of zucchini yellow mosaic virus （ZYMV） melon isolate CH-87 was cloned and analyzed， and its full-length cDNA clone was constructed. The results showed that the genome of isolate CH-87 was 9592 nt in length， and the average nucleotide and amino acid sequence identities between CH-87 and other isolates were 91.42% and 96.45%，respectivly. Phylogenetic analysis based on CP and polyprotein amino acid sequences showed that CH-87 was most closely related to isolate BL-67 from The United States， followed by isolateCN∶Lc∶17 from China， and they all clustered in subgroup Ⅴ. The inoculation showed that the infectious clone was successfully constructed， and it could systematically infect melon，cucumber， watermelon and zucchini. The progeny produced from the clone was infectious by mechanical inoculation.Key words： Zucchini yellow mosaic virus; Melon isolate; Genome; Infectious clone小西葫蘆黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），通过蚜虫、机械接触和种子进行传播，主要侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、西葫芦等瓜类作物，引起植株生长缓慢、矮化、花叶、蕨叶、新叶变小、果实畸形等，造成巨大经济损失，严重制约瓜果产业的可持续发展。
菜豆黄花叶病毒RPA-LFD技术快速检测方法的建立与应用
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［２４］ＣａｏＳＬ，ＬｏｌａｄｚｅＡ，ＹｕａｎＹＢ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔａｒｓｐｏｔｃｏｍｐｌｅｘｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｍａｉｚｅｕｓｉｎｇｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ－ｂｙ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳＮＰｓａｎｄｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｅ，２０１７，１０（２）：ｐｌａｎｔｇｅｎｏｍｅ２０１６．１０．００９９．［２５］ＬｉｕＸＧ，ＷａｎｇＨＷ，ＷａｎｇＨ，ｅｔａｌ．Ｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｇｅｎｏｍｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｅｍｐｉｒｉｃａｌｅｖｉｄｅｎｃｅｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＴｈｅＣｒｏｐＪｏｕｒｎａｌ，２０１８，６（４）：３４１－３５２．［２６］ＬｏｒｅｎｚａｎａＲＥ，ＢｅｒｎａｒｄｏＲ．Ａｃｃｕｒａｃｙｏｆｇｅｎｏｔｙｐｉｃｖａｌｕｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓｆｏｒｍａｒｋｅｒ－ｂａｓｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｂｉｐａｒｅｎｔａｌｐｌａｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００９，１２０（１）：１５１－１６１．［２７］ＭｏｏｒｅＪＫ，ＭａｎｍａｔｈａｎＨＫ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＶＡ，ｅｔａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｇｅｎｏｍｉｃｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｆｏｒｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔｓｐｒｏｕｔｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｗｈｅａｔｂｙｗｅｉｇｈｔｉｎｇｌａｒｇｅ－ｅｆｆｅｃｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉ［Ｊ］．ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，２０１７，５７（３）：１３１５－１３２４．［２８］ＳｐｉｎｄｅｌＪＥ，ＢｅｇｕｍＨ，ＡｋｄｅｍｉｒＤ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌｓｔｈａｔｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｅｎｏｖｏＧＷＡＳａｒｅａｐｏｗｅｒｆｕｌｎｅｗｔｏｏｌｆｏｒｔｒｏｐｉｃａｌｒｉｃｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，２０１６，１１６（４）：３９５－４０８．朱宇翔，秦嘉超，季英华，等．菜豆黄花叶病毒ＲＰＡ－ＬＦＤ技术快速检测方法的建立与应用［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（１４）：７０－７５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．１４．００９菜豆黄花叶病毒ＲＰＡ－ＬＦＤ技术快速检测方法的建立与应用朱宇翔１，２，秦嘉超１，２，季英华３，陈 新１，陈学好２，崔晓艳１（１．江苏省农业科学院经济作物研究所，江苏南京２１００１４；２．扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州２２５００９；３．江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京２１００１４） 摘要：根据菜豆黄花叶病毒（ｂｅａｎｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，简称ＢＹＭＶ）外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针，建立蚕豆中ＢＹＭＶ的重组酶聚合酶扩增（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，简称ＲＰＡ）检测方法。
小西葫芦黄花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析
小西葫芦黄花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析付晶晶;杨彩霞;韩彤;廖一鸣;李梁;李梦新;孙伟;王蒴【摘要】从辽宁省沈阳市和盖州市分别采集表现花叶的南瓜样品,经透射电镜负染色实验,观察到典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)线状病毒粒子.利用Potyvirus通用引物LegpotyF/LegpotyR分别对3个沈阳样品和3个盖州样品进行RT-PCR 扩增,得到预期片段,克隆并测序.Blast显示6个病毒样本与小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)同源性最高,均大于99%.利用已经报道的特异引物ZYMV-F/ZYMV-R,从6个样本中扩增到约1.2 kb的ZYMV片段,片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因.基于CP的核苷酸序列同源性分析,发现2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高,达99.1%和99.4%.系统进化树分析表明,2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14]聚集在一个分支,推测ZYMV辽宁分离物与山西分离物亲缘关系最近.%Cucurbita moschata samples showing yellow mosaic symptoms were collected from Shenyang and Gaizhou, Liaoning Prov-ince, and virions with a typical morphology of Potyvirus were observed by transmission electron microscope ( TEM) . The universal degenerate primers LegpotyF/LegpotyR was used for Potyviruses detection for 3 symptomatic leaf samples from Shenyang and Gaizhou by RT-PCR. Subsequently, the expected fragments were amplified, cloned and sequenced. Blast results showed that all 6 samples shared the highest identities with Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) (all above 99%). Based on specific primers ZYMV-F/ZYMV-R, 1.2 kb ZYMV fragment containing complete coat protein (CP) gene was obtained. Referring to the nucleotidesequence of CP, homology analysis results confirmed that two Liaoning isolates of ZYMV had the highest homology with Shanxi isolate ZYMV-[ CN:SX:Chrysanthemum:14] ( KP742962) , with identity being 99.1% and 99.4%. The phylogenetic tree results showed that they were also clustered with ZYMV-[ CN:SX:Chrysanthemum:14] in the same branch. Liaoning isolates of ZYMV was considered being most related to Shanxi isolates.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(046)005【总页数】7页(P488-494)【关键词】小西葫芦黄花叶病毒;辽宁分离物;序列分析【作者】付晶晶;杨彩霞;韩彤;廖一鸣;李梁;李梦新;孙伟;王蒴【作者单位】沈阳大学生命科学与工程学院,辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁沈阳110044;沈阳大学生命科学与工程学院,辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁沈阳110044;沈阳大学生命科学与工程学院,辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁沈阳110044;沈阳大学生命科学与工程学院,辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁沈阳110044;沈阳大学生命科学与工程学院,辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁沈阳110044;沈阳大学生命科学与工程学院,辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁沈阳110044;沈阳大学生命科学与工程学院,辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,辽宁沈阳110044;沈阳农业大学分析测试中心,辽宁沈阳110866【正文语种】中文【中图分类】S432.1小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus，也为Potato virus Y,PVY)的成员[1]，病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长度为750 nm.基因组为长9.5 kb的单链正义RNA(positive single-stranded RNA, +ssRNA)，5′端具有一个共价结合基因组连接蛋白(viral protein genome-linked, VPg)，3′端为20～160 nt个腺苷酸组成的Poly(A)尾巴[2].基因组编码一个350 kD的多聚蛋白(polyprotein)，翻译后加工切割成解旋酶、复制酶和衣壳蛋白等8～10个蛋白参与病毒的复制、运动和包装[3].目前，研究较深入的是ZYMV的衣壳蛋白(coat protein,CP)，发现CP除了参与病毒的组装，还参与病毒转录、移动和介体传播[4].在田间，ZYMV主要以蚜虫经非持久性方式进行传播[5-7]；自然寄主范围广泛，可侵染西葫芦、南瓜、西瓜、罗汉果、黄瓜、甜瓜、冬瓜、丝瓜、节瓜、瓠瓜、苦瓜、香瓜等葫芦科植物[8-13]，常造成叶片坏死、褪绿或黄斑驳以及果实畸形等症状，严重影响作物的产量和商品价值[14-15].近年来，ZYMV已在我国迅速蔓延，在北京、山东、湖南、江苏、广西、广东、甘肃和新疆等地广泛发生危害[8,10,13,16-20]，但尚未见其在辽宁发生的相关报道.2016年，笔者在辽宁沈阳和盖州地区均发现疑似病毒侵染的南瓜样品，通过透射电镜观察和分子检测，明确侵染南瓜的病毒种类，并分析其分子特征，以期为该病害的防治提供依据.2016年8月，从辽宁省沈阳市和盖州市采集表现花叶症状的南瓜样品，保存于-80 ℃超低温冰箱备用.以cDNA作为模板，先后用Potyvirus检测通用引物[11]PVY-LegpotyF (5′-GCWKCHATG ATYGARGCHTGGG-3′)/PVY-LegpotyR(5′-AYYTGYTYMYCHCCATCCAT-3′)和ZYMY特异性引物[20]ZYMV-F(5′-AAGAAGAAGTGCGAGAATTGG-3′)/ZYMV-R(5′-CTTTACGCTTTAAAGGTGGGA-3′)进行PCR扩增(引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成).PCR反应体系为25 μL，循环参数：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35个循环，72 ℃延伸10 min.将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用TIANgel Midi Purification Kit[天根生化科技(北京)有限公司]对目的DNA条带进行回收和纯化.回收产物与pMD18-T[宝生物工程(大连)有限公司]克隆载体于16 ℃连接1 h后，转入DH5α菌株的感受态细胞进行过夜培养.挑取单菌落，280 r·min-1、37 ℃摇床培养7 h，取3 μL菌液进行PCR鉴定.阳性样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序.新鲜南瓜病叶于透射电镜下进行病毒粒子的负染色观察，可见750 nm×13 nm的线性粒子，病毒粒子外表面无包膜(图1).病毒粒子形态特征显示该病毒可能为Potyvirus属成员.利用属通用引物PVY-LegpotyF/R对南瓜病叶的cDNA扩增得到701 bp的特异性片段，而健康南瓜叶片中未检测到该片段(图2A).测序结果显示该片段与ZYMV 高度同源.利用ZYMV特异性引物ZYMV-F/R对南瓜样品扩增，获得包含完整CP 基因的长约1.2 kb的片段(图2B).经Blast比对，PVY-LegpotyF/R扩增片段与ZYMV的一致性为91%～97%，该片段含有部分CP基因.ZYMV-F/R扩增片段含有849 nts的CP基因(GenBank登录号为KY495594-KY495599)，编码282个氨基酸.6个分离物的同源性高达99.8%，选取ZYMV-LNsyA和ZYMV-LNgzA分离物进行同源性和系统进化分析.同源性分析显示，它们均与ZYMV的中国山西菊花分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高，分别达99.1%和99.4%(表1).基于CP基因构建系统进化树，ZYMV-LNsyA和ZYMV-LNgzA与中国山西菊花分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)、韩国西葫芦分离物ZYMV-[SK:Cucurbita pepo](AB369279)、韩国黄瓜分离物ZYMV-[SK:Cucumber](AF062518)、中国山西南瓜分离物ZYMV-[CN:SX:Squash](AY61102-AY611024)、韩国南瓜分离物ZYMV-[SK:Cucurbita moschata](AY278998-AY279000)和中国河南甜瓜分离物ZYMV-[CN:HN:Melon](AY611022)聚集在第Ⅲ簇；第Ⅰ簇分离物最多，包括欧洲分离物(塞尔维亚、法国和德国)、南美分离物(委内瑞拉)、澳洲分离物(澳大利亚)和亚洲分离物(伊朗、以色列、叙利亚、印度和巴基斯坦)；第Ⅱ簇分离物主要来自欧洲(波兰和意大利)、非洲(马里和南非)和亚洲(中国和日本)；第Ⅳ簇分离物均来自中国台湾和中国浙江；第Ⅴ簇是2个新加坡分离物；PMMV-[CN:LN](KU646837)作为外群组单独成一个分支(图3).Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ簇均为亚洲分离物，主要来自中国、韩国和新加坡.亚洲其他地区(日本、印度、伊朗、以色列和巴基斯坦)分离物与欧洲、非洲、美洲和澳洲分离物聚集在Ⅰ和Ⅱ簇中.可见，ZYMV没有明显的地理和寄主限制.根据第九次病毒分类委员会报道的Potyvirus分类标准(CP基因的核苷酸同源性低于76%，或者CP基因的氨基酸同源性低于80%，可认为是PVY属的一个新种)[1]，可判定侵染辽宁沈阳和盖州地区南瓜的病菌为小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV).Potyvirus是Potyviridae中最大的属，包含143个确定种和32个暂定种[1].目前，辽宁仅报道了西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)西瓜分离物[23]、PVY烟草分离物[24]、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)甘薯分离物[25]和百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)百合分离物[26]，尚无ZYMV的相关信息.ZYMV主要危害瓜类葫芦科作物[8-13]，而瓜类作物又是辽宁省农民增收的重要产业(种植面积约13.3万hm2，产值约100亿元)[27]，因此，有必要对ZYMV病害进行调查和检测，为该病害的防治提供理论基础.本研究首次确定辽宁沈阳和盖州地区普遍发生的花叶南瓜上存在ZYMV，并基于CP核苷酸将ZYMV划分为5个基因型，其中,辽宁分离物属于Ⅲ型，而Ⅳ型基因是中国特有群体.目前，ZYMV中国分离物的基因分型均基于CP的系统进化分析[10,17,19-20]，如赵芹等[19]将ZYMV划分为7个基因型，而李继洋等[20]将ZYMV划分为4个基因型.更准确的基因型划分，将需要庞大的ZYMV分离物信息，因此，今后将继续对辽宁地区ZYMV病害进行系统调查和检测.【相关文献】[1] KING A M, ADAMS M J, LEFKOWITZ E J. Virus taxonomy: ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[R]. Amsterdam, Netherlands: Elsevier, 2012.[2] ARAZI T, SLUTSKY S G, SHIBOLETH Y M, et al. Engineering zucchini yellow mosaic potyvirus as a non-pathogenic vectorfor expression of heterologous proteins in cucurbits[J]. Journal of Biotechnology, 2001,87:67-82.[3] KWON S W, KIM M S, CHOI H S, et al. Biological characteristics and nucleotide sequences of three Korean isolates of Zucchini yellow mosaic virus[J]. Journal of General Plant Pathology, 2005,71:80-85.[4] ATREVA C D, RACCAH B, PIRONE T P. A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus[J]. Virology, 1990,178:161-165.[5] FERERES A, BLUA M J, PERRING T M. Retention and transmission characteristics of Zucchini yellow mosaic virus by Aphis gossypii and Myzus persicae (Homoptera: Aphididae)[J]. Journal of Economic Entomology, 1992,85(3):759-765.[6] GALON A. Zucchini yellow mosaic virus: insect transmission and pathogenicity —the tails of two proteins[J]. Molecular Plant Pathology, 2007,8(2):139.[7] KATIS N I, TAITSIPIS J A, LYKOURESSIS D P, et al. Transmission of Zucchini yellow mosaic virus by colonizing and non-colonizing aphids in Greece and new aphid species vectors of the virus[J]. Journal of Phytopathology, 2006,154:293-302.[8] 文朝慧,刘雅莉.甘肃省南瓜及西葫芦小西葫芦黄花叶病毒病鉴定[J].植物保护,2010,36(4):120-122.[9] 张大伟,范卫红,王杰,等.侵染西瓜的小西葫芦黄花叶病毒的生物学特性鉴定[J].植物保护学[10] 秦碧霞,郑红英,蔡健和,等.侵染广西罗汉果的小西葫芦黄花叶病毒的鉴定及抗血清制备[J].病毒学报,2005,21(2):468-473.[11] ZHAO M F, CHEN J, ZHENG H Y, et al. Molecular analysis of Zucchini yellow mosaic virus isolates from Hangzhou, China[J]. Journal of Phytopathology, 2003,151:307-311. [12] 卢彩鸽,李怀方,范在丰.侵染节瓜的小西葫芦黄花叶病毒的鉴定及其外壳蛋白基因的克隆[C]∥郭泽建，吴元华.中国植物病理学会2004年学术年会论文集.北京：中国农业科学技术出版社，2004:224-226.[13] 陈远超,朱春晖,孙书娥,等.湖南省葫芦科作物小西葫芦黄花叶病毒的检测[J].湖南农业科学,2014(7):62-65.[14] COUTTS B A, KEHOE M A, JONES R A C, et al. Minimising losses caused by Zucchini yellow mosaic virus in vegetable cucurbit crops in tropical, sub-tropical and Mediterranean environments through cultural methods and host resistance[J]. Virus Research, 2011,159(2):141-160.[15] SIMMONS H E, HOLMES E C, GILDOW F E, et al. Experimental verification of seed transmission of Zucchini yellow mosaic virus[J]. Plant Disease, 2011,95(6):751-754. [16] 张永江,李明福,相宁,等.小西葫芦黄花叶病毒北京分离物的鉴定及其基因组3′端特性分析[J].植物保护学报,2006,33(1):32-36.[17] 刘金亮,邵云华,张广民,等.小西葫芦黄花叶病毒山东南瓜分离物的分子特性[J].植物病理学报,2009,39(5):544-548.[18] 任春梅,程兆榜,杨柳,等.江苏省葫芦科作物6种病毒的多重RT-PCR方法及应用[J].江苏农业学报,2015,31(4):756-763.[19] 赵芹,谢大森,何晓明,等.广东地区冬瓜感染的小西葫芦黄花叶病毒检测及其外壳蛋白基因多样性分析[J].园艺学报,2016,43(1):151-160.[20] 李继洋,杨渡,韩盛,等.侵染新疆甜瓜的ZYMV衣壳蛋白基因克隆及其序列分析[J].农业生物技术学报,2016,24(5):718-728.[21] THOMPSON J D, GIBSON T J, PLEWNIAK F, et al. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research, 1997,25:4 876-4 882.[22] KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology & Evolution, 2016,33(7):1 870. [23] 姜华,房德纯,卫石泉.我国东北地区西瓜花叶病毒原种类鉴定[J].植物病理学报,1996,26(1):75-78.[24] 王芳,高正良,周本国.烟草PVYN辽宁分离物全序列测定与分析[J].中国烟草学报,2013，19(4):109-113.[25] QIN Y, ZHANG Z, QIAO Q, et al. Molecular varizbility of Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV) and five potyviruses infecting sweet potato in China[J]. Archives of virology,[26] 徐品三,孙冰轮,姜旭,等.百合斑驳病毒大连分离物基因组全序列测定及其分析[J].华北农学报,2013,28(s1):12-15.[27] 蔡明.辽宁省黄瓜绿斑驳花叶病毒发生现状、防控措施及成效[J].辽宁农业科学,2012(5):59-61.。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ｅ ＩＡ检 测表 明 ，Ｙ ＬＳ Ｚ ＭＶ在 田间 普遍 发 生 ， 究制 备 的 ＩＧ 可 用 于 Ｚ ＭＶ检 测 。 研 ｇ Ｙ 关 键 词 ： 西 葫 芦黄 花 叶病 毒 ； 核表 达 ； 血 清 制 备 ； Ｇ提 取 ； 小 原 抗 ｌ ｇ 间接 Ｅ ＩＡ ＬＳ 中 图分 类 号 ：４２ ４ ｓ３．ｌ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６ ２ ２ １ ） １— ０ ５— ４ １０ ９ ３ （００ ０ ０ ３ ０
ｓ ｂ ｅ ｕ ｎｌ ％ ～ ０ ｕ ｓｑ ｅ ｔ ５ ｙ ２ ％ ｇ ａ ｉｎ ＤＳ Ｐ ＧＥ．Ｔ ｅ ａ ｔ ｅ ｕ ａ ａｎ ｔｔｅ Ｃ ａ ｒ ｐ ｒ ｄ ｆ ｍ ｃ ｎ ｔ ｓ ｅ ｉ ｃ ｔ ａ ｏ ｆ ｍｅ ｒｄ ｅ ｔＳ — Ａ ｈ ｎ ｉ ｒ ｍ ｇ ｉ ｓ ｈ Ｐ ｗ ｓ ｐ ｅ ａ ｅ ｏ ｍｉｅ ａ ｄ ｉ ｐ ｃｆ ｉ ｗ ｓ ｃ ｎ ｒ ｄ ｓ ｒ ｓ ｉ ｙ ｉ
ｂ ｅ ｔｒ ｌｔａ ｌ ｓｓ Ｉ Ｇ ｇ ｉ ｓ ＹＭ Ｖ— ＣＰ ｓ ｐ ｒｆ ｄ ｂ ｍｍｏ ｕ ｓ ｌａｅ ｓ ｄｉ ｎ ａｉｎ ａ ｄ Ｐｒ ｔｉ Ｒｅ ｐｈ ｒ ｓ ｆ ｎｔ ｗａ ｕ ｉ ｅ ｙ ａ ｉ ｎｉｍ ｕｆ ｔ ｅ ｍｅ ｔ ｔｏ ｎ ｏｅｎ Ａ— ｄ Ｓｅ ａ ｏ ｅ ａｆ ｉｙ ｉ
小 西葫 芦 黄 花 叶病 毒 外 壳蛋 白抗体 制备
祁 伟 韦传 宝 杜 ， ， 宇
（．安徽 大学生命 科 学学 院 ， 肥 ２０３ ２ １ 合 ３０２； ．皖 西学 院化 学与生命科 学 系，六安 ２７ １ ） ３０２
摘 要： 根据 已报道的小西葫芦黄花叶病毒 （ Ｙ Ｚ ＭＶ） 列设计特异 引物 ， 序 扩增 Ｚ ＭＶ的全长外壳蛋 白（ Ｐ 基 因， Ｙ ｃ） 插
Ｐｒ ｋ ｒ ｏ ｉ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｏ ａ ｙ ｔｃ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆＺＹＭ Ｖ ｅ ｅ ＣＰ ｇ ｎ
ａ ｄ ｐ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ｏ ｈ ｎ ｉ ｏ ｙ ａ ａ ｎ ｔ ＣＰ ｎ ｒ ｐ ｒ ｔｏ ｆ ｔ ｅ ａ ｔｂ ｄ ｇ ｉ ｓ
Ｑ ｉ， Ｉ ｈ ａ —ａ Ｄ ｕ ｉ ＷＥ ｕ ｎｂ ｏ ， Ｕ Ｙ Ｗｅ Ｃ
Ａ ｓ ａｔ Ｓｅｉｃｐｉｅ ａ ｄｓ ｎｄｔ ａ ｐｉ Ｙ Ｖ ｃｍ ｌ ｅｃａ ｐｏ ｉ Ｃ ）ｇｎ．Ｔ ｅＣ ｅｅｗ ｓ ｈｎｉｓｒ ｄｉｏｐ — ｂｔ ｃ ： ｐｃ ｒ ｒ ｓ ｅｉ ｅ ｍ ｌｙＺ Ｍ ｏ ｐｅ ｏｔ ｒｔ ｎ（ Ｐ ｅｅ ｈ Ｐｇｎ ａ ｅ ｅ ｅ ｔ Ｓ ｒ ｉ ｆ ｍ ｗ ｇ ｏ ｆ ｔ ｅ ｔ ｎ ｔ ｎ
ｃ ｒ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ Ｔｈｅｖ ｌ ｆＩ Ｇ ｂ ｕ ： ８ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈ ． ａｕｅｏ ｇ ｗａｓａ ｏ ｔ１ ４ ００． Ｉ ｄｉｅ ｔＥＬＩ Ａ ｓ ｕ ｅ ｏｄｅｅ ｔｔ ｅ ｏ ｃ ｒｅ ｅ ｏ ｎ ｒ ｃ Ｓ ｗａ ｓ ｄ ｔ ｔｃ ｈ ｃ ｕ ｒ ｎｃ ｆＺＹＭ Ｖ ｎ ｓ ｍｅ Ｃｈｉｅ ｅ ｗａ ｉ ｏ ｎ ｓ — ｔｒ ｌｎ ａ ｄ ｍ ｕ ｋｍｅｏ ａ ｅ ｍｅｏ ｎ ｓ ｌｎ ｓ ｍｐｌｓ Ｉ ｓｉｄｉａｅ ｈ ｔｔ ｉ ｉｕｓｗｉ ｅｙ ｓ ｅ ｄ ａ ｏ ｅ ． ｔｗａ ｎ ｃ ｔｄ ｔ ａ ｈ ｓｖｒ ｄ ｌ ｐｒａ ｎｄ ｃ ｍｍｏ ｌ ｘ ｓｅ Ｔｈ ｇ ｐ ｅ ａ ｅ ｎ ｔ ｓｓｕ ｎ ｙ ｅ ｉｔｄ． ｅ ＩＧ ｒ ｐ ｒ ｄ ｉ ｈｉ ｔｄｙ
（ ．Ｓ ｈ ｏ ｏ ｉ ｃｅ ｃ ，Ａ ｈ ｉ ｎｖｒｉ １ ｃ ｏ ｌ ｆ ｆ Ｓ ｉｎ ｅ ｎ ｕ ｉｅｓｙ，Ｈ ｆｉ ３ ０ ２； Ｌｅ Ｕ ｔ ｅｅ ２ ０ ３
２ ｅ ａｔ ｎ ｆＣ ｅ ｓ ｙａ ｄ Ｂｏｏｙ ．Ｄ ｐ ｒ ｍｅ ｔ ｈ ｍｉ ｒ ｎ ｉｌｇ ，Ｗｅｔ ｎ ｕ ｎｖ ｒ ｔ ， ｉａ ３ ０ ｈｎ ） ｏ ｔ ｓ Ａ ｈ ｉ ｉｅｓ ｙ Ｌｕ ｎ２ ７ Ｕ ｉ １ ２，Ｃ ｉａ
入 原核表达载体 ｐ Ｂ Ｔ后在 大肠 杆 菌 Ｂ２１（ Ｅ ）ｐｙ Ｓ中诱 导表 达。通过 １ ％Ｓ ＳＰ Ｇ ＳＥ Ｉ Ｄ ３ ｌ ｓ ２ Ｄ —Ａ Ｅ和 ５ ～２ ％梯 度 ％ ０
Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ —Ａ Ｅ二 次制 备 电泳 纯 化 诱 导 产 物 ， 疫 小 鼠 ，获 得 经 过 Ｗｅｔ ｎｂｏ 分析 为特 异 的抗 Ｃ 免 ｓ ｒ ｌ ｅ ｔ Ｐ血 清 。硫 酸铵 沉淀 法
Ｂ Ｔ ｖ ｃ ｒ ｎ ｘ ｒｓｅ ｓ ｅｉ ｉ ｃｌ Ｂ２１（ Ｅ ）ｐｙ ｒｉ ｈ ｂｅ ｔ ｒｔ ｎｗ ｓ ｕ ｆ ｄｂ ２ Ｓ ＳＰ Ｇ ｒｔ ｎ Ｅ ｅ ｔ ｄｅ ｐ ｅｓｄｉ Ｅ ｃ ｒ ｈ ｏ Ｉ ｏａ ｎ ｈ ｃａ ｉ Ｄ ３ ｌ Ｓｓ ａ ．Ｔ ｅｏｊｃ ｐｏ ｉ ａ ｒ ｅ ｙ１ ％ Ｄ — Ａ Ｅｆ ｓ ｙａ ｄ ｓ ｔ ｎ ｅ ｐｉ ｉ ｉ ｌ
第２ ７卷第 １ 期
２１ ００年 ２月
生 物 学 杂 志
Ｊ ＵＲＮＡＬ ０Ｆ Ｂ ＯＬ ０ Ｉ ０ＧＹ
ｖ１ ７ ｏ１ ｏ ２ Ｎ． ．
Ｆｂ ２ １ ｅ， ００
ｄ ｉ１ ． ９ ９ ｊｉ ｎ １０ ｏ：０ ３ ６ ／．ｓ ． ０ ８—９ ３ ． ０ ０ ０ ． ３ ｓ ６２ ２ １． １０５