基因工程复习参考题

基因工程复习参考题
第二章
2．说明限制性核酸内切酶的类型及其特性。

3．说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤
原理：
在Mg2+存在时，用低浓度的DNA酶I（DNaseI）处理双链DNA，使之随机产生单链断裂，这时DNA聚合酶I的5′→3′外切酶活性盒聚合酶活性可以同时发生。

外切酶活性可以从断裂处的5′端除去一个核苷酸，而聚合酶则将一个单核苷酸添加到断裂处的3′端。

由于大肠杆菌DNA聚合酶I不能使断裂处的5′－P和3′—OH形成磷酸二酯键二连接，所以，随着反应的进行，即5′端核苷酸不断去除，而3′端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象就成为切口平移。

步骤：
①用大肠杆菌DNA酶I处理双链DNA，使之随机产生单链断裂
②DNA聚合酶I的5′→3′外切酶活性从断裂处的5′端除去一个核苷酸，同时5′→3′聚合酶活性将一个放射性核素标记的单核苷酸添加到断裂处的3′端。

③反应重复进行，标记的核苷酸取代了原来的核苷酸残基，形成放射性标记的DNA 分子。

8．在基因克隆中，如何防止载体分子的自身环化作用？
自身环化的产生原因：
当载体与外源DNA使用同一种限制性核酸内切酶消化，它们的连接产物有多种形式，包括载体与外源DNA连接形成的重组子和载体自身连接形成的载体分子，后者就是自身环化的载体，也称空载。

防止载体的自身环化作用：
在连接之前使用碱性磷酸酶处理，出去其5′末端的磷酸基团。

这样，即使载体DNA 分子的两个粘性末端发生退火互补，但却失去了连接能力，不能形成共价环化结构。

这种分子不稳定，在连接部位容易重新形成开环的线性分子，为载体接受外源DNA 提供条件。

当载体与外源DNA 退火，由于外源片断带有5′磷酸，连接酶能在其中一条链上的连接部位形成磷酸二酯键，产生每一条链上各有一个切口的“重组子”。

第三章
1．名词解释
基因工程载体——是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，其本质是DNA的复制子。

MCS——即多克隆位点（multiple cloning site），是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片断。

α筛选——在pUC质粒载体中，当无外源基因片断插入时，质粒表达α肽，它与宿主菌中的lac′ΔM15基因的产物互补，即α肽可与β－半乳糖苷酶的C端片断融为一体，形成具有酶学活性的β－半乳糖苷酶产生lacZ+表型，实现基因内互补，即α互补。

当多克隆位点中插入外源DNA片断时，α互补作用遭到破坏，在含有IPTG 和X－gal的平板上形成蓝色的菌落。

这样，可用组织化学法筛选重组子，这就是α筛选。

cos位点——λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过粘性末端配对形成双链环状的DNA 分子，这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点。

T-DNA——在细菌侵染细胞的过程中，细菌DNA转移至细胞后，被整合进细胞基因组并得以表达，从而导致某些性状的发生，这些DNA能够通过减数分裂传递给子代，这样的DNA叫做转移DNA，即T-DNA。

2．构建质粒载体的基本原则是什么？在构建质粒载体中主要做了哪些工作？
质粒载体构建原则：
在天然质粒的基础上，根据基因工程的需要，除去一些非必需元件，添加必需的元件，使其成为既带有多种强选择标记，又要具有低分子质量、高拷贝的理想载体，而且外源基因的插入不会影响复制的多种限制性核酸内切酶单一切割位点，它还必须具备复制必需区、选择性标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）3个组成部分。

构建时主要做了以下工作（以pBR322为例）：
①在菌体内将R1drd19的易位子Tn3（带有Amp r基因）易位到pMB1质粒上构成一个比较大的质粒pMB3。

②从质粒pSC101获得四环素抗性（Tet r）标记，用EcoR I*切割pSC101 和pMB8，将Tet r基因重组到pMB8上，形成pMB9。

③向pMB9中引入Amp r基因。

④从pBR313质粒上除去两个Pst I位点，形成具有Amp s Tet r表型的质粒pBR318；同时将pBR313质粒的EcoR II片断去掉，形成具有Amp r Tet s表型的质粒pBR320。

然后再将这两个都是来源于pBR313的派生质粒的酶切消化片断在体外重组，便产生出分子质量进一步缩小的pBR322质粒。

第六章
1．基因文库的定义是什么？
就是通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA 片断而构成的克隆集合体。

2．简述构建基因文库的目的和意义
目的：为防止用一种限制酶可能切断某个基因，所以应建立使用不同限制酶切割所建立的基因文库。

意义：在理想情况下，基因文库包含了某物种的全部遗传信息。

4．基因文库载体的选择原则是什么？
在选择基因文库载体的时候，应挑选容量大的载体，例如噬菌体载体、黏粒载体和人工酵母染色体载体等等。

因为一个完整的基因文库所需要的重组体数目是有基因的大小和载体的装载容量决定的。

能够插入载体中的DNA片段越大，完整文库所需重组体的数目越少，可减少筛选工作量。

8．合成cDNA第二链的主要策略有哪些？
①自身引导合成法：先用加热或碱处理的方法，将第一链合成过程中形成的cDNA－RNA杂合分子变性，降解RNA，以便单链cDNA的3′端自身环化，形成发夹结构。

然后在DNA聚合的作用下，以3′端发夹为引物，进行第二链的合成。

最后用单链特异的S1核酸酶消化双链cDNA中对应于mRNA 5′端的发夹结构，获得可供克隆的双链DNA分子。

②置换合成法：在焦磷酸钠存在的条件下合成cDNA的第一链，然后用RNA酶H处理cDNA－RNA杂合分子，使mRNA产生一系列缺口，并成为一系列引物，再在大肠杆菌DNA聚合酶 I作用下进行cDNA第二链的合成。

③PCR合成法：以cDNA的第一链为模板，设计并合成一组引物，通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA。

④快速扩增cDNA末端法：以mRNA为模板，经过反转录酶合成cDNA第一链，然后用PCR技术扩增出基因内特定位点到3′或5′端之间的核苷酸序列。

第七章
基因转移的方法及原理？
化学转化法：
原理1——在0℃的CaCl
2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl
2
使细胞膜磷
脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。

原理2——Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。

当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。

电击转化法：
将受体细胞置于一个适当的外加电场中，利用高压脉冲对细菌细胞的作用，使细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA得以进入细胞内，但细胞不会受到致命伤害，一旦脱离脉冲电场，微孔复原。

此时至于丰富培养基生长数小时后，细胞增殖，质粒复制。

第八章
1．什么是重组子筛选？主要有哪些方法？
重组子的筛选：经过各种方法将外源DNA导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程。

又称克隆子的筛选。

方法：
遗传学检测法——根据载体分子所提供的表形特征或根据插入基因遗传性状，选择重组体DNA分子的方法。

其中，根据载体表型特征的筛选法包括抗药性标记插入失活筛选法和β－半乳糖苷酶显色反应筛选法。

核酸分子杂交检测法——包括菌落印迹原位杂交法、斑点印迹杂交法、Southern印。