双歧杆菌脂磷壁酸延缓脾脏衰老的研究

・细菌学・双歧杆菌脂磷壁酸延缓脾脏衰老的研究付玉荣　王跃　刘明方　陈淑惠【摘要】　目的　研究双歧杆菌表面分子脂磷壁酸(LT A )在D 2半乳糖诱导的衰老小鼠体内,对脾脏指数和脾细胞DNA 损伤的影响。

方法　在建立D 2半乳糖诱导的衰老小鼠模型的同时,注射双歧杆菌LT A ;然后测定模型对照组、正常对照组、试验组小鼠的脾脏指数,并以单细胞凝胶电泳试验检测脾脏淋巴细胞DNA 氧化损伤的情况。

结果　与正常对照组相比,模型对照小鼠的脾脏指数显著升高(P <0.05),脾淋巴细胞DNA 受到了较严重的损伤(P <0.05);用双歧杆菌LT A 处理后,试验小鼠的脾脏指数明显下降(P <0.05),脾淋巴细胞DNA 的损伤程度显著降低(P <0.05)。

结论　双歧杆菌LT A 能显著抑制衰老小鼠脾脏淋巴细胞DNA 的氧化损伤,这可能与双歧杆菌抗衰老有关。

【关键词】　双歧杆菌;脂磷壁酸;衰老;脾脏Study on delaying senility of spleen by lipoteichoic acid of Bifidobacterium bifidum FU Yu 2rong ,WANG Yue ,LIU Ming 2fang ,CHEN Shu 2hui.Department o f Clinical Microbiology ,Chongqing Univer sity o f Medical Science ,Chongqing 400016,ChinaCorresponding author :WANG Yue ,Email :cqrx0439@【Abstract 】　Objective T o investigate the effect of lipoteichoic acid (LT A )of Bifidobacterium bifidum sur 2face m olecules on spleen index and DNA damage in spleen lym phocyte of aging mice induced by D 2galactose.Methods Male K unming mice were randomly divided into different groups.These mice were treated by subcutaneous injection of D 2galactose on the back for aging induction and LT A was simultaneously administered for 40days.S ingle cell gel electrophoresis was used for testing DNA oxidative damage.R esults There were significant differences for spleen in 2dex ,the appearance rate of comet and the length grade of DNA between the y oung control group and the aging m odel group (P <0.05).In the mice treated by LT A ,the changes were significantly inhibited as com pared with the aging m odel group (P <0.05).Conclusion LT A can decrease spleen index ,restrict DNA damage of spleen lym phocyte ,and s o it may be a m olecular mechanism to explain Bifidobacterium delaying senility.【K ey w ords 】　Bifidobacterium ;Lipoteichoic acid ;Senility ;S pleen作者单位:400016重庆医科大学临床微生物学教研室通讯作者:王跃,Email :cqrx0439@ ,电话:023********* 双歧杆菌作为人及动物肠道的正常生理菌,具有抗感染、抗肿瘤、抗辐射、免疫增强等多种生理功能,尤其与人体的衰老有着密切的关联。

但目前关于双歧杆菌抗衰老作用机制的基础研究报道甚少。

大量研究已证明,双歧杆菌LT A 是双歧杆菌发挥生理功能的一个最重要的表面分子之一,具有抗肿瘤、免疫赋活等多种作用,但LT A 是否参与抗衰老以及抗衰老的作用机制尚未见报道。

本实验采用D 2半乳糖衰老模型小鼠,连续注射双歧杆菌LT A ,观察其对小鼠脾脏指数、脾细胞DNA 损伤的影响,从而探讨其抗衰老的机理,为双歧杆菌制剂在人类抗衰老领域里的研究、应用、开发提供理论基础。

材料和方法实验动物:昆明系小鼠,雄性,6～8周龄,体重20±2g ,由重庆医科大学实验动物中心提供。

菌种:分叉双歧杆菌(Bif1101),本室保存,经中国科学院微生物研究所鉴定。

主要试剂:低熔点琼脂糖(LMA )、正常熔点琼脂糖(NMA )均为Sigma 公司进口分装。

LTA 的提取与纯化:按乐军等〔1〕报道的方法,从分叉双歧杆菌中提取。

实验分组及动物模型的制备:将小鼠随机分为3组。

D 组(模型对照组):每日一次定时项背部皮下注射D 2半乳糖0.15mg Πg 体重,同时腹腔注射无菌生理盐水0.3ml ;C 组(正常对照组):每日一次定时项背部皮下和腹腔同时注射与D 组等体积的无菌生理盐水;D +LT A 组(试验组):每日D 2半乳糖造模的同时,腹腔注射LT A 100μg 。

脾脏淋巴细胞的分离与处理:动物经连续40d 注射后称重,断颈处死,并迅速取出脾脏,用0.9%的生理盐水洗净残留血液后称重,然后将其研碎,用淋巴细胞分离液获得脾脏淋巴细胞,用P BS 调节细胞浓度为105个Πml ,4℃贮存备用。

单细胞凝胶电泳试验制片:将100μl1%的NMA滴在预冷的磨砂载玻片上,用盖玻片压平胶面,置4℃下固化10min,然后轻轻移开盖玻片,此为第一层胶。

取制备好的细胞悬液10μl在37℃下与90μl0.75%的LMA混匀后迅速铺在第一层胶上,用盖玻片压平胶面,置4℃下固化10min,然后轻轻移开盖玻片,此为第二层胶。

细胞的裂解:将已制好的载玻片水平浸没于新配制的裂解液(2.5m olΠL NaCl,100mm olΠL Na2E DT A, 10mm olΠL T ris2HCl,pH10,用前加入1%T ritonX2100和10%DMS O)中,4℃下裂解1h。

电泳:取出载玻片,用少量电泳液(300mm olΠL NaOH,1mm olΠL Na2E DT A,pH13)轻轻冲洗,置于装有预冷电泳液的电泳槽中,4℃下静置20min,使D N A 链充分松解,电压25V,电流200m A,4℃下电泳20in。

中和与染色:将载玻片取出,水平浸于中和液(0.4m olΠL T ris2HCl,pH7.5)中,中和强碱2次,每次15min,用20μgΠml的E B在暗处染色20min,然后用蒸馏水漂洗15m in,置4℃下避光潮湿保存,24h内阅片。

观察与计算:盖上盖玻片,将载玻片置于荧光显微镜下,采用紫外光激发观察核DNA和迁移的DNA 的荧光图像。

每张载玻片随机选择50个细胞,目镜测微尺测定核DNA和DNA的迁移长度,记录拖尾细胞的个数和拖尾细胞的尾长并照相。

统计学方法:实验数据用t检验和χ2检验处理。

结果11LTA对脾淋巴细胞的形态学影响:在荧光显微镜下,C组与D+LT A组小鼠脾脏淋巴细胞核大多数形态完整,呈圆形,细胞核染色体DNA未出现迁移(图1A);而D组细胞中多数细胞除呈现一个很亮的头部外,还有一段长短不一的彗星状尾巴,DNA结构破坏愈严重,迁移距离愈远,彗星的尾巴愈长(图1B、C、D)。

21LTA对脾脏指数的影响:结果见表1。

脾脏指数=脾重(mg)Π体重(g),衰老模型小鼠的脾脏指数大于正常对照小鼠(t=3.341,P<0.05),而注射双歧杆菌LT A,可显著降低脾脏指数(t=2.132,P< 0.05)。

31LTA对脾淋巴细胞拖尾的影响:结果见表2、3。

衰老模型小鼠拖尾细胞的百分率明显高于正常对照小鼠(χ2=16.7935,P<0.05),而试验小鼠拖尾细胞的百分率比衰老模型小鼠的显著降低(χ2= 10.371,P<0.05)(表2);对各组小鼠拖尾细胞尾长的分级统计按DNA迁移长度为标准:Ⅰ级,迁移25～35μm;Ⅱ级,35～45μm;Ⅲ级,45～55μm;Ⅳ级,> 55μm;衰老模型组小鼠拖尾细胞的尾长明显大于对照组(χ2=20.9888,P<0.05),而注射双歧杆菌LT A,可显著抑制淋巴细胞DNA的损伤(χ2=10.3521,P <0.05)(表3)。

图1　正常淋巴细胞核(A)与受损淋巴细胞核(B、C、D)形态(×200)Fig1.N orm al lymphocyte nucleus(A)and d am aged lym2 phocyte nucleus(B,C,D)(×200)表1　双歧杆菌LTA对脾指数的影响T able1.The effect of LTA on spleen indexG roups n S pleen index( x±s)D13 5.81±1.443C16 4.19±1.20D+LT A16 4.68±1.43△ 3P<0.05com pared with C group,△P<0.05com pared with D group表2　单细胞凝胶电泳拖尾细胞百分率T able2.The appearance rate of comet in SCGE testG roups n Percentage(%, x±s)D1347.54±11.963C1617.75±5.14D+LT A1625.94±7.76△ 3P<0.05com pared with C group,△P<0.05com pared with D group讨论D2半乳糖催老模型是较常用的人工致衰老模型,该模型具有复制方法简便、耗时短等优点。