亚低温对缺氧_复氧条件下星型胶质细胞AQP4表达的影响

文章编号：1003-2754（2011）08-0680-05亚低温对缺氧/复氧条件下星型胶质细胞AQP4表达的影响樊红彬，刘君，董瑞国收稿日期：2011-04-01；修订日期：2011-08-05作者单位：（徐州医学院附属医院神经内科，江苏徐州221002）通讯作者：董瑞国，Email ：DongRG ＜rg _dong@163．com 摘要：目的探讨亚低温对缺氧/复氧条件下星形胶质细胞（astrocytes ，AS ）AQP4表达变化的影响。

方法分离新生24h 内的SD 大鼠皮质，进行星形胶质细胞培养，分为正常对照组（C ）、常温缺氧/复氧组（H ）、亚低温干预缺氧/复氧组（M ）。

用台盼蓝染色法测定37ħ及32ħ时缺氧/复氧不同时间点AS 的存活率，对细胞进行形态学观察，应用细胞免疫化学技术检测缺氧/复氧各个时间点AQP4的表达水平。

结果（1）与对照组比较，常温组缺氧后4h 及8h 有少量细胞死亡（P ＜0．05），随着复氧时间延长死亡细胞数亦逐渐增多（P ＜0．01）；缺氧4h 及8h 时，亚低温组细胞死亡数与常温组比较无明显差异，从复氧4h 开始，亚低温组细胞死亡数明显少于常温组（P ＜0．05）。

（2）常温组缺氧4h 及8h 后，AQP4阳性表达细胞数减少（P ＜0．01），而复氧后AQP4阳性表达细胞数逐渐升高并随时间延长呈增高趋势（P ＜0．01）。

至复氧后8h ，亚低温组缺氧/复氧时AQP4阳性表达细胞数均较常温组减少（P ＜0．05）。

结论亚低温干预条件下，星形胶质细胞AQP4表达水平降低，可能是亚低温神经保护作用机制之一。

关键词：星形胶质细胞；AQP4；亚低温；缺氧/复氧中图分类号：R743文献标识码：AEffect of mild hypothermia on the aquaporin 4expressions in astrocytes under the condition of hypoxia /reoxygen-ationFAN Hong-bin ，LIU Jun ，DONG Rui-guo．（Department of Neurology ，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College ，Xuzhou 221002，China ）Abstract ：ObjectiveTo explore the effect of mild hypothermia on the AQP4expressions in astrocytes under thecondition of hypoxia /reoxygenation．MethodsThe primary and subculture cells from the cortex of SD fetal rat （less than24h ）were divided into three groups ：normal control group （C ），hypoxia /reoxygenation group （H ）and mild hypothermia hy-poxia /reoxygenation group （M ）．Trypan blue staining was used to detect the survival rate of astrocytes and changes of all the time points in hypoxia /reoxygenation ，inverted phase contrast microscope were used to observe the cells ，and immunocy-tochemistry was adopted to examine the expression changes of AQP4in the astrocytes at some indicated time points after hy-poxia /reoxygenation．ResultsCompared with controls ，hypoxia /reoxygenation group had fewer cell death after 4h and 8h ofhypoxia ，and the cell death increased gradually after reoxygenation．Compared with hypoxia /reoxygenation group ，the cell death of mild hypothermia hypoxia /reoxygenation group did not change significantly after 4h and 8h of hypoxia and de-creased significantly after 4h of reoxygenation．The expression of AQP4showed a tendency to decrease to normal contrast group after 8h of hypoxia in 37ħ，but increased after reoxygenation and showed a rising trend with time．Compared with hy-poxia /reoxygenation group ，mild hypothermia decreased the expression of AQP4from beginning of hypoxia to 8h after reoxy-genation．ConclusionUnder the mild hypothermia conditions ，astrocytes AQP4expression level is reduced ，and it may bethe one of the possible mechanisms of mild hypothermia neuroprotection．Key words ：Astrocytes ；AQP4；Mild hypothermia ；Hypoxia /reoxygenation脑水肿是缺血性脑血管病的一个重要病理过程，严重影响着预后，对脑水肿的形成机制及防治方法的研究具有重要意义。

水通道蛋白（aquaporin ，AQP ）是近年来发现的一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白，是影响水跨膜转运和细胞内外环境平衡调节的主要膜蛋白。

中枢神经系统中，AQP4主要在星形胶质细胞表达，AQP4被认为参与了脑水肿的发病机制［1］。

动物实验表明，亚低温（32ħ 35ħ）对脑缺血具有保护作用，其作用机制可能包括降低脑组织氧耗量、保护血脑屏障、减轻脑水肿、抑制内源性毒性产物对脑细胞的损害作用、减少钙离子内流、改变脑缺血后各种酶的活性、减轻缺血性神经元损伤、调节损伤后钙调蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶的活性、抑制神经元凋亡、抑制脑损伤缺血缺氧后的炎性反应等［2，3］。

本研究选择测定AS在缺血再灌注及亚低温干预时AQP4表达的改变，从离体角度研究亚低温对缺氧/复氧星形胶质细胞AQP4表达的影响，进一步从分子水平探明亚低温减轻缺氧性脑水肿的可能机制，为临床治疗脑水肿提供实验和理论依据。

1材料与方法1．1实验动物与试剂新生24h内SD大鼠（徐州医学院实验动物中心），H-DMEM培养基、L-DMEM培养基（Hyclone，USA），胎牛血清（Gbico，USA），胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic pro-tein，GFAP）小鼠抗大鼠多克隆抗体（Sigma，USA），兔来源AQP4多克隆抗体（一抗）（Santa Cruz，USA），羊抗小鼠、山羊抗兔二步法免疫组化试剂盒（二抗）（北京中山公司），即用型SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1．2方法1．2．1星形胶质细胞的体外培养和鉴定参照文献［4，5］创立的方法并加以改进。

新生24h内的SD大鼠，75%乙醇消毒，断头取脑，于冰冷的D-hanks液中剥除脑膜和血管；D-hanks液冲洗两遍后用弯眼科镊撕去蛛网膜及软脑膜。

在两侧大脑无血管区夹取少许皮质组织，用眼科剪剪碎脑组织成1mm3大小。

将混有脑组织碎块的基本培养液（100%H-DMEM）吸入到5ml离心管内，反复轻柔吹打制成细胞悬液，加入适量0．25%胰蛋白酶充分混匀后置37ħ恒温水浴箱内消化20min，中间摇晃1次；之后用完全培养液（20%小牛血清，80%H-DMEM）终止消化；再经200目筛网过滤，收集滤液于1500r/min离心10min，弃上清液后加入适量的完全培养液并吹打成单细胞悬液。

将此细胞悬液接种于装有完全培养液的玻璃培养瓶中，置37ħ，体积分数为5%CO2的饱和湿度的孵箱中培养。

差速贴壁2h后（去除成纤维细胞），将未贴壁细胞悬液进行镜下细胞计数（去除成纤维细胞）。

调整细胞密度为5ˑ105/cm2后接种铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，在倒置相差显微镜下对细胞进行观察，每隔3d 换液1次。

原代培养的细胞经过7 10d的生长，细胞基本铺满培养瓶底时，表明细胞生长已经进入平台期。

此时进行第1次传代，吸除培养瓶内旧的培养液，用基本培养液轻洗两次，用0．25%的胰蛋白酶消化，在相差显微镜下观察，当细胞出现胞质回缩、间隙扩大后即刻加入完全培养液终止消化，消化时间约25min。

用吸管轻轻吹打制成细胞悬液，参照原代培养的步骤，继续将细胞悬液离心、重悬，调整细胞密度为1ˑ105/cm2再次接种，每天在倒置相差显微镜下观察，并根据细胞的生长情况及液体颜色换液，大约每3 5d，进行下一次传代（方法及步骤同第1次传代）。

在细胞传至第3代后，将其接种于直径为3cm 的一次性无菌培养皿中（底部预先放置浸润过多聚赖氨酸的载玻片），继续培养3 5d。

待细胞生长至盖玻片面积的80%以上时，行星形胶质细胞鉴定及相关实验。

星形胶质细胞鉴定：用免疫细胞化学方法［6］对星形胶质细胞进行纯度鉴定。

取出细胞行常规固定、过氧化物酶阻断及血清封闭，加入一抗（1ʒ1000GFAP多克隆抗体），4ħ过夜，0．01mol/L PBS 漂洗后，加入生物素标记的二抗（羊抗小鼠1ʒ200），37ħ孵育30min，PBS漂洗后滴加酶偶合物（SABC）37ħ30min，PBS漂洗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片、镜检。

本实验培养的细胞中95%以上为反应阳性的星形胶质细胞，符合实验要求。